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方法文章

从肾脏中分离双阴性 αβ T 细胞

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DOI：

10.3791/51192

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2014年5月16日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

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摘要

DNabT 细胞在外周 T 细胞中较为罕见；然而，它们在某些非淋巴组织中含量丰富。尽管 DN T 细胞的病理生理学意义日益受到重视，但由于难以从非淋巴组织中分离这些细胞，阻碍了对其功能的分析。本文介绍了一种从小鼠肾脏中分离高纯度 DN T 细胞的新型方案。

摘要

目前尚无从非淋巴组织中分离双阴性T细胞（DN T细胞）的标准方案，尽管已有越来越多的报道表明其参与了多种免疫反应。DN T细胞是一类独特的免疫细胞，已被证实参与调控免疫反应、自身免疫反应以及对同种异体移植的耐受性1-6。然而，这类细胞在外周血和次级淋巴器官（如脾脏和淋巴结）中极为稀少，却在正常肾脏中大量存在。由于其在外周组织中数量稀少，目前对其病理生理功能知之甚少7。我们近期报道了在稳态及缺血再灌注损伤条件下，对肾脏中该细胞群体进行全面的表型与功能分析8。建立从肾脏中分离DN T细胞的实验方案，将极大促进对其功能的深入研究。

本文介绍一种新颖的实验方案，可从鼠类肾脏中分离出高纯度的αβ CD4+ CD8+ T细胞以及双阴性T细胞（DN T细胞）。简言之，我们使用胶原酶消化肾脏组织，并通过密度梯度离心法分离肾脏单个核细胞（KMNC）。随后进行两个步骤，将KMNC中造血来源的T细胞比例从3%富集至70%。第一步采用CD45+细胞分离试剂盒对造血细胞进行阳性筛选。第二步通过去除非目标细胞，实现DN T细胞的阴性分离，所用试剂包括抗CD4、抗CD8和抗MHC II类分子的单克隆抗体，以及CD1d α-半乳糖基神经酰胺（α-galcer）四聚体。该策略可获得纯度超过90%的DN T细胞群体。使用上述抗体进行表面染色，随后进行流式细胞术（FACs）分析，以确认细胞纯度。

引言

外周αβTCR+CD3+CD4-CD8-双阴性（DN）T细胞可分为多个亚群，各亚群具有不同的表型和功能1-4。DN T细胞目前尚不被充分理解，但在不同疾病模型中的病理生理免疫反应中正日益受到关注4-6。

DN T细胞是一种独特的免疫细胞类型，在调控多种免疫和自身免疫反应以及同种移植耐受性方面的作用日益受到关注4-6,9。这类细胞在外周血和次级淋巴器官（如脾脏和淋巴结）中较为罕见，但在正常的肾脏和肠道上皮组织中却是主要的常驻细胞10-12。目前对于DN T细胞在稳态条件下以及在急性肾损伤（AKI）等病理状态（如肾移植相关疾病）中的肾脏功能仍知之甚少7。

由于不同免疫细胞在调控免疫应答（包括同种异体应答）中具有复杂的作用，明确每种细胞的作用对于理解同种异体应答以及设计新的治疗方法至关重要。鉴于在生理状态及多种疾病条件下肾脏中存在大量双阴性T细胞（DN T细胞），这类细胞很可能在调控小鼠和人类的免疫及自身免疫应答中发挥关键作用，并在移植受者中的同种异体应答中起重要作用。尽管目前已有越来越多但尚显零散的证据表明，DN T细胞兼具致病性和免疫抑制性功能，但我们对其为何及如何表现出特定的有害或抑制性功能，以及微环境如何影响其功能，仍知之甚少。

由于它们在肾脏中含量较低，因此需要改进分离方法。

目前尚无从非淋巴组织中分离双阴性T细胞（DN T细胞）的标准方案。本方案描述了一种从肾脏分离DN T细胞的新型方法；然而，该方法也可适用于多种非淋巴组织。

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方案

1. 仪器、培养基和试剂的准备

  1. 仪器：在无菌条件下准备试剂，并在超净工作台内操作。
  2. 准备 1 L RPMI 组织培养基，加入 5% 胎牛血清、2.1 g 碳酸氢盐、10 ml 100 倍谷氨酰胺、10 mg HEPES、1 mg 丙酮酸钠以及 10 ml 100 倍青霉素/链霉素。
    注意：推荐使用的组织培养基 RPMI 可与 DMEM 互换使用。
  3. 制备 5% 胶原酶“D”溶液（将 5 ml 胶原酶“D”加入 9 ml 组织培养基中）。
  4. 配制三种不同浓度的 Percoll 溶液：100%、80% 和 40%。以下浓度按 1 个样本计算。将溶液置于室温保存。
    1. Percoll 溶液：加入 9 ml 未稀释的 Percoll（来自储存液）；加入 1 ml 10 倍 PBS。
    2. Percoll 溶液：加入 8 ml 100% Percoll；加入 2 ml 1 倍 PBS。
    3. Percoll 溶液：加入 4 ml 80% Percoll；加入 4 ml 1 倍 PBS。
  5. 配制 1 L 荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液：加入 5 ml 10% BSA（终浓度 0.1% BSA）、1 ml 10% 叠氮化钠（终浓度 0.1%）、2 ml EDTA 溶液，用 1 倍 PBS 定容至 1,000 ml。

