中G3BP应力颗粒动力学在Live原代细胞可视化

应力颗粒剂（SGS）是形成为对环境胁迫，如升高的温度下，氧化应激，缺氧，渗透压休克，紫外线照射，葡萄糖剥夺，或病毒感染¹的蜂窝式保护性反应的非膜质细胞质灶。它们可以化学诱导治疗与像亚砷酸钠，触发氧化应激的化合物。超导重力积累停滞翻译被捕信使核糖核蛋白（mRNPs）配合物²中，从机械翻译的mRNA螯合剂，和它们的组件可以通过eIF2α蛋白的磷酸化（真核起始因子2α）来触发。超导重力仪是它与核糖体和其他颗粒，如P小体交换组件的动态结构。它们构成了一个"分流中心"，其中的mRNA进行分类和处理要么翻译，再引发，降低或包装成稳定的非多核糖体mRNPs ^3。超导重力仪的组装速度快bUT它是一个渐进的过程，最初众多的小聚集体，其凝聚成较大的颗粒。使用该中断或稳定微管的化学抑制剂表明，微管网络是必需的法国兴业动态，包括组装，聚结和拆卸过程。

超导重力的动态组件也促进特定RNA结合蛋白（RNA-BP），如TIA-1（T细胞内抗原-1）和聚集TIAR（TIA-1相关蛋白），其能够二聚化促进多聚核糖体拆卸和mRNA的路由到的SG ^4。 G3BP（RasGAP SH3结构域结合蛋白）是这样的RNA-BP的本地化的SGS当细胞被强调用砷或高的温度，并去磷酸化G3BP的过表达可诱导的SG组件^5。

G3BP是一个进化上保守的RNA-BP，最初表征通过其与一个RAS-GTP酶激活蛋白相互作用（RasGAP p120 ^6）;但此相互作用是最近重新^7。该G3BP家族包括哺乳动物中两个成员，G3BP1（简称G3BP）和G3BP2 ^8。这两个蛋白共定位于SGS，当细胞受到应力^9。典型的RNA识别基序（RRM）与保守RNP1和RNP2基序:G3BPs包括一个N-末端结构域NTF2建议以影响其定位和低聚，接着富含脯氨酸（PxxP基）基序，则C-末端基序与RNA结合相关，其次是精氨酸 - 甘氨酸丰富（RGG）框。有趣的是，通过构建融合到EGFP的不同结构域的蛋白质的不同部分的分析表明，NTF2样结构域和RNA结合结构域是最有效地募集到的SG，表明二聚化的性质的重要性和RNA的结合超导重力仪的组装。多样化的车型已经在体外 ^10-13透露G3BP蛋白的不同功能。G3BP在小鼠干扰已经表明这种蛋白在发育的生长和存活^14，以及用于G3BP在中枢神经系统（CNS），在空间工作记忆¹⁵特征在于，共济失调和缺陷中起重要作用的重要性。 G3BP缺乏导致改变神经元的可塑性和钙稳态，建立SG的形成和神经退行性疾病¹⁵之间的直接联系。能够学习的SG的动力学在初级细胞如神经元因此，这是很重要的。

该协议提供了一种简单的方法来观察下砷治疗的原代细胞含G3BP1-SGS的组装。它可以被用来研究的SG组件在不同条件下，例如不同类型的应力。它也可以适用于其它颗粒的SG的或其他成分。事实上，这个协议的重点G3BP1，但也有其他应力的颗粒标记物像TIA-1 / ^{R，TTP（tristetraprolin）2，}FMRP（脆性X智力低下综合征蛋白^{）16，TDP-43（}有中介的响应DNA结合蛋白^43），17或¹⁸诗道芬。特别是，像TIA-1 / R蛋白是一样G3BP，成核RNA结合蛋白，可诱导的SG组件过度表达时，即使不同形成的SG可以在功能，调节和相关的转录物不同。的任意这些关键部件或成核剂的SG的荧光团标记的版本转染可以执行图像特定的SG组件和动态。

在这个协议的所有动物的程序都在严格遵守与1986年11月24日（86-609/EEC）的欧共体理事会指令的指引。房子的小鼠组，从而允许食物和水随意 。他们保持在受控环境中（22±1℃，55±5％相对湿度）与12小时:12小时光照:黑暗周期（灯亮在7:00上午）。

