测量细菌的影响<em> C。线虫</em>行为使用一个鸡蛋保留含量
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Summary
一个鸡蛋在蠕虫（EIW）法是一种有用的方法来量化产蛋行为。产蛋的改变可以是一个模型有机体的行为反应<em>线虫</em到潜在的有害环境的物质，例如由致病细菌产生的。
Abstract
线虫产卵行为是受环境因素如渗透压和振动2。在完全没有食物C.线虫也停止产蛋，并保留受精卵在子宫3。然而，不同来源的食品，特别是病原细菌，特别是粪肠球菌 ，对产卵行为的影响没有得到很好的特征。蛋在蜗杆（EIW）法是一种有用的工具，不同类型的细菌的影响量化，在这种情况下， 大肠杆菌粪，产蛋行为。
EIW检测涉及计数鸡蛋的数量保留在子宫C.线虫 4。 EIW检测涉及漂白上演，妊娠成人C.线虫去除角质层，从动物中分离保留的鸡蛋。在漂白之前，蠕虫暴露于细菌（或任何不同的环境线索）一段固定的时间。漂白后，一个是很容易能够指望鸡蛋保留子宫内蠕虫的数量。在这个实验中，一个量化的增长后，在鸡蛋保留E.粪曝光可以很容易地测量。的的EIW测定试验，可用于筛选潜在致病细菌或环境毒素的存在是一种行为。此外，EIW检测可能是一个工具，屏幕药物，影响神经递质的信号，因为产卵的行为是由神经递质，如5 -羟色胺和乙酰胆碱的5-9调制。
Introduction
一个微小的，自由生活的蛔虫， 线虫 ，是一种模式生物，传统上用来研究人类发育和细胞的信令流程，因为透明解剖特征的发展，全基因组测序，短代时，基因的同源性。最近，C.线虫已经成为一种模式生物在该领域的环境毒理学和先天免疫10，11。
这些自我施肥雌雄同体蠕虫从卵孵化后的两到三天内性成熟。在它的生命周期，C.线虫通过四个幼虫阶段（L1-L4），达到成年之前。可以产生一个孤立的雌雄同体，平均300个后代在三天之内的峰值繁殖力。在生殖成熟C.线虫雌雄同体，受精卵在子宫内保留几个小时前被解雇。该存储在子宫中的蛋在任何一个时间的正常数量的（在繁忙繁殖力）是在10和15之间12。鸡蛋在子宫产蛋率和产蛋率的函数。受精卵从子宫排出，外阴13日开幕的周围布置的16个外阴部肌肉的收缩。的雌雄同体特定运动神经元（HSN）和VC影响肌肉收缩阴部肌肉的运动神经元突触上，从而鸡蛋产蛋行为5,7,13,14。驱逐鸡蛋从子宫的发生是由于神经元和肌肉的协调活动。
C.实验室培养线虫通常提出非致病性大肠杆菌 OP50的饮食。在自然环境中，C。线虫接触到的各种食物来源，如致病性细菌，也可以有潜在危害。当暴露于有害物质的的环境中，C。线虫保留鸡蛋，直到环境变得更加有利。据推测，这鸡蛋保留是为了保护他们的后代。
在这个蛋虫（EIW）测定，C.线虫暴露于潜在的致病细菌， 粪肠球菌 ，这是存在于环境中。 大肠杆菌致病形式曝光粪可引起持续性肠道感染，甚至死亡，在C线虫 15。暴露于其他形式的致病性细菌已被证明影响蛋保留16,17，但是没有量 化的效果。此外，轻度致病性菌株的大肠杆菌的效果肠球菌 ，菌株不会立即致命，产蛋行为还没有被研究。
EIW检测涉及计数鸡蛋的数量保留在子宫C.线虫 4。尽管C。线虫是透明的，积聚在子宫的卵可以是难以量化，在一个完整的动物。 EIW检测涉及漂白妊娠成人C.线虫暴露于细菌一段固定的时间。漂白粉溶液溶解身后留下的鸡蛋外被角质层。鸡蛋是折射的漂白剂，由于存在保护蛋壳的效果。漂白后，能够非常容易地发布从子宫的蠕虫后漂白的鸡蛋的数量来计算。
检测是一种简单，廉价和快速的方法来量化在子宫内一次鸡蛋的数量，从而量化的影响E.粪蛋保留。本试剂盒可用于其他类型的细菌，环境毒素或药物的效果进行量化的蛋性。本试剂盒也有可能被用作细菌致病性的屏幕。
Protocol
1）制备线虫生长培养基（NGM） 为了使50板，加1.5克氯化钠，8.5克超纯琼脂和1.25克蛋白胨1 Lflask的。 DH 2 O添加487.5毫升的烧瓶。轻轻摇晃混合覆盖开幕烧瓶用一块铝箔。 消毒的解决方案，通过在标准条件下高压灭菌（121磅，120℃，20分钟）。 让溶液冷却至45℃的水浴中。 要解决方案，添加下面的顺序:500微升胆固醇5毫克/毫升原液（溶解在乙醇中），500微升1 2 M的氯化钙，500微升1 M 硫酸镁和12.5毫升KPO 4缓冲液（54.15克KH 2 PO 4和17.8克K 2 HPO 4 500毫升蒸馏水2 O）中所描述的18。 使用无菌移液器，加10毫升琼脂溶液各60毫米的聚苯乙烯培养皿。允许介质在室温下固化overn洞察力。 2）制备的B肉汤E.大肠杆菌媒体五个100毫升文化，加2.5克酵母提取物，蛋白胨，5.0克氯化钠5.0克到烧杯中。 添加无菌蒸馏水至终体积为500ml。在热板上加热溶液，边搅拌，直至溶解溶质。 分为五个玻璃瓶（至少200毫升）倒入100毫升的B肉汤。 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。 