活体原代细胞中G3BP应激颗粒动态的可视化

摘要

应激颗粒（SG）是含有停滞的核糖核蛋白颗粒（RNPs）的细胞质RNA颗粒，在细胞应对多种应激过程中发挥重要作用。通过在应激处理后观察转染的原代细胞中带有标签的SG组分的定位，可在活细胞中追踪SG的动态变化。

摘要

应激颗粒（SGs）可通过特异性蛋白组分或polyA+ mRNA的免疫染色在细胞中进行可视化观察。SGs具有高度动态性，研究其组装过程及命运变化对于理解细胞应对应激的反应至关重要。SGs关键因子（如G3BP（RasGAP SH3结构域结合蛋白））的缺失会导致小鼠出现发育缺陷 以及中枢神经系统的异常。为了研究来自生物体细胞中SGs的动态行为，可培养原代细胞并追踪转染的带有标签的SGs组分的定位情况。本文描述了在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中观察含G3BP1的SGs的时间序列实验。该技术也可用于活神经元中含G3BP的SGs的研究，这一点尤为关键，因为最近的研究表明，此类SGs在阿尔茨海默病等神经退行性疾病的起始阶段即已形成。该方法可适用于其他任何细胞器或颗粒蛋白组分的研究，并可用于转基因动物，从而实现例如在缺失特定颗粒因子的情况下对颗粒动态行为的活体研究。

引言

应激颗粒（SGs）是细胞在环境应激（如温度升高、氧化应激、缺氧、渗透压休克、紫外线照射、葡萄糖剥夺或病毒感染¹）下形成的无膜细胞质灶状结构，属于一种细胞保护性反应。可通过使用诱导氧化应激的化合物（如亚砷酸钠）进行化学诱导来形成SGs。SGs会富集停滞的翻译阻滞信使核糖核蛋白（mRNPs）复合物²，将mRNA从翻译机器中隔离出来；其组装可由真核起始因子2α（eIF2α）的磷酸化所触发。SGs是动态结构，能够与多聚核糖体及其他颗粒（如P小体）交换组分。它们构成一个"分诊中心"，在此mRNA被分类并处理，以决定其后续命运：进行翻译、重新启动翻译、降解，或包装成稳定的非多聚核糖体mRNPs³。SGs的组装速度较快，但这一过程是渐进的，最初形成大量微小聚集体，随后融合为更大的颗粒。使用破坏或稳定微管的化学抑制剂研究表明，微管网络对于SGs的动态行为（包括组装、融合及解聚过程）是必需的。

应激颗粒（SG）的动态组装还受到特定RNA结合蛋白（RNA-BP）聚集的促进，例如TIA-1（T细胞内抗原-1）和TIAR（TIA-1相关蛋白），这些蛋白能够形成二聚体，促进多聚核糖体解体，并引导mRNA进入应激颗粒⁴。G3BP（RasGAP SH3结构域结合蛋白）就是一种此类RNA结合蛋白，在细胞受到亚砷酸盐或高温应激时会定位于应激颗粒中，且去磷酸化G3BP的过表达可诱导应激颗粒的组装⁵。

G3BP 是一种在进化上保守的 RNA 结合蛋白（RNA-BP），最初因其与 Ras-GTP 酶激活蛋白（RasGAP p120 ⁶）的相互作用而被鉴定；但该相互作用最近受到了重新审视⁷。G3BP 家族在哺乳动物中有两个成员：G3BP1（简称 G3BP）和 G3BP2 ⁸。当细胞受到应激时，这两种蛋白均会在应激颗粒（SGs）中发生共定位⁹。G3BP 蛋白包含一个位于 N 末端的 NTF2 结构域，该结构域被认为可影响其定位和寡聚化，随后是富含脯氨酸（PxxP）的基序，以及位于 C 末端的与 RNA 结合相关的基序：典型的 RNA 识别基序（RRM），其含有保守的 RNP1 和 RNP2 基序，后接一个富含精氨酸-甘氨酸（RGG）的区域。有趣的是，通过构建不同结构域与 EGFP 融合蛋白来分析该蛋白的不同部分发现，NTF2 样结构域和 RNA 结合结构域被最有效地招募至应激颗粒中，提示二聚化能力和 RNA 结合能力在应激颗粒组装过程中的重要性。多种模型已揭示 G3BP 蛋白在体外（in vitro）具有多种功能^10–13。在小鼠中破坏 G3BP 基因的结果表明，该蛋白在发育生长和存活中具有重要作用¹⁴，同时揭示了 G3BP 在中枢神经系统（CNS）中的关键功能，其特征表现为共济失调以及空间工作记忆缺陷¹⁵。G3BP 缺陷会导致神经元可塑性异常和钙稳态失调，从而建立了应激颗粒形成与神经退行性疾病之间的直接联系¹⁵。因此，能够在神经元等原代细胞中研究应激颗粒的动态变化显得尤为重要。