2. 肾脏消化的制备

  1. 在获得必要的机构批准后，按照现行法规和动物护理指南，采用标准方法处死小鼠并放血。
    1. 用戊巴比妥钠（0.07 mg/kg）对小鼠进行麻醉。
    2. 进行放血操作。
    3. 将小鼠仰卧位固定于手术台上。
    4. 用70%乙醇喷洒腹部区域。
  2. 向培养皿中加入10 ml胶原酶D溶液。
  3. 从每只小鼠体内取出双侧肾脏并去包膜。
    1. 从胸骨至耻骨沿中线切开腹壁皮肤和腹膜，以打开腹腔。
    2. 将肠管向侧方移开，暴露左肾。
    3. 用镊子仔细分离左侧囊膜。
      注意：肾包膜呈透明层状，环绕肾脏，部分被肾周脂肪组织覆盖。
    4. 使用手术剪剪断肾蒂血管，切除左侧肾脏。
    5. 对右肾重复相同的步骤。
      注意：右肾位置更靠 cranial 且更接近中线（肾蒂较短）。
  4. 将肾脏放入培养皿中。
  5. 使用普通金属切割刀片将肾组织切成小块（尺寸为1-2 mm），并将组织块放入胶原酶溶液中，在37 °C培养箱中孵育30-45分钟（图1).

3. 从肾脏消化物中制备肾脏单个核细胞（KMNC）

  1. 通过使用70 µm细胞筛对组织进行机械性解离，获得肾脏消化后的细胞悬液，并将其重悬于25 ml组织培养基中并混匀。
  2. 在4 °C条件下，以400 × g离心10分钟，使细胞沉淀。
  3. 将沉淀物重悬于4 ml 40% Percoll溶液中，然后用塑料移液管缓慢而小心地将其轻轻覆盖于4 ml 80% Percoll溶液上。此操作将形成两相，中间由一层半透明界面清晰分隔，上层为对应脂质的黄色层。
  4. 在室温下以1,500 × g离心30分钟，离心机设置为无刹车模式。
  5. 通过抽吸方式去除上层黄色且黏稠的液体（约1–2 ml）。
  6. 仅用移液管收集两相界面处略带白色半透明的界面层，小心地将此悬液转移至含有2 ml组织培养基的15 ml锥形管中，随后加入13 ml培养基，使总体积达到15 ml。
  7. 在4 °C条件下，以400 × g离心10分钟。
  8. 将样品重悬于1 ml培养基中。
  9. 使用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数KMNC数量，并以每毫升每肾脏的KMNC数量表示结果。
  10. 按上述方法洗涤一次。

4. 从 KMNC 中分离造血细胞（CD45+）（步骤 I）

  1. 将细胞重悬于90 µl运行缓冲液中，细胞数量最多可达107。
  2. 加入10 µl CD45磁珠，4 °C孵育15分钟。
  3. 加入1 ml运行缓冲液以终止反应。在4 °C下以400 × g离心10分钟，并将沉淀重悬于500 µl运行缓冲液中。
  4. 将磁性分离柱置于磁铁上，用3 ml运行缓冲液冲洗，以进行准备。
  5. 将细胞悬液通过磁性分离柱，收集未标记的穿柱细胞。
  6. 用3 ml运行缓冲液洗涤细胞三次，然后收集流出液。
  7. 从磁性分离装置上取下分离柱，用移液器加入5 ml运行缓冲液至柱上，立即冲洗出标记的细胞组分。此组分为CD45+细胞。对细胞进行计数。
  8. 为计算肾脏中不同T细胞亚群的绝对数量，将肾单个核细胞（KMNC）总数乘以流式细胞术测定的阳性细胞百分比（图2）。

5. 通过阴性选择法从 CD45+ 制备物中分离 DN T 细胞（第二步）

  1. 加入以下每种生物素标记抗体各 2.5 µl（0.5 mg/ml，1.25 µg）：抗-CD4、抗-CD8、抗-Fc 受体（CD16/32）、抗-MHC II 类分子（I-A b）、抗-CD1d PBS-57 四聚体，每 107 造血细胞
  2. 在低温室中孵育细胞 30 分钟。
  3. 加入1 ml抗生物素微珠。
  4. 在低温室中孵育30分钟。
  5. 将试管置于磁铁中，进行去除非目标细胞。
  6. 使用血细胞计数板对活细胞进行计数，以确定阴性组分中DN T细胞的总数。
  7. 通过流式细胞术按照以下设门策略检测DN T细胞纯度：首先设门CD45+，其次设门TCRαβ+，排除CD1d+细胞，绘制CD4+与CD8+的点图以鉴定DN T细胞（双阴性T细胞）图3).
  8. 将总数乘以纯度测定的百分比。
    注意：使用本方案可获得纯度超过90%的DN T细胞群体。

