测量细菌的影响 C。线虫行为使用一个鸡蛋保留含量

摘要

一个鸡蛋在蠕虫（EIW）法是一种有用的方法来量化产蛋行为。产蛋的改变可以是一个模型有机体的行为反应线虫

摘要

线虫产卵行为是受环境因素如渗透压和振动^2。在完全没有食物C.线虫也停止产蛋，并保留受精卵在子宫^3。然而，不同来源的食品，特别是病原细菌，特别是粪肠球菌 ，对产卵行为的影响没有得到很好的特征。蛋在蜗杆（EIW）法是一种有用的工具，不同类型的细菌的影响量化，在这种情况下， 大肠杆菌粪，产蛋行为。

EIW检测涉及计数鸡蛋的数量保留在子宫C.线虫 ^4。 EIW检测涉及漂白上演，妊娠成人C.线虫去除角质层，从动物中分离保留的鸡蛋。在漂白之前，蠕虫暴露于细菌（或任何不同的环境线索）一段固定的时间。漂白后，一个是很容易能够指望鸡蛋保留子宫内蠕虫的数量。在这个实验中，一个量化的增长后，在鸡蛋保留E.粪曝光可以很容易地测量。的的EIW测定试验，可用于筛选潜在致病细菌或环境毒素的存在是一种行为。此外，EIW检测可能是一个工具，屏幕药物，影响神经递质的信号，因为产卵的行为是由神经递质，如5 -羟色胺和乙酰胆碱的^5-9调制。

引言

一个微小的，自由生活的蛔虫， 线虫 ，是一种模式生物，传统上用来研究人类发育和细胞的信令流程，因为透明解剖特征的发展，全基因组测序，短代时，基因的同源性。最近，C.线虫已经成为一种模式生物在该领域的环境毒理学和先天免疫^10，11。

这些自我施肥雌雄同体蠕虫从卵孵化后的两到三天内性成熟。在它的生命周期，C.线虫通过四个幼虫阶段（L1-L4），达到成年之前。可以产生一个孤立的雌雄同体，平均300个后代在三天之内的峰值繁殖力。在生殖成熟C.线虫雌雄同体，受精卵在子宫内保留几个小时前被解雇。该存储在子宫中的蛋在任何一个时间的正常数量的（在繁忙繁殖力）是在10和15之间^12。鸡蛋在子宫产蛋率和产蛋率的函数。受精卵从子宫排出，外阴^13日开幕的周围布置的16个外阴部肌肉的收缩。的雌雄同体特定运动神经元（HSN）和VC影响肌肉收缩阴部肌肉的运动神经元突触上，从而鸡蛋产蛋行为^5,7,13,14。驱逐鸡蛋从子宫的发生是由于神经元和肌肉的协调活动。

C.实验室培养线虫通常提出非致病性大肠杆菌 OP50的饮食。在自然环境中，C。线虫接触到的各种食物来源，如致病性细菌，也可以有潜在危害。当暴露于有害物质的的环境中，C。线虫保留鸡蛋，直到环境变得更加有利。据推测，这鸡蛋保留是为了保护他们的后代。

在这个蛋虫（EIW）测定，C.线虫暴露于潜在的致病细菌， 粪肠球菌 ，这是存在于环境中。 大肠杆菌致病形式曝光粪可引起持续性肠道感染，甚至死亡，在C线虫 ^15。暴露于其他形式的致病性细菌已被证明影响蛋保留^16,17，但是没有量 ​​化的效果。此外，轻度致病性菌株的大肠杆菌的效果肠球菌 ，菌株不会立即致命，产蛋行为还没有被研究。

EIW检测涉及计数鸡蛋的数量保留在子宫C.线虫 ^4。尽管C。线虫是透明的，积聚在子宫的卵可以是难以量化，在一个完整的动物。 EIW检测涉及漂白妊娠成人C.线虫暴露于细菌一段固定的时间。漂白粉溶液溶解身后留下的鸡蛋外被角质层。鸡蛋是折射的漂白剂，由于存在保护蛋壳的效果。漂白后，能够非常容易地发布从子宫的蠕虫后漂白的鸡蛋的数量来计算。

检测是一种简单，廉价和快速的方法来量化在子宫内一次鸡蛋的数量，从而量化的影响E.粪蛋保留。本试剂盒可用于其他类型的细菌，环境毒素或药物的效果进行量化的蛋性。本试剂盒也有可能被用作细菌致病性的屏幕。