1小鼠原代细胞培养:小鼠胚胎成纤维细胞（MEF中）

1. 高压灭菌镊子薄，以及弯曲镊子和解剖剪刀。存放在无菌容器中。使用无菌的D-PBS（Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水）。准备完整的MEF培养基:Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/ F12补充10％胎牛血清（FBS），1 mM的L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，1％非必需氨基酸，和0.5mM 2 - 巯基乙醇并在37°C温暖
2. 安乐死怀孕小鼠（13.5天后coïtum（DPC）），通过颈脱位。从小鼠消毒用90％EtOH中取出子宫角。在无菌和清洁油烟机，将喇叭与胚胎在37℃预热的D-PBS。打开喇叭，地点 在100毫米无菌塑料培养皿的胚胎，从脐带材料清除它们，并用温水D-PBS冲洗，以去除血液中多余的。下一个双目，取出胚胎的四肢，内脏和 包含脑头的上部。
3. 在一个新的培养皿中，将剁碎 胚胎成非常小的碎片，用无菌手术 刀片 或剪刀（至少为1分钟）。在不同基因型的胚胎的情况下，小心把每个胚胎在个别培养皿中，并保持尾部或头部上进行基因分型。
4. 覆盖胚胎用1X胰蛋白酶-EDTA（0.25％胰蛋白酶，1mM EDTA）中。孵育30分钟至1小时在37℃的培养箱中培养。加入10毫升完整的MEF培养基停止胰蛋白酶反应。吸管上下删除所有聚集。让坐着的细胞悬浮液置于50ml试管（填充有完全培养基）中10分钟，并离心上清为5分钟，在300×g离心室温。重悬沉淀完全培养基（6毫升1胚胎）。可行的有核细胞可使用台盼计算 蓝色 （约5×10 ⁶细胞可以从一个胚胎预期）。板3毫升每60毫米培养皿。
5. 第二天改变介质和 使细胞生长 直到菜都汇合。许多 细胞类型中可以看出， 但只有成纤维细胞才能生存的亚文化。
6. 分裂细胞，让他们在35mm培养皿生长与玻璃底（时间推移实验很重要），直到50-70％融合的转染。 测试支原体和鼠标的病原体。

2，文化中的一种在神经元的案例daptations

1. 在培养的前一天，外套35毫米玻璃底培养皿用聚-L-赖氨酸（200微升的0.1毫克/毫升）在无菌和洁净罩，并留下过夜。
2. 第二天早晨，冲洗用无菌纯净水，5分钟两次，一次是45分钟至1小时。更换用2毫升的DMEM加10％FBS培养基中，并保持在37℃培养箱中培养。
3. 解剖胚胎在18.5 DPC。在无菌和清洁油烟机，将喇叭与胚胎冷无菌HBSS（Hank平衡盐溶液）以100毫米的培养皿。新生的幼崽，也可用于代替胚胎，以保持大坝的寿命，使其能够产生更多的后代，尤其是在转基因动物可以是难以获得的情况下。在个别培养皿，采取每个胚胎或新生儿和切头剪。握住头部插入弯钳入眼睛，切开皮肤，小心打开从后面的头骨软头部，直到眼睛，在头部的每一侧。切断视神经及脑干，取出大脑，并把它放在含有HBSS一个新的培养皿。下一个立体镜，删除所有使用两根细镊子脑膜。分离海马，皮质或大脑取决于研究该结构的任何其它部分。
4. 4.5毫升冷的HBSS浸入大脑解剖结构在15ml试管预先准备并保持在冰上，直到用胰蛋白酶消化。加入0.5毫升2.5％的胰蛋白酶和孵育在37℃下进行15分钟至20分钟。冲洗3次胰蛋白酶用HBSS，是非常小心，不要丢弃消化大脑部位。
5. 重悬在500微升（海马）至1ml（皮层）的DMEM加10％FBS和吸管上下数次1毫升微量装有1毫升尖，然后装有用1ml加200μl的提示，直到有没有明显的聚集。
6. 散布100-200微升细胞悬液至35毫米的玻璃博特米菜的DMEM加10％FBS和让神经元坚持在37℃至少3小时。通过预热神经元完全培养基更换（Neurobasal培养基补充有250μML-谷氨酰胺和NS21，如在Chen 等人 ¹⁹所述制备），并在37℃下离开以允许神经元生长。转染的神经元在5〜14天在体外 （DIV）（转染效率更高经过几个div，不过突触连接的是从7-10格更好地确立）。

