一个鸡蛋在蠕虫(EIW)法是一种有用的方法来量化产蛋行为。产蛋的改变可以是一个模型有机体的行为反应<em>线虫</em到潜在的有害环境的物质,例如由致病细菌产生的。
线虫产卵行为是受环境因素如渗透压和振动2。在完全没有食物C.线虫也停止产蛋,并保留受精卵在子宫3。然而,不同来源的食品,特别是病原细菌,特别是粪肠球菌 ,对产卵行为的影响没有得到很好的特征。蛋在蜗杆(EIW)法是一种有用的工具,不同类型的细菌的影响量化,在这种情况下, 大肠杆菌粪,产蛋行为。
EIW检测涉及计数鸡蛋的数量保留在子宫C.线虫 4。 EIW检测涉及漂白上演,妊娠成人C.线虫去除角质层,从动物中分离保留的鸡蛋。在漂白之前,蠕虫暴露于细菌(或任何不同的环境线索)一段固定的时间。漂白后,一个是很容易能够指望鸡蛋保留子宫内蠕虫的数量。在这个实验中,一个量化的增长后,在鸡蛋保留E.粪曝光可以很容易地测量。的的EIW测定试验,可用于筛选潜在致病细菌或环境毒素的存在是一种行为。此外,EIW检测可能是一个工具,屏幕药物,影响神经递质的信号,因为产卵的行为是由神经递质,如5 -羟色胺和乙酰胆碱的5-9调制。
一个微小的,自由生活的蛔虫, 线虫 ,是一种模式生物,传统上用来研究人类发育和细胞的信令流程,因为透明解剖特征的发展,全基因组测序,短代时,基因的同源性。最近,C.线虫已经成为一种模式生物在该领域的环境毒理学和先天免疫10,11。
这些自我施肥雌雄同体蠕虫从卵孵化后的两到三天内性成熟。在它的生命周期,C.线虫通过四个幼虫阶段(L1-L4),达到成年之前。可以产生一个孤立的雌雄同体,平均300个后代在三天之内的峰值繁殖力。在生殖成熟C.线虫雌雄同体,受精卵在子宫内保留几个小时前被解雇。该存储在子宫中的蛋在任何一个时间的正常数量的(在繁忙繁殖力)是在10和15之间12。鸡蛋在子宫产蛋率和产蛋率的函数。受精卵从子宫排出,外阴13日开幕的周围布置的16个外阴部肌肉的收缩。的雌雄同体特定运动神经元(HSN)和VC影响肌肉收缩阴部肌肉的运动神经元突触上,从而鸡蛋产蛋行为5,7,13,14。驱逐鸡蛋从子宫的发生是由于神经元和肌肉的协调活动。
C.实验室培养线虫通常提出非致病性大肠杆菌 OP50的饮食。在自然环境中,C。线虫接触到的各种食物来源,如致病性细菌,也可以有潜在危害。当暴露于有害物质的的环境中,C。线虫保留鸡蛋,直到环境变得更加有利。据推测,这鸡蛋保留是为了保护他们的后代。
在这个蛋虫(EIW)测定,C.线虫暴露于潜在的致病细菌, 粪肠球菌 ,这是存在于环境中。 大肠杆菌致病形式曝光粪可引起持续性肠道感染,甚至死亡,在C线虫 15。暴露于其他形式的致病性细菌已被证明影响蛋保留16,17,但是没有量 化的效果。此外,轻度致病性菌株的大肠杆菌的效果肠球菌 ,菌株不会立即致命,产蛋行为还没有被研究。
EIW检测涉及计数鸡蛋的数量保留在子宫C.线虫 4。尽管C。线虫是透明的,积聚在子宫的卵可以是难以量化,在一个完整的动物。 EIW检测涉及漂白妊娠成人C.线虫暴露于细菌一段固定的时间。漂白粉溶液溶解身后留下的鸡蛋外被角质层。鸡蛋是折射的漂白剂,由于存在保护蛋壳的效果。漂白后,能够非常容易地发布从子宫的蠕虫后漂白的鸡蛋的数量来计算。
检测是一种简单,廉价和快速的方法来量化在子宫内一次鸡蛋的数量,从而量化的影响E.粪蛋保留。本试剂盒可用于其他类型的细菌,环境毒素或药物的效果进行量化的蛋性。本试剂盒也有可能被用作细菌致病性的屏幕。
1)制备线虫生长培养基(NGM)
2)制备的B肉汤E.大肠杆菌媒体
3)播种C.线虫维护板
4)维护C.线虫菌株
5)胰酶大豆琼脂(TSA)E.粪文化传媒
6)胰酶大豆肉汤(TSB)E.粪文化传媒
7)脑心浸液(BHI)媒体,链霉素,E.粪文化
8)维护E.粪肠球菌
9)准备E.粪板EIW含量的
10)准备E.大肠杆菌板EIW含量(控制板)
11)蛋蠕虫含量
成功地执行这个实验中最关键的步骤是:1)使用精心喂养C.股票线虫 ,2)单一类型的细菌培养测定板,3)准确吞吐量上演L4蠕虫暴露于E。粪 ,4)保持曝光时间E.粪一致的,所有试验和5),漂白时间不应超过10分钟,以防止鸡蛋解体。
这个实验,重要的是要挑选健康,良好的喂养蠕虫。产妇饥饿会影响后代的繁殖力和生长19,20,因此重要的是,蠕虫已经吃得饱饱的,在进行这个实验之前的几代人。很容易保持良好的美联储库存蠕虫通过简单的几个成虫转移到一个新的种子NGM板每2-3天。检测前两天,成虫应放置在新鲜草坪OP50,以便有足够的L4子代可用于检测。
