DNabT 细胞在外周 T 细胞中较为罕见；然而，它们在某些非淋巴组织中含量丰富。尽管 DN T 细胞的病理生理学意义日益受到重视，但由于难以从非淋巴组织中分离这些细胞，阻碍了对其功能的分析。本文介绍了一种从小鼠肾脏中分离高纯度 DN T 细胞的新型方案。
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摘要
摘要
目前尚无从非淋巴组织中分离双阴性T细胞（DN T细胞）的标准方案，尽管已有越来越多的报道表明其参与了多种免疫反应。DN T细胞是一类独特的免疫细胞，已被证实参与调控免疫反应、自身免疫反应以及对同种异体移植的耐受性1-6。然而，这类细胞在外周血和次级淋巴器官（如脾脏和淋巴结）中极为稀少，却在正常肾脏中大量存在。由于其在外周组织中数量稀少，目前对其病理生理功能知之甚少7。我们近期报道了在稳态及缺血再灌注损伤条件下，对肾脏中该细胞群体进行全面的表型与功能分析8。建立从肾脏中分离DN T细胞的实验方案，将极大促进对其功能的深入研究。
本文介绍一种新颖的实验方案，可从鼠类肾脏中分离出高纯度的αβ CD4+ CD8+ T细胞以及双阴性T细胞（DN T细胞）。简言之，我们使用胶原酶消化肾脏组织，并通过密度梯度离心法分离肾脏单个核细胞（KMNC）。随后进行两个步骤，将KMNC中造血来源的T细胞比例从3%富集至70%。第一步采用CD45+细胞分离试剂盒对造血细胞进行阳性筛选。第二步通过去除非目标细胞，实现DN T细胞的阴性分离，所用试剂包括抗CD4、抗CD8和抗MHC II类分子的单克隆抗体，以及CD1d α-半乳糖基神经酰胺（α-galcer）四聚体。该策略可获得纯度超过90%的DN T细胞群体。使用上述抗体进行表面染色，随后进行流式细胞术（FACs）分析，以确认细胞纯度。
引言
外周αβTCR+CD3+CD4-CD8-双阴性（DN）T细胞可分为多个亚群，各亚群具有不同的表型和功能1-4。DN T细胞目前尚不被充分理解，但在不同疾病模型中的病理生理免疫反应中正日益受到关注4-6。
DN T细胞是一种独特的免疫细胞类型，在调控多种免疫和自身免疫反应以及同种移植耐受性方面的作用日益受到关注4-6,9。这类细胞在外周血和次级淋巴器官（如脾脏和淋巴结）中较为罕见，但在正常的肾脏和肠道上皮组织中却是主要的常驻细胞10-12。目前对于DN T细胞在稳态条件下以及在急性肾损伤（AKI）等病理状态（如肾移植相关疾病）中的肾脏功能仍知之甚少7。
由于不同免疫细胞在调控免疫应答（包括同种异体应答）中具有复杂的作用，明确每种细胞的作用对于理解同种异体应答以及设计新的治疗方法至关重要。鉴于在生理状态及多种疾病条件下肾脏中存在大量双阴性T细胞（DN T细胞），这类细胞很可能在调控小鼠和人类的免疫及自身免疫应答中发挥关键作用，并在移植受者中的同种异体应答中起重要作用。尽管目前已有越来越多但尚显零散的证据表明，DN T细胞兼具致病性和免疫抑制性功能，但我们对其为何及如何表现出特定的有害或抑....
