使用产卵滞留实验测量细菌对C. Elegans行为的影响

摘要

卵在虫体内（EIW）检测是一种用于量化产卵行为的有效方法。产卵行为的改变可能是模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）对潜在有害环境物质（如致病菌产生的物质）所表现出的行为反应。

摘要

C. elegans 的产卵行为会受到渗透压¹和振动²等环境信号的影响。在完全缺乏食物的情况下，C. elegans 也会停止产卵，并将已受精的卵滞留在子宫内³。然而，不同类型的食物来源，特别是致病性细菌，尤其是Enterococcus faecalis，对产卵行为的影响尚不明确。卵滞留于虫体（EIW）检测法是一种有效的工具，可用于量化不同类型细菌（在此为E. faecalis）对产卵行为的影响。

排卵滞留（EIW）检测通过计数C. elegans⁴子宫内滞留的卵数量来进行。该检测首先对处于特定发育阶段的成年雌雄同体C. elegans进行漂白处理，以去除其角质层，并将滞留在体内的卵与虫体分离。在漂白前，线虫需暴露于细菌（或任何类型的环境刺激）中一段固定时间。漂白后，可非常容易地计数线虫子宫内滞留的卵数量。在此检测中，暴露于E. faecalis后卵滞留量的可量化增加能够被轻松测定。EIW检测是一种行为学检测方法，可用于筛选潜在的致病性细菌或环境中是否存在毒素。此外，由于产卵行为受到5-羟色胺和乙酰胆碱等神经递质的调控^5-9，EIW检测也可用于筛选影响神经递质信号通路的药物。

引言

Caenorhabditis elegans 是一种微小的自由生活的线虫，因其透明的解剖结构、明确的发育过程、完全测序的基因组、较短的世代周期以及与人类基因的高度同源性，长期以来被用作研究发育和细胞信号传导过程的模式生物。近年来，C. elegans 也已成为环境毒理学和先天免疫研究领域的模式生物^{10, 11}。

这些能够自体受精的雌雄同体线虫在从卵孵化后两到三天内即达到性成熟。在其生命周期中，C. elegans 经历四个幼虫阶段（L1-L4），然后进入成虫期。一只单独隔离的雌雄同体个体在生殖高峰期的三天内平均可产生约300个后代。在生殖成熟的 C. elegans 雌雄同体个体中，受精卵在产出前会在子宫内保留数小时。在任一时刻（处于生殖高峰期时）子宫内正常储存的卵数量为十至十五个¹²。子宫内卵的数量取决于产卵速率和排卵速率的共同作用。受精卵通过围绕阴门开口排列的十六个阴门肌的收缩从子宫排出¹³。雌雄同体特异性运动神经元（HSN）和VC运动神经元与阴门肌形成突触，影响肌肉收缩，从而调控产卵行为^5,7,13,14。卵从子宫的排出依赖于神经元与肌肉的协调活动。

实验室培养的 秀丽隐杆线虫 通常以非致病性饮食饲养 大肠杆菌 OP50。在自然环境中， 秀丽隐杆线虫 接触到各种食物来源，例如可能有害的致病菌。当暴露于环境中的有害物质时 秀丽隐杆线虫 保留卵子直至环境变得更有利。这种滞卵现象可能是为了保护其后代。

在此项虫卵实验（EIW）中， 秀丽隐杆线虫 暴露于潜在致病细菌， Enterococcus faecalis，存在于环境中。接触具有致病性的形式可能导致 E. faecalis 可导致持续性肠道感染，甚至死亡 秀丽隐杆线虫¹⁵暴露于其他形式的致病菌已被证明会影响卵子滞留^16,17，但该效应未被量化。此外，轻度致病性菌株的影响 E. faecalis，尚未研究非立即致死的菌株对产卵行为的影响。