<P类=的“jove_content”> EIW测定板同样重要的是促进只有一个单一类型的细菌的生长。E.粪肠球菌菌株生长上BHI板。链霉素板选择对大肠杆菌大肠杆菌 OP50 L4蠕虫,这是转移,因为他们转移到维护NGM板的检测板。 OP50还生长上BHI板。如果不反对,C.选择线虫两种细菌( 大肠杆菌和粪肠球菌 )将饲料而BHI板。 大肠杆菌菌株在该测定中所使用的粪肠球菌对链霉素耐药。如果不同类型的细菌被用于这个实验中,不同的抗生素,也许是不同的培养基,应使用的,用于选择给出的细菌和对大肠杆菌大肠杆菌 OP50。准确地选择这个实验上演虫是非常重要的有以下几个原因。首先,重要的是要算鸡蛋保持在t他的时间在自我施肥C.鸡蛋生产/铺设线虫 。禽蛋产量仅发生在第一五天C.线虫成年(峰值约40个小时后,L4),此后迅速下降4,21。成虫平均两到三个星期,所以很多成虫生活在至少一个星期,而不是产生受精卵。因此,重要的是确保EIW法不执行unstaged的成虫年龄不详。
上演的第二个原因,重要的是使用动物在EIW检测是这样的时间发展,在该蠕虫已暴露于细菌,毒素或药物被严密控制。 C.文化线虫通常是鸡蛋,L1或L4阶段同步。用于该测定的L4阶段的关注,因为较长的曝光为E。粪会导致杀伤力而后虫生成为妊娠成人。
帐篷“>持续时间蠕虫留下的漂白剂溶液中也是重要的监测。的蠕虫通常应溶于下10分钟,虽然这个蠕虫蠕虫的时间也有所不同。受精卵最终解散,漂白剂,但过程是慢于角质层由于存在保护蛋壳,蛋壳将开始溶解的漂白剂,如果留在溶液中的时间超过10-15分钟。蛋保留反映产蛋量和产蛋之间的平衡。 EIW单独检测,不区分,数量是否保留子宫的鸡蛋由于鸡蛋生产或产蛋改变。这尤其是一个问题,如果蠕虫的细菌菌株或毒素治疗保留较少的蛋比对照组的。尤其是在这种情况下,后续的育雏规模试验应该做的。育雏大小分析量化产卵的数量超过蠕虫的生殖寿命4 </sup>。如果在实验组和对照组中的蠕虫卵的大小是相同的,然后在卵性差异可以归因于不同的产蛋行为。因为它是不可能的,轻度致病性大肠杆菌菌株,如粪将采取行动,增加产蛋量,它是合理的假设,增加蛋保留曝光后E.粪肠球菌 ( 如图3所示),减少产卵行为的结果。
EIW检测也没有确定的机制,可能会改变细菌蛋保留。这可能是C。线虫可保留鸡蛋,因为致病细菌殖民和阻塞张口或影响喂养,因为它是一个贫穷的食物来源。另外,也可以细菌定植和阻止外阴部的开口,或在产蛋系统,影响细胞的功能。需要进一步分析,以确定机制WHICH蛋保留被改变。
此EIW法可以很容易地修改,以确定影响的许多类型的化合物对蛋保留。另外,该测定是很简单的,它可以被纳入画面中,在主机( 秀丽隐杆线虫 ),或病原体( 粪肠球菌 ),所需的病原体的影响,以确定基因。 EIW测定,也可用于筛选调节产蛋本身所需的基因。C.线虫产卵的行为是由神经递质,如5 -羟色胺和乙酰胆碱的5-9调制,一些神经元和肌肉群12需要的协调的活动。 EIW检测一直继续被使用,以确定基因重要的神经递质的信号和/或肌肉活动。 EIW检测提供一个定量的,而不是定性分析中的一个重要C.线虫的行为。
The authors have nothing to disclose.
Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
<em>C. elegans</em>, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
Culture plates for <em>C. elegans</em> | Tritech Research Inc. | T3308 | |
Culture plates for <em>E. faecalis</em> | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
<em>E. coli </em>(OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
<em>E. faecalis</em> strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
<p>all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified <span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars </span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed </span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP </span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains </span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p> | |||
Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
Yeast extract | Acros | 61180-1000 |