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方案
1. 仪器、培养基和试剂的准备
- 仪器：在无菌条件下准备试剂，并在超净工作台内操作。
- 准备 1 L RPMI 组织培养基，加入 5% 胎牛血清、2.1 g 碳酸氢盐、10 ml 100 倍谷氨酰胺、10 mg HEPES、1 mg 丙酮酸钠以及 10 ml 100 倍青霉素/链霉素。
注意：推荐使用的组织培养基 RPMI 可与 DMEM 互换使用。 - 制备 5% 胶原酶“D”溶液（将 5 ml 胶原酶“D”加入 9 ml 组织培养基中）。
- 配制三种不同浓度的 Percoll 溶液：100%、80% 和 40%。以下浓度按 1 个样本计算。将溶液置于室温保存。
- Percoll 溶液：加入 9 ml 未稀释的 Percoll（来自储存液）；加入 1 ml 10 倍 PBS。
- Percoll 溶液：加入 8 ml 100% Percoll；加入 2 ml 1 倍 PBS。
- Percoll 溶液：加入 4 ml 80% Percoll；加入 4 ml 1 倍 PBS。
- 配制 1 L 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：加入 5 ml 10% BSA（终浓度 0.1% BSA）、1 ml 10% 叠氮化钠（终浓度 0.1%）、2 ml EDTA 溶液，用 1 倍 PBS 定容至 1,000 ml。
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结果
野生型 C57BL/6 (B6) 肾脏每只含有约 1.5–2.1 × 106 个单个核细胞。其中约不到 10% 为造血来源的 CD45+ 细胞。为制备肾脏单个核细胞（KMNC），需将肾脏按 图1 所示切成小块，随后使用 5% 胶原酶进行消化处理。
随后进行密度梯度离心以收集 KMNC 层 (图 2，左图)。然后使用 CD45+ 磁性微珠对 KMNC 进行阳性筛选，操作如第 4 节（步骤 I）所述。将柱上结合的细胞洗脱后，通过流式细胞术（FACS）分析 CD45+ 细胞。流式细胞术分析显示，CD45+ 细胞的富集度可达约 80% 至 95% (图 2，中图)。在富集的造血 CD45+ 细胞中，约 40–60% 为 αβ TCR+ 细胞（数据未显示），约 30–60% 为 DN T 细胞 (图 2，右图)。
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讨论
由于DN T细胞被发现参与多种病理状况，如自身免疫性疾病、癌症、移植物耐受以及包括急性肾损伤（AKI）、肾小球肾炎在内的肾脏原发性疾病，目前对其的研究兴趣日益增加8,13因此，有必要更深入地了解和表征双阴性T细胞（DN T细胞）的病理生理功能。然而，目前对这些细胞功能的认识仍远不如对CD4和CD8 T细胞的了解。主要原因在于双阴性T细胞在次级淋巴器官中数量稀少，难以获取足够数量的细胞用于研究 体外 分析和过继转移实验。DN T细胞主要位于肾脏等非淋巴组织中8 但缺乏从实体器官中可靠分离这些细胞的方法，阻碍了对其功能的研究。因此，我们新建立的从肾脏分离DN T细胞的方案有望加速DN T细胞功能的研究。在Fas缺陷（lpr）或FasL缺陷（gld）小鼠中，DN T细胞大量积聚于淋巴结，可轻松从淋巴器官中分离获得 9,14,15，但从其他组织中分离这些细胞仍然是一项挑战。
根.......
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披露
作者无任何利益冲突可披露。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）项目（R21 AI095484）资助。感谢NHI四聚体核心实验室提供CD1d四聚体。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 层流罩 | Baker Company, Inc | 或同等设备 | |
| 离心机 | Beckman Coulter | 或同等设备 | |
| 血细胞计数板 | Electron Microscopy Sciences | 63514-11 | |
| 可控气氛培养箱 | Fisher Scientific | (37 °C，含5% CO2) | |
| 分析型流式细胞仪 | LSR II | ||
| RPMI 1640 | Media Tech | 10-040-CV | |
| 胶原酶D | Roche | 11088858001 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 胎牛血清 | Corning Cellgro | 35-011-CV | |
| 0.1% 叠氮化钠 (NaN3) | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 磷酸盐缓冲液 (PBS) | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
| PBS 10x | Mediatech | 46-013-CM | |
| EDTA缓冲液 | Sigma-Aldrich | E1161 | |
| LS柱 | MiltenyiBiotec | 130-042-401 | |
| CD45+ 微珠 | MiltenyiBiotec | 6.78E-51 | |
| 生物素标记微珠 | MiltenyiBiotec | 130-090-485 | |
| 抗CD45抗体（克隆：30-F11） PerCP | eBioscience | G1397 | |
| 抗CD45抗体（克隆：30-F11） APC-Cy7 | Biolegend | 103116 | |
| 抗TCR Pacific Blue （ab链，克隆：H57-597） | Invitrogen | HM3628 | |
| 抗CD4 PE | eBioscience | 12-0043 | |
| 抗CD8 FITC | eBioscience | 8011-0087 | |
| 生物素标记抗CD4抗体（GK1.5） | BD | 553728 | |
| 生物素标记抗CD8抗体 （克隆53-6.7） | BD | 553029 | |
| 生物素标记抗MHC II类分子抗体（I-A b） | BD | 553609 | |
| AutoMACS运行缓冲液 - MACS分离缓冲液 | Miltenyi I Biotec | 130-091-221 | |
| C57BL/6J小鼠 | Jackson Labs | 000664 | 肾脏 - 淋巴结 |
| 培养皿 | BD Biosciences | 356517 | |
| 70 μm滤膜 | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 推杆 | 或同等设备 | ||
| GeneMate 50 ml离心管 | Bioexpress | C-3394-3 | 或同等设备 |
| GeneMate 15 ml离心管 | Bioexpress | C-3394-1 | 或同等设备 |
| CD1d α-半乳糖神经酰胺四聚体 | NHI |
参考文献
- Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
- Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L.
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.
A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.
There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:
Samatha Bandapelle
instead of:
Samantha Bandapelle
