自下而上与鸟枪法蛋白质组学鉴定耳蜗全面蛋白质组

摘要

由于耳蜗感觉上皮组织体积微小，且膜蛋白难以分离和鉴定，对其进行蛋白质组分析具有较大挑战性。通过结合多种样品制备方法、分离技术以及高分辨率质谱分析，可实现对膜蛋白和可溶性蛋白的鉴定。

摘要

蛋白质组学是一种常用的方法，可为复杂生物系统提供深入见解。耳蜗感觉上皮含有将声音的机械能转化为外周和中枢神经系统处理的电化学能的感受器。目前已开发出多种蛋白质组学技术用于研究耳蜗内耳，例如二维差异凝胶电泳（2D-DIGE）、抗体微阵列和质谱（MS）。质谱是蛋白质组学中最全面且用途最广泛的工具，结合分离方法可对生物样本进行深入的蛋白质组分析。分离方法与质谱联用能够富集蛋白质样本，检测低分子量和疏水性蛋白质，并通过降低蛋白质组动态范围来鉴定低丰度蛋白质。可对全裂解液或分馏后的蛋白质裂解液采用不同的消化策略，以提高肽段和蛋白质序列的覆盖度。在质谱分析前，可应用不同的分离技术（包括强阳离子交换（SCX）、反相（RP）和凝胶洗脱液相分馏电泳（GELFrEE））来降低样本复杂性，从而实现蛋白质鉴定。

引言

蛋白质组学是通过分析蛋白质的表达、功能、修饰及相互作用来研究复杂生物系统的学科¹。已有多种方法被用于内耳的蛋白质组分析，包括抗体微阵列²、二维凝胶电泳^3-5和差异凝胶电泳（DIGE）⁶。然而，与在内耳中已鉴定出的超过10,000个基因和表达序列标签（ESTs）相比^11,12，已被识别和表征的蛋白质数量仍然有限^2,7-10。质谱（MS）是蛋白质组学中用于蛋白质表征最常用且最全面的技术。对复杂的蛋白质组样本（如耳蜗）进行分析具有挑战性。然而，将多种分离技术与质谱联用，可因提高动态浓度范围和峰容量而实现更多肽段和蛋白质的鉴定¹³。多维色谱通过采用不同的吸附机制，可降低高度复杂蛋白混合物的复杂性。目前常用的质谱蛋白质组分析方法主要有两种：鸟枪法（shotgun）和自下而上法（bottom-up）蛋白质组学。在鸟枪法蛋白质组学中，将完整的蛋白质混合物进行酶解消化，随后利用多维色谱进行分离，通常先采用强阳离子交换色谱（SCX），再进行反相液相色谱（RPLC）^14,15。分离后的肽段经串联质谱分析并进行数据库搜索¹⁵。该技术的主要优势在于单次分析即可鉴定数千种蛋白质，且更适用于膜蛋白的研究。

在自下而上的方法中，通常通过一维或二维电泳分离蛋白质混合物，然后将单个蛋白质条带或斑点切下，并用胰蛋白酶....

方案

伦理声明

使用小鼠组织的实验已获得南佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会（批准编号：3931R、3482R）的批准，该批准依据美国国立卫生研究院指南制定。

1. 蛋白质提取

1. 从16只30日龄（P30）的CBA/J小鼠中分离耳蜗感觉上皮组织，并于-80 °C保存。
2. 实验当天，用500 µl 1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤组织，1,000 × g离心3分钟，弃去上清液。重复洗涤共三次。
3. 将组织置于冰上，加入100 μl裂解缓冲液（含50 mM Tris-HCl，pH 8.0，120 mM NaCl，50 mM NaF，5 mM EDTA，500 μg/ml AEBSF，10 μg/ml亮抑酶肽，100 μg/ml胃蛋白酶抑制剂，2 μg/ml抑肽酶，0.5 μg/ml微囊藻毒素），使用超声破碎仪（Model 100；Thermo Fisher）超声处理30秒。每次超声后在冰上冷却1分钟，共重复超声3次。
4. 将裂解物在4 °C、750 × g条件下离心2分钟，将上清液转移至新的微量离心管中。向沉淀中加入50 μl裂解缓冲液，在冰上超声处理30秒进行再次提取。再次于4 °C、750 × g离心2分钟。合并两次获得的上清液，在4 °C、28,600 × g条件下离心60分钟。将上清液转移至新的微量离心管中，向沉淀中加入含0.1% ASB-14的20 μl裂....