本方案提供了一种简单的方法，用于在亚砷酸盐处理下观察初级细胞中含G3BP1的应激颗粒（SGs）的组装过程。该方法可用于研究不同条件下（例如不同类型应激）的应激颗粒组装，也可根据需要调整用于其他颗粒或应激颗粒的其他组分。本方案虽以G3BP1为重点，但应激颗粒尚有其他标志物，如TIA-1/R、TTP（tristetraprolin）²、FMRP（Fragile X智力障碍综合征蛋白）¹⁶、TDP-43（转录反应DNA结合蛋白43）¹⁷以及Staufen¹⁸。特别是TIA-1/R等蛋白，与G3BP类似，属于可作为RNA结合蛋白的成核因子，当其过表达时可诱导应激颗粒的形成，尽管不同条件下形成的应激颗粒在功能、调控机制及相关转录本方面可能存在差异。可通过转染上述任一关键组分或成核蛋白的荧光标记版本，以实现对特定应激颗粒组装过程及动态行为的成像观察。

方案

本方案中的所有动物操作均严格遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86-609/EEC）的指导原则。将小鼠群养，自由进食和饮水 随意摄取在受控环境（22 ±1 °C，55 ±5% 湿度）中饲养，光照周期为12小时光照：12小时黑暗（光照开启时间为7:00）。

1. 小鼠原代细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）

1. 高压灭菌细头镊子、弯头镊子和解剖剪，存放于无菌容器中。使用无菌D-PBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）。配制完全MEFs培养基：在DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1%非必需氨基酸和0.5 mM 2-巯基乙醇，于37 °C预热。
2. 通过颈椎脱位法处死一只妊娠13.5天（dpc）的小鼠。用消毒后的器械取出小鼠的子宫角 90% 乙醇。在无菌洁净的超净台中，将含有胚胎的角放入37 °C预热的D-PBS中。打开角，放置 将胚胎置于100 mm无菌塑料培养皿中，清除脐带组织，并用温热的D-PBS洗涤以去除多余血液。在双目显微镜下，去除胚胎的四肢和内脏器官 包含脑的头部上半部分。
3. 在新的培养皿中，切碎 将胚胎用无菌外科器械切割成非常小的碎片 刀片 或剪刀（至少1分钟）。对于不同基因型的胚胎，需注意将每个胚胎分别放入独立的培养皿中，并保留尾部或头部上端用于基因分型。
4. 用1x覆盖胚胎 胰蛋白酶-EDTA（0.25% 胰蛋白酶，1 mM EDTA）。在37 °C培养箱中孵育30分钟至1小时。加入10 ml完全MEFs培养基以终止胰蛋白酶反应。反复吹打混匀，去除所有细胞团块。将细胞悬液转移至含有完全培养基的50 ml离心管中，静置10分钟，然后在室温下以300 × g离心5分钟。将沉淀重悬于完全培养基中（每胚胎6 ml）。可用台盼蓝染色计数有核活细胞 蓝色 （约 5 × 10）⁶ 每个胚胎可获得的细胞数量）。每60 mm培养皿中加入3 ml。
5. 第二天更换培养基 让细胞生长 直到培养皿中的细胞融合。许多 可以观察到不同类型的细胞， 但只有成纤维细胞能在传代培养中存活。
6. 将细胞分种至带有玻璃底的35 mm培养皿中（对延时成像实验至关重要），培养至转染时细胞融合度达到50–70%。 测试 支原体 和小鼠病原体。