方案

1）制备线虫生长培养基（NGM）

1. 为了使50板，加1.5克氯化钠，8.5克超纯琼脂和1.25克蛋白胨1 Lflask的。
2. DH ₂ O添加487.5毫升的烧瓶。轻轻摇晃混合覆盖开幕烧瓶用一块铝箔。
3. 消毒的解决方案，通过在标准条件下高压灭菌（121磅，120℃，20分钟）。
4. 让溶液冷却至45℃的水浴中。
5. 要解决方案，添加下面的顺序：500微升胆固醇5毫克/毫升原液（溶解在乙醇中），500微升1 ₂ M的氯化钙，500微升1 M _硫酸镁和12.5毫升KPO ₄缓冲液（54.15克KH ₂ PO ₄和17.8克K ₂ HPO ₄ 500毫升蒸馏水₂ O）中所描述的^18。
6. 使用无菌移液器，加10毫升琼脂溶液各60毫米的聚苯乙烯培养皿。允许介质在室温下固化overn洞察力。

2）制备的B肉汤E.大肠杆菌媒体

1. 五个100毫升文化，加2.5克酵母提取物，蛋白胨，5.0克氯化钠5.0克到烧杯中。
2. 添加无菌蒸馏水至终体积为500ml。在热板上加热溶液，边搅拌，直至溶解溶质。
3. 分为五个玻璃瓶（至少200毫升）倒入100毫升的B肉汤。
4. 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。
5. 允许乙肉汤冷却至室温后再使用。

3）播种C.线虫维护板

1. NGM板在室温下干燥至少一个星期后，一个100毫升乙肉汤培养物接种的大肠杆菌菌落有几大肠杆菌 （OP50）。
2. E.成长菌在37℃过夜。
3. 吸取1滴（约10081，L）OP50文化到每个NGM板的中心。片通常叠盖侧。移液时（播种），开始在堆栈的底部吹打文化上板。您的工作方式，每个堆栈。尽量不要移动的板，因为它是重要的文化太靠近板的边缘后播种。
4. 允许种子板在室温下干燥，在使用前至少一个星期。
5. 种子板块在密封的塑料容器中，在室温下保存（倒）。

4）维护C.线虫菌株

1. 为了维持精心喂养C.线虫股票，使用蠕虫挑L4S或妊娠成人移动到一个新的种子NGM板每3-4天。
2. 商店板（倒）里面最好的孵化器在15 - 22°C。所描述的测定中的培养物储存在20℃下下线虫的发展是温度相关的。由于maintenaNCE温度的升高，发育阶段之间的时间减少。

5）胰酶大豆琼脂（TSA）E.粪文化传媒

1. 50板，测量一瓶500毫升的无菌蒸馏水，把煮沸，一边搅拌，在电炉上。
2. 粉状TSA琼脂20克加入烧瓶，并允许溶液溶解。
3. 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。
4. 让溶液冷却至45℃的水浴中。
5. 使用无菌移液器，加10毫升琼脂溶液各60毫米的聚苯乙烯培养皿。允许介质在室温下固化过夜。

6）胰酶大豆肉汤（TSB）E.粪文化传媒

1. 为了使250个培养管，测量到一个烧瓶和温暖的烤盘上，而500毫升的无菌蒸馏水搅拌。
2. TSB琼脂粉15克加入到烧瓶中，使粉末溶解。
3. 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。
4. 让溶液冷却至室温，然后移液管2毫升，放入灭菌的5毫升试管。

7）脑心浸液（BHI）媒体，链霉素，E.粪文化

1. 测量无菌蒸馏水500毫升的烧瓶中，并把煮沸，一边搅拌，在电炉上。
2. 26克BHI培养基加入到烧瓶中，使该溶液溶解。
3. 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。
4. 让溶液冷却至45℃的水浴中。
5. 使用无菌技术，加入0.5毫升10毫克/毫升链霉素的原液和涡流混合。
6. 加入10毫升的溶液，以每60毫米的聚苯乙烯培养皿中。
允许媒体在室温下固化过夜。商店板（倒）在4℃，直到几个小时后再使用。

8）维护E.粪肠球菌

1. 为了维持E。粪股市连胜单独的胰酶大豆琼脂（TSA）平板上的单个菌落，用无菌环。
2. 文化生长在37℃过夜。店板（倒）了几个星期在室温下在密封的袋子或盒子中。

9）准备E.粪板EIW含量的

1. 接种2毫升TSB文化的殖民地E.粪肠球菌和孵育过夜，在37°C。
2. 移液管加入20μl 大肠杆菌粪到准备好的BHI链霉素板的中心文化，孵育过夜，在37°C。

10）准备E.大肠杆菌板EIW含量（控制板）

1. 接种了100毫升的B-BRO次文化的殖民地E.大肠杆菌 OP50在37℃孵育过夜
2. 吸取20μl的的OP50培养的到非种子选手NGM板的中心和允许种子板在室温下干燥过夜。