EIW 检测通过计数保留在 C. elegans⁴ 子宫内的卵的数量来进行。尽管 C. elegans 是透明的，但在完整动物体内积聚的卵仍可能难以定量。EIW 检测包括对暴露于细菌一定时间的成年 gravid C. elegans 进行漂白处理。漂白液可溶解虫体的外部角质层，而将卵保留下来。由于具有保护性卵壳，卵对漂白作用具有抗性。漂白处理后，可非常容易地计数从线虫子宫中释放出的卵的数量。

本实验方法是一种简单、经济且快速的定量手段，用于测定某一时间点子宫内卵的数量，从而量化E. faecalis对卵滞留的影响。该方法也可用于评估其他类型细菌、环境毒素或药物对卵滞留的作用。此外，该实验还有望作为细菌致病性的筛选工具。

方案

1）线虫生长培养基（NGM）的制备

1. 制备 50 个平板，将 1.5 g NaCl、8.5 g 超纯琼脂和 1.25 g 蛋白胨加入 1 L 锥形瓶中。
2. 向锥形瓶中加入 487.5 ml 去离子水（dH₂O），轻轻旋转混匀，并用铝箔覆盖瓶口。
3. 在标准条件下（121 psi，120 °C，20 分钟）高压灭菌溶液。
4. 将溶液置于水浴中冷却至 45 °C。
5. 按以下顺序向溶液中添加试剂：500 µl 胆固醇（来自 5 mg/ml 的乙醇储备液），500 µl 1 M CaCl₂，500 µl 1 M MgSO₄，以及 12.5 ml KPO₄ 缓冲液（将 54.15 g KH₂PO₄ 和 17.8 g K₂HPO₄ 溶于 500 ml dH₂O 中），具体配制方法见文献¹⁸。
6. 使用无菌移液器将 10 ml 琼脂溶液加入每个 60 mm 聚苯乙烯培养皿中。于室温静置过夜，使培养基完全凝固。

2）B肉汤 E. coli 培养基的制备

1. 制备五份100 ml培养液，将5.0 g胰蛋白胨、2.5 g酵母提取物和5.0 g NaCl加入烧杯中。
2. 加入无菌蒸馏水至终体积为500 ml。在加热板上边搅拌边加热溶液，直至溶质完全溶解。
3. 将100 ml B肉汤分装至五个玻璃瓶中（每个容量至少200 ml）。
4. 在标准条件下（121 psi，120 °C，20 min）高压灭菌溶液。
5. 使用前让B肉汤冷却至室温。

3) 接种 C. elegans 维持培养板

1. 在室温下使NGM平板干燥至少一周后，取几环大肠杆菌（E. coli OP50）菌落接种至100 ml的B肉汤培养基中。
2. 将大肠杆菌（E. coli）培养物于37 °C过夜培养。
3. 用移液器吸取一到两滴（约100 µl）OP50菌液，滴加到每块NGM平板的中央。平板通常堆叠放置，皿盖朝上。在移液（接种）时，应从堆叠最底部的平板开始，逐层向上操作。接种后尽量不要移动平板，以确保菌液不会过于靠近平板边缘。
4. 接种后的平板在使用前需于室温下干燥至少一周。
5. 接种后的平板倒置存放于密封的塑料容器中，室温保存。

4) 维持 C. elegans 品系

1. 为保持秀丽隐杆线虫（C. elegans）种群的良好喂养状态，每隔3-4天使用线虫挑针将三只L4期幼虫或产卵成虫转移至新的接种NGM平板上。
2. 将平板倒置存放，最好置于15–22 °C的培养箱中。本实验所描述的培养物均在20 °C下保存。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的发育具有温度依赖性。随着培养温度升高，各发育阶段之间的时间缩短。