2. 神经元培养的适应性调整

1. 在培养前一天，在无菌洁净工作台内用聚-L-赖氨酸（200 µl，0.1 mg/ml）包被35 mm玻璃底培养皿，过夜放置。
2. 次日早晨，用无菌纯水冲洗两次，每次5分钟，再冲洗一次，持续45分钟至1小时。更换为2 ml含10% FBS的DMEM培养基，置于37 °C培养箱中继续培养。
3. 在妊娠18.5天（18.5 dpc）时解剖胚胎。在无菌洁净操作台内，将带有胚胎的子宫角置于含冷的无菌HBSS（Hank's平衡盐溶液）的100 mm培养皿中。也可使用新生幼鼠替代胚胎，以保留母鼠生命，使其能够继续繁殖后代，尤其适用于难以获得的转基因动物。在各自的培养皿中，取出每只胚胎或新生幼鼠，用剪刀剪下头部。用弯头镊子插入眼眶固定头部，剪开皮肤，从头后部沿两侧小心掀开软颅骨直至眼睛处。剪断视神经和脑干，取出脑组织，放入盛有HBSS的新培养皿中。在体视显微镜下，使用两把细镊子彻底去除所有脑膜。根据研究目标结构，分离海马、皮层或脑的其他任何部位。
4. 将解剖得到的脑组织结构浸入预先准备好的4.5 ml冷HBSS中（置于15 ml离心管内），冰上保存直至进行胰蛋白酶消化。加入0.5 ml 2.5%胰蛋白酶，于37 °C孵育15至20分钟。用预冷的HBSS洗涤3次 用HBSS冲洗，需格外小心，避免丢弃已消化的脑组织部分。
5. 在500 µl（海马）至1 ml（皮层）含10% FBS的DMEM中重悬，使用带1 ml吸头的1 ml移液器反复吹打数次，随后更换为带1 ml加200 µl吸头的移液器，继续吹打直至无可见团块。
6. 将100–200 µl细胞悬液分配至每个含有DMEM加10% FBS的35 mm玻璃底培养皿中，于37 °C孵育至少3小时，使神经元贴壁。随后更换为预热的完全神经元培养基（Neurobasal培养基添加250 µM L-谷氨酰胺和NS21，配制方法见Chen） 等¹⁹）并在37 °C下孵育，以促进神经元生长。在神经元培养5至14天后进行转染。 体外 （转染效率在培养数天后较高，但突触连接在7-10天时形成得更完善。）

3. 转染EGFP-G3BP1质粒

使用3 µg纯化的质粒转染细胞，将目的蛋白（应激颗粒SGs的任一组分）的cDNA与荧光标记物（GFP、YFP等）融合后克隆至表达载体中，每35 mm培养皿转染一次。

1. 使用商业转染试剂盒，按照制造商提供的方案（参见材料/试剂表）对MEFs进行转染。
2. 使用改良自Xia的磷酸钙法转染神经元 等²⁰ 简要：
   1. 配制溶液：DMEM洗涤液：含25 mM KCl的DMEM；转染溶液：含1x的DMEM洗涤液 DMKY（HEPES 5 mM，MgCl₂ 2 mM，山梨醇 0.43 M）₂ 10 mM，酚红）；以及刺激溶液：HeBS 1×，DMKY 1×， 以及含2% (v/v) DMSO的溶液；并在37 °C下保存。
   2. 移除神经元中的培养基，过滤后置于37 °C保存。用DMEM洗涤液洗涤，然后更换为转染培养基，并在制备磷酸钙-质粒DNA沉淀期间保持在37 °C。
   3. 在1.5 ml 微量离心管中，依次加入 Braun 水（终体积50 µl）、5 µl CaCl₂ 溶液、1 µl 质粒 DNA（浓度约0.1–1 µg/µl），轻轻混匀。₂ 2.5 M 和 3 µg 质粒 DNA。将此混合物滴加到 50 µl 的 HeBS 2x 上 已在圆底聚丙烯管中加入。滴加过程中沿同一方向旋转混匀。室温静置30分钟，使沉淀形成。
   4. 将沉淀物逐滴加入神经元中，37 °C下孵育30至50分钟。
   5. 更换为休克溶液孵育1分钟，随后用DMEM洗涤液冲洗，最后重新加入预处理培养基。将细胞置于37 °C环境中培养。

