活体原代细胞中G3BP应激颗粒动态的可视化

摘要

应激颗粒（SG）是含有停滞的核糖核蛋白颗粒（RNPs）的细胞质RNA颗粒，在细胞应对多种应激过程中发挥重要作用。通过在应激处理后观察转染的原代细胞中带有标签的SG组分的定位，可在活细胞中追踪SG的动态变化。

摘要

应激颗粒（SGs）可通过特异性蛋白组分或polyA+ mRNA的免疫染色在细胞中进行可视化观察。SGs具有高度动态性，研究其组装过程及命运变化对于理解细胞应对应激的反应至关重要。SGs关键因子（如G3BP（RasGAP SH3结构域结合蛋白））的缺失会导致小鼠出现发育缺陷 以及中枢神经系统的异常。为了研究来自生物体细胞中SGs的动态行为，可培养原代细胞并追踪转染的带有标签的SGs组分的定位情况。本文描述了在小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中观察含G3BP1的SGs的时间序列实验。该技术也可用于活神经元中含G3BP的SGs的研究，这一点尤为关键，因为最近的研究表明，此类SGs在阿尔茨海默病等神经退行性疾病的起始阶段即已形成。该方法可适用于其他任何细胞器或颗粒蛋白组分的研究，并可用于转基因动物，从而实现例如在缺失特定颗粒因子的情况下对颗粒动态行为的活体研究。

引言

应激颗粒（SGs）是细胞在环境应激（如温度升高、氧化应激、缺氧、渗透压休克、紫外线照射、葡萄糖剥夺或病毒感染¹）下形成的无膜细胞质灶状结构，属于一种细胞保护性反应。可通过使用诱导氧化应激的化合物（如亚砷酸钠）进行化学诱导来形成SGs。SGs会富集停滞的翻译阻滞信使核糖核蛋白（mRNPs）复合物²，将mRNA从翻译机器中隔离出来；其组装可由真核起始因子2α（eIF2α）的磷酸化所触发。SGs是动态结构，能够与多聚核糖体及其他颗粒（如P小体）交换组分。它们构成一个"分诊中心"，在此mRNA被分类并处理，以决定其后续命运：进行翻译、重新启动翻译、降解，或包装成稳定的非多聚核糖体mRNPs³。SGs的组装速度较快，但这一过程是渐进的，最初形成大量微小聚集体，随后融合为更大的颗粒。使用破坏或稳定微管的化学抑制剂研究表明，微管网络对于SGs的动态行为（包括组装、融合及解聚过程）是必需的。

应激颗粒（SG）的动态组装还受到特定RNA结合蛋白（RNA-BP）聚集的促进，例如TIA-1（T细胞内抗原-1）和TIAR（TIA-1相关蛋白），这些蛋白能够形成二聚体，促进多聚核糖体解体，并引导mRNA进入应激颗粒⁴。G3BP（RasGAP SH3结构域结合蛋白）就是一种此类RNA结合蛋白，在细胞受到亚砷酸盐或高温应激时会定位于应激颗粒中，且去磷酸化G3BP的过表达可诱导应激颗粒的组装^5<....

方案

本方案中的所有动物操作均严格遵循1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86-609/EEC）的指导原则。将小鼠群养，自由进食和饮水 随意摄取在受控环境（22 ±1 °C，55 ±5% 湿度）中饲养，光照周期为12小时光照：12小时黑暗（光照开启时间为7:00）。

1. 小鼠原代细胞培养：小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）

1. 高压灭菌细头镊子、弯头镊子和解剖剪，存放于无菌容器中。使用无菌D-PBS（Dulbecco磷酸盐缓冲液）。配制完全MEFs培养基：在DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、1 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、1%非必需氨基酸和0.5 mM 2-巯基乙醇，于37 °C预热。
2. 通过颈椎脱位法处死一只妊娠13.5天（dpc）的小鼠。用消毒后的器械取出小鼠的子宫角 90% 乙醇。在无菌洁净的超净台中，将含有胚胎的角放入37 °C预热的D-PBS中。打开角，放置 将胚胎置于100 mm无菌塑料培养皿中，清除脐带组织，并用温热的D-PBS洗涤以去除多余血液。在双目显微镜下，去除胚胎的四肢和内脏器官 包含脑的头部上半部分。
3. 在新的培养皿中，切碎 将胚胎用无菌外科器械切割成非常小的碎片 刀片 或剪刀（至少1分钟）。对于不同基因型的胚胎，需注意将每个胚胎分....

结果

应激颗粒的形成在细胞应对应激反应中具有重要作用，可在应激持续期间暂停翻译过程，使细胞得以适应环境，同时与抑制细胞凋亡相关。本实验方法可用于在原代细胞中研究应激颗粒，通过追踪关键应激颗粒蛋白组分的定位来实现（图1）。G3BP是应激颗粒组装的关键因子，在培养的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）或神经元的细胞质中通常呈较弥散分布（图2A a 和 c）；而在亚砷酸盐处理后，G3BP在MEFs和神经元中均明显聚集于离散的颗粒结构中（图2A b 和 d）。原代细胞可来源于转基因小鼠模型，从而允许例如在缺失某一应激颗粒组分的情况下研究其功能。有趣的是，小鼠中G3BP1的缺失会导致中枢神经系统严重缺陷，表现为明显的共济失调表型，即无法正常协调运动（如肢体抓握实验所示，图2B），并伴有空间工作记忆障碍。G3BP1存在于神经元的应激颗粒中，这一点尤为重要，因为已有研究表明，应激颗粒在阿尔茨海默.......

讨论

该实验方案中最关键的步骤涉及转染，尤其是时间间隔成像的采集，必须仔细监测以降低细胞毒性。

原代细胞的培养并不困难，只要保持无菌条件，并在解剖和细胞分离步骤中谨慎操作以避免损伤即可。胚胎成纤维细胞（MEFs）可在早期传代时冻存。已有研究表明，使用磷酸钙法转染神经元效果良好²¹，本方案改编自Xia et al.²⁰，可实现较高的转染效率，但可能引起一定程度的细胞死亡。神经元应在培养后数天内进行转染，需注意检查溶液的pH值，并密切监测神经元与磷酸钙-质粒沉淀物共孵育的过程，孵育时间不应超过1小时。应在光学显微镜下观察，若发现聚集体，则应立即去除转染培养基。用DMEM洗涤的次数可适当增加。

某些应激颗粒（SGs）蛋白组分的过表达会导致颗粒的自发组装，这一过程似乎涉及这些蛋白的寡聚化和RNA结合特性，例如TIA-1/R⁴或G3BP⁵。因此，确定可以开始延时成像采集的时间点非常重要。在转染EGFP-G3BP并表达该蛋白后24小时，即可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Gibco	21331	37 °C 预热
丙酮酸钠	Gibco	11360
非必需氨基酸	Gibco	11140
L-谷氨酰胺	Gibco	25030
胰蛋白酶	Gibco	15096
玻璃底培养皿 B-35	Greiner	627860/627861	经处理或未经处理（经处理：增强贴壁细胞的附着）
聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	37 °C 预热
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal 培养基	Gibco	21103	37 °C 预热
2-巯基乙醇	Gibco	31350
镊子	Biotek	DU-110-A	极细，尖端 0.1 mm（适用于去除软脑膜）
弯头镊	Biotek	P-110-BUF	极细，尖端 0.1 mm
小型剪刀	Biotek	CM-85-BS	可用于分离海马体
Polyplus 转染 JetPEI 试剂	Ozyme	101-10	用于 MEFs 转染，请遵循正向操作流程
倒置激光扫描共聚焦显微镜	Leica	SP5