5) 胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）E. faecalis 培养基的制备

1. 制备 50 个平板，量取 500 ml 无菌蒸馏水加入锥形瓶中，在电热板上边搅拌边加热至沸腾。
2. 向锥形瓶中加入 20 g 粉末状 TSA 琼脂，使溶液充分溶解。
3. 在标准条件下（121 psi，120 °C，20 min）高压灭菌溶液。
4. 将溶液置于水浴中冷却至 45 °C。
5. 使用无菌移液管，向每个 60 mm 聚苯乙烯培养皿中加入 10 ml 琼脂溶液。于室温下静置过夜，使培养基完全凝固。

6) 胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）E. faecalis 培养基的制备

1. 为制备 250 根培养管，量取 500 ml 无菌蒸馏水加入烧瓶中，并在加热板上加热至温热 同时搅拌。
2. 向烧瓶中加入15 g TSB琼脂粉末，并使其溶解。
3. 在标准条件下（121 psi，120 °C，20 min）高压灭菌溶液以灭菌。
4. 让溶液冷却至室温，然后用移液器将2 ml转移至无菌的5 ml试管中。

7) 含链霉素的脑心浸液（BHI）培养基的制备，用于 E. faecalis 培养

1. 量取 500 ml 无菌蒸馏水倒入烧瓶中，在加热板上边搅拌边加热至沸腾。
2. 向烧瓶中加入 26 g BHI 培养基，使溶液充分溶解。
3. 在标准条件下（121 psi，120 °C，20 min）高压灭菌溶液。
4. 将溶液置于水浴中冷却至 45 °C。
5. 采用无菌操作技术，加入 0.5 ml 浓度为 10 mg/ml 的链霉素储备液，轻轻旋转混匀。
6. 将 10 ml 溶液加入每个 60 mm 的聚苯乙烯培养皿中。
7. 静置于室温下过夜，使培养基完全凝固。将平板倒置存放于 4 °C，直至使用前数小时取出。

8) 维持 E. faecalis 菌株

1. 为保存粪肠球菌（E. faecalis）菌种，使用无菌接种环将单个菌落划线接种至不同的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上。
2. 在37 °C条件下培养过夜。将平板倒置后放入密封袋或密封盒中，于室温保存数周。

9) 为 EIW 检测准备 E. faecalis 平板

1. 取一环粪肠杆菌（E. faecalis）单菌落接种于2 ml TSB培养基中，37 °C过夜培养。
2. 用移液器将20 µl粪肠杆菌（E. faecalis）培养物加至已制备好的含链霉素BHI平板中央，37 °C过夜培养。

10) 为 EIW 检测（对照平板）准备 E. coli 平板

1. 取一环 E. coli OP50 菌落接种于 100 ml LB 培养基中，37 °C 过夜培养。
2. 用移液器吸取 20 µl OP50 菌液，滴加至未接种的 NGM 平板中央，室温下静置过夜，使菌液自然干燥。

11) 蛔虫卵检测实验

1. 挑选15-20只处于L4期的线虫（C. elegans）（图1），转移至已准备好的含BHI-Strep-E. faecalis细菌菌苔的培养皿中央。注意避免将大量OP50带入BHI平板。同时，将相同数量的L4期线虫转移至对照NGM-OP50平板。
2. 将平板在20 °C条件下培养40小时。
3. 配制20%次氯酸钠溶液。将市售漂白剂（含6.0%次氯酸钠）与适量蒸馏水混合。
4. 在塑料皿盖（线虫或细菌培养皿的盖子）上选取十个不同位置，各加入10 µl漂白液液滴。
5. 使用线虫挑取工具，将一只线虫转移至每个漂白液滴中。轻轻旋转挑针尖端，确保线虫完全脱离针尖（可通过体视显微镜观察液滴确认）。
6. 静置约10分钟，使线虫角质层溶解，直至线虫破裂并释放出卵（图2）。注意避免将平板上的卵直接带入。
7. 在体视显微镜下，计数每个漂白液滴中的卵数。