4. G3BP 含有应激颗粒的组装与动态可视化

1. 将含有酚红的细胞培养基更换为不含酚红的培养基。
2. 使用配备荧光功能的共聚焦显微镜进行图像采集。开启显微镜系统：汞灯、计算机和激光器。在开始采集前至少20分钟将培养腔预热至37 °C。
3. G3BP的过表达可诱导应激颗粒（SGs）的自发形成。因此，转染后24小时即可直接观察细胞中SGs的组装过程，无需诱导应激。或者，也可通过诱导应激进一步促进SGs的组装。加入0.5 mM砷酸钠，并在添加化合物后立即开始图像采集（颗粒通常在1小时内充分形成）。
4. 在浸油物镜上添加镜油（使用40X或63X物镜），并将培养皿安装在适配的35 mm显微镜支架上，确保支架固定于载物台。检查培养皿是否平整，否则会影响图像采集质量。根据所用荧光染料开启相应的荧光光源，观察转染成功的细胞。一旦目标细胞进入视野，立即关闭荧光光源，以尽量减少光漂白和细胞毒性。
5. 在"采集选项卡"中，根据标签荧光染料的激发波长选择相应的激光器（本实验方案使用EGFP标记的G3BP，激发波长为488 nm），并为光电倍增管（PMT）选择合适的发射波长。调节激光功率（通常不超过10%），以最小化噪声、信号饱和以及细胞毒性；调节增益和偏移值以优化信噪比。采用快速扫描模式（1,000 Hz），以缩短激光照射时间（线平均为2，帧平均为1）。如需进行三维图像重建，可设置Z轴堆栈参数（细胞成像通常采用1 µm的Z轴步进）。确定每次采集之间的时间间隔：较短的间隔可获得更连贯的动态影像，但可能引起光漂白和细胞毒性（本实验中采用20秒的间隔时间）。总采集时长可根据应激类型而调整。在砷酸钠处理下，大量含G3BP的应激颗粒迅速形成，通常在处理1小时后清晰可见；此时应尽快选定待拍摄细胞，并在施加应激后立即开始采集，总采集时间15–20分钟已足以观察多个应激颗粒的组装过程。
6. 保存图像，并使用ImageJ软件对Z轴堆栈图像和动态影像进行重建。

结果

应激颗粒的形成在细胞应对应激反应中具有重要作用，可在应激持续期间暂停翻译过程，使细胞得以适应环境，同时与抑制细胞凋亡相关。本实验方法可用于在原代细胞中研究应激颗粒，通过追踪关键应激颗粒蛋白组分的定位来实现（图1）。G3BP是应激颗粒组装的关键因子，在培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或神经元的细胞质中通常呈较弥散分布（图2A a 和 c）；而在亚砷酸盐处理后，G3BP在MEFs和神经元中均明显聚集于离散的颗粒结构中（图2A b 和 d）。原代细胞可来源于转基因小鼠模型，从而允许例如在缺失某一应激颗粒组分的情况下研究其功能。有趣的是，小鼠中G3BP1的缺失会导致中枢神经系统严重缺陷，表现为明显的共济失调表型，即无法正常协调运动（如肢体抓握实验所示，图2B），并伴有空间工作记忆障碍。G3BP1存在于神经元的应激颗粒中，这一点尤为重要，因为已有研究表明，应激颗粒在阿尔茨海默...

讨论

该实验方案中最关键的步骤涉及转染，尤其是时间间隔成像的采集，必须仔细监测以降低细胞毒性。

原代细胞的培养并不困难，只要保持无菌条件，并在解剖和细胞分离步骤中谨慎操作以避免损伤即可。胚胎成纤维细胞（MEFs）可在早期传代时冻存。已有研究表明，使用磷酸钙法转染神经元效果良好²¹，本方案改编自Xia et al.²⁰，可实现较高的转染效率，但可能引起一定程度的细胞死亡。神经元应在培养后数天内进行转染，需注意检查溶液的pH值，并密切监测神经元与磷酸钙-质粒沉淀物共孵育的过程，孵育时间不应超过1小时。应在光学显微镜下观察，若发现聚集体，则应立即去除转染培养基。用DMEM洗涤的次数可适当增加。

某些应激颗粒（SGs）蛋白组分的过表达会导致颗粒的自发组装，这一过程似乎涉及这些蛋白的寡聚化和RNA结合特性，例如TIA-1/R⁴或G3BP⁵。因此，确定可以开始延时成像采集的时间点非常重要。在转染EGFP-G3BP并表达该蛋白后24小时，即可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Gibco	21331	37 °C 预热
丙酮酸钠	Gibco	11360
非必需氨基酸	Gibco	11140
L-谷氨酰胺	Gibco	25030
胰蛋白酶	Gibco	15096
玻璃底培养皿 B-35	Greiner	627860/627861	经处理或未经处理（经处理：增强贴壁细胞的附着）
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	37 °C 预热
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal 培养基	Gibco	21103	37 °C 预热
2-巯基乙醇	Gibco	31350
镊子	Biotek	DU-110-A	极细，尖端 0.1 mm（适用于去除软脑膜）
弯头镊	Biotek	P-110-BUF	极细，尖端 0.1 mm
小型剪刀	Biotek	CM-85-BS	可用于分离海马体
Polyplus 转染 JetPEI 试剂	Ozyme	101-10	用于 MEFs 转染，请遵循正向操作流程
倒置激光扫描共聚焦显微镜	Leica	SP5