的EGFP-G3BP1构造3。转染

转染的细胞用含有您感兴趣的蛋白的基因（SGS的任何成分）稠合到荧光标记（GFP，YFP，等）的载体，用3微克纯化的质粒的每35mm培养皿。

1. 使用市售的转染方法的MEFs中，按照制造商的方案（见表原料/试剂的）。
2. 转染的神经元与钙磷酸盐的方法改编自Xia 等 ²⁰简要:
   1. 准备解决方案:DMEM洗:含25毫米氯化钾的DMEM;转染溶液:DMEM洗含有1x DMKY（HEPES 5毫米， _氯化镁 10毫米，酚红）;和冲击的解决方案:HEBS 1X，1X DMKY和DMSO 2％（V / V）;并保持在37°C。
   2. 从神经元，滤液取出介质，并保持在37°C。用DMEM洗洗脸然后更换转染培养基和磷酸钙质粒DNA沉淀物的制备过程中保持在37℃。
   3. 在1.5 ml离心管中，加入（按照这个顺序）百灵水（终体积50微升），5微升_氯化钙 2.5 m和3微克质粒DNA。放弃这一组合到50微升HEBS 2倍的圆底聚丙烯管已经出台。通过转动沿与滴下混合管。在30分钟期间让沉淀物的形式在室温下进行。
   4. 添加precipitatË滴加到神经元，并在37℃时30〜50分钟离开。
   5. 更换1分钟冲击溶液，然后用DMEM洗，最后重新引入预处理介质。保持所述细胞在37℃下

G3BP 4。含可视超导重力大会和动态

1. 更换细胞培养基含有酚红酚红的培养基。
2. 利用共聚焦显微镜配有荧光的收购。打开显微镜系统:汞灯，计算机，激光器。热身室至37℃至少20分钟前收购的开始。
3. G3BP的过表达诱导型超导重力的自发形成。这些细胞可能因此无应力诱导转染后可观察到的超导重力仪24小时正确装配。另外，压力可诱发进一步诱发超导重力仪的组装。添加0.5 mM的亚砷酸钠和明星加入化合物（颗粒会在1小时内得到很好的形成）后右T的收购。
4. 添加到油中浸没物镜（使用40X或63X的目标），并在适于35毫米显微镜支架安装在培养皿在客观的，稳定的阶段保持器。检查盘是平的，否则收购将被改变。根据相关的荧光打开的荧光光以及可视化的转染细胞。关闭荧光曾经感兴趣的细胞是在现场以尽量减少漂白和细胞毒性。
5. 在"获取标签"，请根据所标记荧光基团（在我们的协议，使用绿色荧光蛋白标记的G3BP 488纳米）的激发波长的激光器和选择的PMT的适应发射长度（光电倍增管）。调整激光功率（通常不超过10％），以减少噪声和过饱和以及毒性，并设置增益和偏移修改的信号噪声比。扫描速度快（1000赫兹），以尽量减少激光博览会的持续时间（平均线2，帧平均1）。如果需要的话，设置参数的Z堆叠能够重建三维图像（1微米为Z步骤通常是细带细胞）。确定每个采集间隔时间:较小的间隔允许获得更加相干的影片，但是这可能导致光漂白性和毒性（20秒的时间间隔是在所描述的实验中使用）。总采集的持续时间可取决于应力类型而有所不同。许多含G3BP-SGS是根据砷处理形成非常迅速，而且是1小时的治疗后也可见:在这种情况下，选择快速细胞应激后立即拍摄并开始收购，以收购15的总持续时间 - 20分钟很大程度上足以观察几个超导重力仪的组装。
6. 保存图片和重建使用ImageJ软件堆栈和电影。

应力颗粒的形成是重要的细胞对应激的反应，允许一个细胞适应与停滞翻译，直到压力已被清除，相关的预防凋亡。此法允许以研究在原代细胞的SGS，通过以下关键蛋白质的SG部件国产化（ 图1）。 G3BP，SGS组件的一个重要因素，是存在而漫射在MEF中培养的或神经元（ 图2A中a和 c）的细胞质中，并且显然存在于离散的颗粒下在MEF中砷治疗以及神经元（ 图2A b和D）。主细胞可以从转基因小鼠模型来获得，例如允许应力颗粒在没有它们的组分之一的研究。有趣的是，G3BP1在小鼠的缺乏导致中枢神经系统的严重缺陷，特别是共济失调phenotype其特征在于，没有能力正确地协调的运动和空间工作记忆的改变（如在一个肢抱拢式测试， 图2B中所示）。 G3BP1存在于应力颗粒神经元中，这是更有趣的是，超导重力已经示出，形成在神经变性疾病如阿尔茨海默病的发作。