结果

该实验可用于定量秀丽隐杆线虫（C. elegans）在暴露于粪肠球菌（E. faecalis）后体内滞留的卵的数量。将处于L4期的线虫（其特征为阴门上方有透明的空腔，见图1）暴露于E. faecalis并持续培养至成虫期。在暴露于E. faecalis四十小时后，进行漂白处理。当角质层在漂白液滴中解体后，滞留的卵变得更为明显（图2）。通过体视显微镜观察，可轻松计数滞留卵的数量。

存在时保留了更多的卵 E. faecalis 与所测试的菌株相比 E. coli OP50 对照组图3）。同一种菌株的作用效果存在一定差异 E. faecalis 在单个蠕虫上的差异，如误差线所示。然而，菌株的影响 E. faecalis 在蠕虫群体中，卵滞留现象相较于对照组存在显著差异。不同菌株所引发的卵滞留程度 E. faecalis 测试结果...

讨论

成功进行本实验最关键的步骤包括：1）使用营养充足的秀丽隐杆线虫（C. elegans）种群，2）在实验平板上培养单一类型的细菌，3）准确鉴定处于L4期的线虫用于暴露于粪肠球菌（E. faecalis），4）在所有试验中保持暴露于粪肠球菌（E. faecalis）的时间一致，以及5）漂白时间不应超过十分钟，以防止卵的解体。

进行该实验时，选择健康且营养充足的线虫至关重要。母体饥饿会影响后代的繁殖力和生长发育^19,20，因此在进行本实验前，线虫需经过多代的良好喂养。通过每隔2-3天将少量成虫转移至新的接种NGM平板上，即可轻松维持营养充足的线虫种群。在实验开始前两天，应将成虫放置于新鲜的OP50菌苔上，以确保实验时有足够数量的L4期子代可供使用。

EIW 检测板还必须能够仅促进一种类型细菌的生长。E. faecalis 菌株在 BHI 平板上培养。在平板中添加链霉素，以筛选去除随 L4 期线虫从维持用 NGM 平板转移至检测平板时带入的 ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂，超纯	Affymetrix	10906
Bacto Peptone	Becton Dickinson	211677
Bacto 胰蛋白胨	Becton Dickinson	211705
脑心浸液脱水培养基	卡罗来纳生物供应公司	781781
秀丽隐杆线虫，N2品系	秀丽隐杆线虫遗传学中心		http://www.cbs.umn.edu/cgc
胆固醇	Alfa Aesar	A11470
用于培养的培养皿 秀丽隐杆线虫	Tritech Research Inc.	T3308
用于培养的培养皿 E. faecalis	Fisher Scientific-Fisherbrand	875713
E. coli OP50	秀丽隐杆线虫遗传学中心		http://www.cbs.umn.edu/cgc
E. faecalis 菌株			由 J. Middleton 提供。所有分离株均被确认为肠球菌
通过观察在肠球菌选择性琼脂（Enterococcosel Agar，BBL）和含6% NaCl的肉汤中的生长情况；
所有菌株均在44.5℃下生长 ºC，并且过氧化氢酶阴性且水解七叶灵。一种简化的 基于色素产生和六种糖发酵反应的二分检索表 （阿拉伯糖、甘露醇、甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷（MGP）、核糖、山梨糖和山梨醇）允许 所有疑似鉴定 E. faecalis 菌株（Efs 缺乏色素且不利用阿拉伯糖，MGP 山梨糖阴性，山梨醇、甘露醇和核糖阳性。所有疑似Efs菌株 使用API 20 STREP系统（Biomerieux）进行确认。
显微镜	Motic	SMZ 168B	任何具备透射照明和50倍放大功能的显微镜均应足够使用
硫酸链霉素	Fisher BioReagents	BP910-50
胰蛋白胨大豆琼脂（大豆-酪蛋白消化物琼脂培养基），Difco	Becton Dickinson	236950
胰蛋白胨大豆肉汤（大豆-酪蛋白消化物培养基），BBL	Becton Dickinson	211768
酵母提取物	阿克罗斯	61180-1000