允许乙肉汤冷却至室温后再使用。 3）播种C.线虫维护板 NGM板在室温下干燥至少一个星期后，一个100毫升乙肉汤培养物接种的大肠杆菌菌落有几大肠杆菌 （OP50）。 E.成长菌在37℃过夜。 吸取1滴（约10081，L）OP50文化到每个NGM板的中心。片通常叠盖侧。移液时（播种），开始在堆栈的底部吹打文化上板。您的工作方式，每个堆栈。尽量不要移动的板，因为它是重要的文化太靠近板的边缘后播种。 允许种子板在室温下干燥，在使用前至少一个星期。 种子板块在密封的塑料容器中，在室温下保存（倒）。 4）维护C.线虫菌株为了维持精心喂养C.线虫股票，使用蠕虫挑L4S或妊娠成人移动到一个新的种子NGM板每3-4天。 商店板（倒）里面最好的孵化器在15 – 22°C。所描述的测定中的培养物储存在20℃下下线虫的发展是温度相关的。由于maintenaNCE温度的升高，发育阶段之间的时间减少。 5）胰酶大豆琼脂（TSA）E.粪文化传媒 50板，测量一瓶500毫升的无菌蒸馏水，把煮沸，一边搅拌，在电炉上。 粉状TSA琼脂20克加入烧瓶，并允许溶液溶解。 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。 让溶液冷却至45℃的水浴中。 使用无菌移液器，加10毫升琼脂溶液各60毫米的聚苯乙烯培养皿。允许介质在室温下固化过夜。 6）胰酶大豆肉汤（TSB）E.粪文化传媒为了使250个培养管，测量到一个烧瓶和温暖的烤盘上，而500毫升的无菌蒸馏水搅拌。 </lI> TSB琼脂粉15克加入到烧瓶中，使粉末溶解。 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。 让溶液冷却至室温，然后移液管2毫升，放入灭菌的5毫升试管。 7）脑心浸液（BHI）媒体，链霉素，E.粪文化测量无菌蒸馏水500毫升的烧瓶中，并把煮沸，一边搅拌，在电炉上。 26克BHI培养基加入到烧瓶中，使该溶液溶解。 在标准条件下高压灭菌（121磅，120°C，20分钟）消毒解决方案。 让溶液冷却至45℃的水浴中。 使用无菌技术，加入0.5毫升10毫克/毫升链霉素的原液和涡流混合。 加入10毫升的溶液，以每60毫米的聚苯乙烯培养皿中。 <l>允许媒体在室温下固化过夜。商店板（倒）在4℃，直到几个小时后再使用。 8）维护E.粪肠球菌 为了维持E。粪股市连胜单独的胰酶大豆琼脂（TSA）平板上的单个菌落，用无菌环。 文化生长在37℃过夜。店板（倒）了几个星期在室温下在密封的袋子或盒子中。 9）准备E.粪板EIW含量的接种2毫升TSB文化的殖民地E.粪肠球菌和孵育过夜，在37°C。 移液管加入20μl 大肠杆菌粪到准备好的BHI链霉素板的中心文化，孵育过夜，在37°C。 10）准备E.大肠杆菌板EIW含量（控制板） 接种了100毫升的B-BRO次文化的殖民地E.大肠杆菌 OP50在37℃孵育过夜吸取20μl的的OP50培养的到非种子选手NGM板的中心和允许种子板在室温下干燥过夜。 11）蛋蠕虫含量挑选15 – 20上演L4 C.线虫 （ 图1）上制备的BHI-链球菌， 大肠杆菌到草坪的细菌的中心粪板。要小心不转让了很多OP50的BHI板的。接送L4S相同数量的到控制NGM-OP50板。 40小时，在20°C孵育板准备20％的漂白粉溶液。的商业漂白剂（6.0％次氯酸钠）混合，用适当体积的蒸馏水。 加入10微升滴漂白剂溶液，以10个不同的位置上的塑料盖（一个蠕虫病毒或细菌板）。 使用蠕虫挑，一个蠕虫传输到每个漂白下降。轻轻旋转的尖端挑中的漂白剂液滴，，确保蠕虫洗掉挑年底（确认在解剖显微镜下观察液滴）。 使角质层溶解约10分钟或直到蠕虫爆裂开来，驱逐鸡蛋（ 图2）。要小心，不要将鸡蛋从板块。 使用解剖显微镜每一滴漂白剂，算上鸡蛋。
Representative Results
此法可以让一个量化C.内保留的鸡蛋数量线虫暴露于E.后粪 。 L4上演蠕虫（特点是透明开放的空间高于其外阴， 图1）暴露于E.粪到成年。经过40个小时的接触E.粪 ，漂白。由于角质层崩解在漂白剂液滴，蛋变得更加明显（ 图2）。保留鸡蛋的数量很容易量化计算，而解剖显微镜下观看。 存在的大肠杆菌中…
Discussion
成功地执行这个实验中最关键的步骤是:1）使用精心喂养C.股票线虫 ，2）单一类型的细菌培养测定板，3）准确吞吐量上演L4蠕虫暴露于E。粪 ，4）保持曝光时间E.粪一致的，所有试验和5），漂白时间不应超过10分钟，以防止鸡蛋解体。
这个实验，重要的是要挑选健康，良好的喂养蠕虫。产妇饥饿会影响后代的繁殖力和生长19,20，因此重要的?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
笔者想感谢6月米德尔顿供给E.粪肠球菌细菌培养和指导。C.线虫提供了CGC，这是由美国国立卫生研究院办公室研究基础设施建设项目（P40 OD010440）。