11）蛋蠕虫含量

1. 挑选15 - 20上演L4 C.线虫 （ 图1）上制备的BHI-链球菌， 大肠杆菌到草坪的细菌的中心粪板。要小心不转让了很多OP50的BHI板的。接送L4S相同数量的到控制NGM-OP50板。
2. 40小时，在20°C孵育板
3. 准备20％的漂白粉溶液。的商业漂白剂（6.0％次氯酸钠）混合，用适当体积的蒸馏水。
4. 加入10微升滴漂白剂溶液，以10个不同的位置上的塑料盖（一个蠕虫病毒或细菌板）。
5. 使用蠕虫挑，一个蠕虫传输到每个漂白下降。轻轻旋转的尖端挑中的漂白剂液滴，，确保蠕虫洗掉挑年底（确认在解剖显微镜下观察液滴）。
6. 使角质层溶解约10分钟或直到蠕虫爆裂开来，驱逐鸡蛋（ 图2）。要小心，不要将鸡蛋从板块。
7. 使用解剖显微镜每一滴漂白剂，算上鸡蛋。

结果

此法可以让一个量化C.内保留的鸡蛋数量线虫暴露于E.后粪 。 L4上演蠕虫（特点是透明开放的空间高于其外阴， 图1）暴露于E.粪到成年。经过40个小时的接触E.粪 ，漂白。由于角质层崩解在漂白剂液滴，蛋变得更加明显（ 图2）。保留鸡蛋的数量很容易量化计算，而解剖显微镜下观看。

存在的大肠杆菌中保留更多的蛋测试粪肠球菌菌株相比，为E。大肠杆菌 OP50对照组（ 图3）。中任意一项的效果的大肠杆菌菌株中存在着某些差异个别虫粪 ，从错误的酒吧。然而，其效果的大肠杆菌的菌株的粪蛋内滞留从控制人口明显不相同的蠕虫。鸡蛋滞留引起程度不同的大肠杆菌菌株粪测试也可能有所不同。这种多样的效果可能是由于不同的毒力因子的表达，在每一株。 ...

讨论

成功地执行这个实验中最关键的步骤是：1）使用精心喂养C.股票线虫 ，2）单一类型的细菌培养测定板，3）准确吞吐量上演L4蠕虫暴露于E。粪 ，4）保持曝光时间E.粪一致的，所有试验和5），漂白时间不应超过10分钟，以防止鸡蛋解体。

这个实验，重要的是要挑选健康，良好的喂养蠕虫。产妇饥饿会影响后代的繁殖力和生长^19,20，因此重要的是，蠕虫已经吃得饱饱的，在进行这个实验之前的几代人。很容易保持良好的美联储库存蠕虫通过简单的几个成虫转移到一个新的种子NGM板每2-3天。检测前两天，成虫应放置在新鲜草坪OP50，以便有足够的L4子代可用于检测。

EIW测定板同样重要的是促进只有一个单一类型的细菌的生长。E.粪肠球菌菌株生长上BHI板。链霉素板选择对大肠杆菌大肠杆菌 OP50 L4蠕虫，这是转移，因为他们转移到维护NGM板的检测板。 OP50还生长上BHI板。如果不反对，C.选择

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂，超纯	Affymetrix	10906
Bacto 蛋白胨	Becton Dickinson	211677
Bacto 胰蛋白胨	Becton Dickinson	211705
脑心脏输液脱水培养基	Carolina Biological Supply	781781
C. elegans， N2 菌株	Caenorhabditis 遗传学中心		http://www.cbs.umn.edu/cgc
胆固醇	Alfa Aesar	A11470
C. 秀丽隐杆线虫培养板	Tritech Research Inc.	T3308
粪肠球菌	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
大肠杆菌（OP50）	遗传学中心		http://www.cbs.umn.edu/cgc
粪肠球菌菌株			培养板，由 J. Middleton 提供。
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all 菌株以 44.5 º 生长;C 和 过氧化氢酶阴性和水解 esculin。简化的 基于六种糖的色素沉着和发酵反应的二分法键 （阿拉伯糖、甘露醇、甲基-α;-D-吡喃葡萄糖苷 （MGP）、核糖、山梨糖和山梨糖醇） 的>推定身份。< > faecalis 菌株（Efs 缺乏色素沉着，是阿拉伯糖，MGP 山梨糖阴性和山梨糖醇、甘露醇和核糖阳性）。所有推定的 Efs 菌株 使用 API 20 STREP 系统 （Biomerieux） 确认。
显微镜	Motic	SMZ 168B	任何具有透射照明和 50 倍放大倍率的显微镜都应该足够
硫酸链霉素	Fisher BioReagents	BP910-50
胰蛋白酶大豆琼脂（大豆-酪蛋白消化琼脂培养基），Difco	Becton Dickinson	236950
胰蛋白酶大豆肉汤（大豆酪蛋白消化培养基），BBL	Becton Dickinson	211768
酵母提取物	Acros	61180-1000