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结果

野生型 C57BL/6 (B6) 肾脏每只含有约 1.5–2.1 × 106 个单个核细胞。其中约不到 10% 为造血来源的 CD45+ 细胞。为制备肾脏单个核细胞（KMNC），需将肾脏按 图1 所示切成小块，随后使用 5% 胶原酶进行消化处理。

随后进行密度梯度离心以收集 KMNC 层 (图 2，左图)。然后使用 CD45+ 磁性微珠对 KMNC 进行阳性筛选，操作如第 4 节（步骤 I）所述。将柱上结合的细胞洗脱后，通过流式细胞术（FACS）分析 CD45+ 细胞。流式细胞术分析显示，CD45+ 细胞的富集度可达约 80% 至 95% (图 2，中图)。在富集的造血 CD45+ 细胞中，约 40–60% 为 αβ TCR+ 细胞（数据未显示），约 30–60% 为 DN T 细胞 (图 2，右图)。

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讨论

由于DN T细胞被发现参与多种病理状况，如自身免疫性疾病、癌症、移植物耐受以及包括急性肾损伤（AKI）、肾小球肾炎在内的肾脏原发性疾病，目前对其的研究兴趣日益增加8,13因此，有必要更深入地了解和表征双阴性T细胞（DN T细胞）的病理生理功能。然而，目前对这些细胞功能的认识仍远不如对CD4和CD8 T细胞的了解。主要原因在于双阴性T细胞在次级淋巴器官中数量稀少，难以获取足够数量的细胞用于研究 体外 分析和过继转移实验。DN T细胞主要位于肾脏等非淋巴组织中8 但缺乏从实体器官中可靠分离这些细胞的方法，阻碍了对其功能的研究。因此，我们新建立的从肾脏分离DN T细胞的方案有望加速DN T细胞功能的研究。在Fas缺陷（lpr）或FasL缺陷（gld）小鼠中，DN T细胞大量积聚于淋巴结，可轻松从淋巴器官中分离获得 9,14,15，但从其他组织中分离这些细胞仍然是一项挑战。

根...

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披露

作者无任何利益冲突可披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（NIH）项目（R21 AI095484）资助。感谢NHI四聚体核心实验室提供CD1d四聚体。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
层流罩 Baker Company, Inc或同等设备 
离心机Beckman Coulter或同等设备 
血细胞计数板Electron Microscopy Sciences63514-11
可控气氛培养箱Fisher Scientific (37 °C，含5% CO2)
分析型流式细胞仪LSR II
RPMI 1640Media Tech10-040-CV
胶原酶DRoche11088858001
Percoll GE Healthcare17-0891-01
胎牛血清 Corning Cellgro35-011-CV
0.1% 叠氮化钠 (NaN3)Sigma-AldrichS2002
磷酸盐缓冲液 (PBS)Corning Cellgro21-040-CV
PBS 10xMediatech46-013-CM
EDTA缓冲液 Sigma-AldrichE1161
LS柱  MiltenyiBiotec130-042-401
CD45+ 微珠 MiltenyiBiotec6.78E-51
生物素标记微珠  MiltenyiBiotec130-090-485
抗CD45抗体（克隆：30-F11）  PerCP eBioscienceG1397
抗CD45抗体（克隆：30-F11）  APC-Cy7Biolegend103116
抗TCR Pacific Blue （ab链，克隆：H57-597）InvitrogenHM3628
抗CD4 PEeBioscience12-0043
抗CD8 FITCeBioscience8011-0087
生物素标记抗CD4抗体（GK1.5）BD553728
生物素标记抗CD8抗体 （克隆53-6.7）BD553029
生物素标记抗MHC II类分子抗体（I-A b）BD553609
AutoMACS运行缓冲液 - MACS分离缓冲液  Miltenyi I Biotec130-091-221
C57BL/6J小鼠Jackson Labs000664肾脏 - 淋巴结
培养皿 BD Biosciences356517
70 μm滤膜 Fisher Scientific22363548
推杆 或同等设备 
GeneMate 50 ml离心管BioexpressC-3394-3或同等设备 
GeneMate 15 ml离心管BioexpressC-3394-1或同等设备 
CD1d α-半乳糖神经酰胺四聚体NHI

参考文献

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勘误


Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 2/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

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肾脏单个核细胞胶原酶消化密度梯度离心CD45阳性筛选阴性筛选流式细胞术分析磁珠分离造血细胞富集小鼠肾脏分离
从肾脏中分离双阴性 αβ T 细胞
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