结果

为了获得耳蜗感觉上皮最全面的蛋白质组，必须在蛋白质提取和样品制备前快速进行组织解剖。可采用两种蛋白质组学技术：shotgun 蛋白质组学和自下而上（bottom-up）蛋白质组学。为制备 shotgun 蛋白质组学样品，采用如图1所示的 FASP 消化法。FASP 方法可实现蛋白质浓缩、去除去垢剂，并利用多种酶对蛋白质进行消化。本研究采用了两种双重消化程序：第一种为先进行胰蛋白酶（trypsin）消化，随后再次使用胰蛋白酶进行第二次消化，将两次消化产物合并后，通过强阳离子交换（SCX）柱分离为18个组分，并进行纳米液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）分析。采用该实验方法进行单次 LC-MS/MS 运行时，在1%错误发现率（FDR）下共鉴定出1,485种蛋白质。在这些已鉴定的蛋白质中，分别有329种和258种被归类于线粒体和质膜（图2A）。第二种双重消化程序包括先使用赖氨酸肽内切酶（LysC）消化，再进行胰蛋白酶消化。每种消化产物分别独立上样，通过 SCX 柱分离为18个组分，并进行 nano LC-MS/MS 分析。LysC 与胰蛋白酶消化的结果在1% FD.......

讨论

从耳蜗感觉上皮中最大化蛋白质鉴定的关键步骤包括：1）使用多种内切蛋白酶进行消化，2）采用多种分离技术，3）利用高分辨率质谱仪。应用多种酶可增加肽段数量并提高蛋白质序列覆盖度，从而提升从耳蜗组织中鉴定出的蛋白质数量。胰蛋白酶是最常用的蛋白酶，能够高效且特异性地切割蛋白质，生成适合质谱电离和碎裂的肽段。然而，在胰蛋白酶消化之前使用另一种酶（如同样切割赖氨酸残基的LysC），可实现更高效的肽段切割。研究发现，与胰蛋白酶/胰蛋白酶消化相比，LysC/胰蛋白酶消化所产生的蛋白质序列覆盖度有所提高。

在质谱分析前采用多维分离方法，降低了 shotgun 蛋白质组学方法中耳蜗样本的高度复杂性。这使得能够鉴定出更多蛋白质，包括通常难以鉴定的膜蛋白。与自下而上（bottom-up）方法相比，shotgun 方法鉴定出的膜蛋白数量更多。然而，采用 GELFrEE 的自下而上方法能够鉴定出更多低丰度蛋白质，这归因于高丰度蛋白质（如来自耳蜗的 cochlin）被分离到各个组分中而得以富集。

本方案中采用高分辨率质谱仪（如LTQ-Orbitrap）所获.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8% Tris-乙酸胶条	蛋白质发现	42103
丙酮	Sigma-Aldrich	179124
乙腈	霍尼韦尔	015-1L
AEBSF	Calbiochem	101500
甲酸铵	Fisher Scientific	AC16861
抑肽酶	Calbiochem	616370
ASB-14	Calbiochem	182750-5GM
牛血清白蛋白	伯乐（BioRad）	500-0112
C18 柱	新目标	A25112	75 μm × 10 cm
DC蛋白质定量测定	伯乐（BioRad）	500-0116	微孔板检测实验方案
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
内肽酶 Lys-C	Sigma-Aldrich	P3428
FASP蛋白质消化试剂盒	蛋白质发现	44250
甲酸	Fluka	94318
GELFrEE 分离系统	蛋白质发现	42001	GELFrEE 8100
亮抑酶肽	Calbiochem	108975
MacroSpin 柱	The Nest Group	SMM SS18V	硅胶C18
微囊藻毒素	Calbiochem	475815
Pepstatin	Sigma-Aldrich	P5318
多磺乙基A柱	The Nest Group	202SE0503
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma-Aldrich	L3771
Sonic Dismembrator	赛默飞世尔科技	15-338-53	Model 100
胰蛋白酶	Sigma-Aldrich	T6567	蛋白质组学级