Materials
| Agar, ultrapure | Affymetrix | 10906 | |
| Bacto Peptone | Becton Dickinson | 211677 | |
| Bacto Tryptone | Becton Dickinson | 211705 | |
| Brain Heart Infusion dehydrated medium | Carolina Biological Supply | 781781 | |
| <em>C. elegans</em>, N2 strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Cholesterol | Alfa Aesar | A11470 | |
| Culture plates for <em>C. elegans</em> | Tritech Research Inc. | T3308 | |
| Culture plates for <em>E. faecalis</em> | Fisher Scientific-Fisherbrand | 875713 | |
| <em>E. coli </em>(OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| <em>E. faecalis</em> strains | provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci | ||
| by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth; | |||
| <p>all strains grew at 44.5 ºC and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified <span style="line-height: 1.6em;">dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars </span><span style="line-height: 1.6em;">(arabinose, mannitol, methyl-α-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed </span><span style="line-height: 1.6em;">presumptive identification of all <em>E</em>. <em>faecalis</em> strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP </span><span style="line-height: 1.6em;">and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains </span><span style="line-height: 1.6em;">were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).</span></p> | |||
| Microscope | Motic | SMZ 168B | any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient |
| Streptomycin sulfate | Fisher BioReagents | BP910-50 | |
| Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco | Becton Dickinson | 236950 | |
| Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL | Becton Dickinson | 211768 | |
| Yeast extract | Acros | 61180-1000 | |
References
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Cite This Article
Gardner, M., Rosell, M., Myers, E. M. Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay. J. Vis. Exp. (80), e51203, doi:10.3791/51203 (2013).