该测定中（ 图1），从而允许以研究的SG在原代细胞，不可缺少来研究其组成和装配体内 。此外，它允许活细胞的研究，并因此可以用于跟踪的SG的动态，通过可视化的一个或多个实时其过表达的元件， 图3示出了代表时间推移图像允许跟随装配和动力学G3BP1含SGS实验室砷处理后的MEF。在图4A中，相同的实验是在崇拜执行与鼠海马神经元URE。 EGFP-G3BP1本地化去从大亚细胞颗粒结构，以更明确和更小的颗粒，经SGS，砷治疗后。的SG是越来越定义，如果收购被持续（未示出），但其细胞形态开始变化，可能是由于诱导的激光激发的热量和毒性。

时间流逝允许视频的捕捉，直接观察了SGS动态。此外，使用共聚焦显微镜的允许重建的图像在Z轴堆叠，从而跟随整个3维细胞中的机构的完全的动力学（如在图4B中所定义的时间示出了神经元）。

图1描述的协议的主要步骤 。主细胞进行培养从胚胎（18.5 DPC（天后coitum）（或新生儿幼仔）的神经元（一），13.5 DPC为的MEF（b）条）。含EGFP-G3BP1基因的质粒转染后，细胞被强调和成像与激光扫描共聚焦显微镜。含G3BP1-SGS的动态观察。 神经元是由微管相关蛋白（微管相关蛋白2）染色（a）中，G3BP1染色的MEF（b）中显示。它们被给定为说明性的图片，以及EGFP-G3BP1转染的鼠神经元（c）和成纤维细胞（d）中，它是独立的图片和不对应于在（a）和给定的细胞（b）所示。

图2（A）。 G3BP定位在培养的MEF和海马神经元，未经处理或与亚砷酸钠强调。 G3BP主要是细胞质，与弥漫性染色的MEF（a）或在大颗粒结构中的神经元（三）当细胞没有强调的躯体。 1小时的亚砷酸钠治疗后，G3BP变得以离散的胞质颗粒局部（MEFs细胞，b和神经元，d）所示。这里，固定细胞并进行免疫染色用抗G3BP1抗体。 MAP2染色许可证，以确定在C神经元）和d）。 DNA的复染为蓝色用Hoechst。标尺代表2微米（a和b）和10微米（c和d）（B）。当向地板 （肢紧握测试） 的尾部抬起 ，野生型小鼠延长他们的腿（左），而G3BP1基因敲除小鼠表现出异常的爪子紧紧抱住反射接近蝙蝠一样的姿势。 请点击此处查看大图这个数字。

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图3中的时间推移实验逐次采集与MEFs细胞转染EGFP-G3BP1获得，使用Leica SP5激光扫描共聚焦显微镜 （激发波长为488纳米的波长）。收购已经开始10分钟内添加亚砷酸钠后，并在10分钟内以20秒的间隔获得。六个代表性的图片给出，与T增加了亚砷酸钠（0.5毫米）后的时间以秒为单位。箭头显示了两个方面，我们可以看到的SG的组装。比例尺= 2微米。

图4（A）。在时间推移实验连续采集与转染EGFP-G3BP1小鼠海马神经元获得的，使用的是徕卡SP5激光扫描共聚焦显微镜 （激发在488纳米的波长）。收购已经开始5分钟加入的亚砷酸钠后，并在40分钟内以20秒的间隔获得。六个代表性的图片给出，与T增加了亚砷酸钠（0.5毫米）后的时间以秒为单位。箭头显示了两个方面，我们可以看到的SG的组装。标尺为5微米D:。枝晶;一:轴突 。 （B）。来自Z堆栈转染EGFP-G3BP1并与亚砷酸钠治疗的神经元（5收购Z轴合共逾10微米）3维重建 N:神经突起（树突或轴突）。 请点击此处查看大图版本这个数字。

作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。