方法文章

农杆菌介导的烟草属植物瞬时蛋白表达的优化与应用

DOI：

10.3791/51204

⸱

2014年4月19日

 ,  ,  , 
1Fraunhofer USA Center for Molecular Biotechnology

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

瞬时蛋白表达在 烟草属 基于真空渗透的植物 农杆菌 携带的启动载体（烟草花叶病毒基于瞬时表达系统的方法是一种快速且经济的疫苗抗原和治疗性蛋白生产途径。我们通过优化细菌培养条件、选择适宜的宿主物种以及共导入RNA沉默抑制子，简化了操作流程并提高了目标蛋白的积累量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

农杆菌介导的植物瞬时蛋白表达是一种在短时间内生产疫苗抗原和治疗性蛋白的有前景的方法。然而，该技术目前才刚开始应用于大规模生产，因为许多制约放大的技术障碍正在被逐步克服。本文展示了一种基于真空浸润的、适用于工业化规模的瞬时蛋白生产的简单且可重复的方法。 烟草属 植物与 农杆菌 携带载体的优化。 农杆菌 在AB培养基中培养可直接用Milli-Q水稀释细菌培养物，从而简化浸润过程。在三种测试的物种中 烟草属, N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior)被选为最有前景的宿主，因其易于侵染、报告蛋白产量高，且在受控环境条件下生物量产量高出约两倍。诱导 农杆菌 携带 pBID4-GFP（烟草花叶病毒基于化学物质（如乙酰丁香酮和单糖）的处理对蛋白质生产水平没有影响。在50至100 mbar压力下对植物进行30或60秒的浸润，可实现约95%的植物叶片组织浸润。浸润时采用 农杆菌 实验室菌株GV3101的蛋白产量相较于其他菌株最高 农杆菌 实验室菌株LBA4404和C58C1及野生型 农杆菌 菌株 at6、at10、at77 和 A4。共表达病毒RNA沉默抑制子 p23 或 p19，在 N. benthamiana 导致目标蛋白（流感病毒血凝素）更早积累并增加产量（15–25%）。

引言

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目前，植物已被公认为是一种安全、可靠、可扩展且成本低廉的异源重组生物制药和工业蛋白生产平台1-3，相较于微生物和动物细胞表达系统具有重要优势4。植物能够表达正确折叠的蛋白质，并进行翻译后修饰，包括组装成多聚体的抗体5-7。多种来源于植物的重组药用蛋白正在接受临床评估8。这些蛋白包括用于治疗非霍奇金淋巴瘤的患者特异性重组独特型疫苗（scFv）9、基于血凝素的流感大流行及季节性流感候选疫苗10,11（Cummings et al.，已提交至Vaccine），用于治疗龋齿的抗链球菌表面抗原I/II抗体12，以及用于治疗糖尿病的人胰岛素13。此外，用于戈谢病患者酶替代疗法的人重组葡萄糖脑苷脂酶已在以色列和美国获批，并通过扩展使用计划在美国以外地区提供14,15。

异源蛋白可以在稳定转化（转基因或质体转化）或瞬时转化的植物中进行生产。与在转基因植物中生产相比，瞬时蛋白表达具有多项优势，包括实现表达和积累所需时间较短16，并且可通过将细菌双元载体或重组植物病毒载体导入植物组织来实现4。目前最先进的瞬时表达系统基于“启动载体”的使用，该载体结合了植物病毒和双元质粒的元件，并通过农杆菌浸润法递送17,18。基于烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的启动载体经农杆菌浸润后，已在实验室规模成功用于在N. benthamiana叶片中生产针对多种病原体的疫苗抗原，如人乳头瘤病毒19、Yersinia pestis20、甲型流感病毒21,22、Bacillus anthracis23以及天花病毒24。Agrobacterium介导的瞬时表达也是同时生产多种蛋白的一种有前景的方法2,25-27。例如，植物瞬时表达系统已被用于生产肿瘤特异性重组抗体28,29、针对表皮生长因子受体的糖基化重组抗体30，以及特异性识别炭疽保护性抗原的单克隆抗体31,32。将目标基因与基因沉默抑制子共同浸润入Nicotiana benthamiana植物，可显著增强目标蛋白的表达水平33,34。

农杆菌浸润是一种将含有目的基因的细菌均匀导入植物组织的常用方法35-37. 真空浸润 农杆菌 在完整植物叶片中进行瞬时基因表达是生产外源蛋白的一种快速、可扩展且实用的方法，无需创制转基因植物38-41在真空农杆菌浸润过程中，将植物倒置，使地上部分浸入 农杆菌 悬浮液。随后施加真空，使气体通过气孔从叶片的细胞间隙中排出。释放真空后迅速重新加压，导致液体浸入叶片细胞间隙。 农杆菌 将悬浮液注入叶片。在真空渗透后 农杆菌，之后继续培养植株并监测目标蛋白的表达。使用双元载体时，目标蛋白表达水平通常在侵染后2-3天达到最高；使用启动载体时，则在侵染后4-7天达到峰值，随后表达水平通常逐渐下降17,18,42-45. 根癌农杆菌 是将目的基因导入植物以进行蛋白生产的最常用载体。农杆菌浸润法在植物中效果极佳。 N. benthamiana 但在包括大多数其他植物中则相对较差， 拟南芥46.

在本研究中，我们建立了一种简单、高效且经济的瞬时蛋白表达方法，适用于5–6周龄 N. benthamiana 使用 A. tumefaciens 浸润。农杆菌浸润技术在工业化放大的主要缺点是需要对收获的细菌进行离心，并将细菌沉淀重悬于含有4'-羟基-3',5'-二甲氧基苯乙酮（乙酰丁香酮）、单糖以及2-(N-吗啉代）乙磺酸（MES）缓冲液用于诱导 病毒 基因。我们通过优化已能够克服这些问题 农杆菌 在AB培养基（最小培养基）中培养后，直接用Milli-Q水稀释，并控制侵染时长和条件。我们还比较了在野生型烟草宿主物种中目标蛋白的表达水平 N. benthamiana 和 N. excelsior，以及在杂交种中 N. excelsiana.

方案

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1. 植物培养

为了后续的农杆菌浸润实验，我们评估了两种野生型Nicotiana物种（N. benthamiana和N. excelsior）以及一种杂交种（N. excelsiana），这些植物均在室内设施中采用岩棉水培方式培养。

  1. 将岩棉板浸泡在植物肥料溶液中。
  2. 在已吸收养分的岩棉表面播种野生型 N. benthamiana、N. excelsior 以及 N. excelsiana（N. benthamiana × N. excelsior 的杂交种）的种子。
  3. 在受控条件下培养种子（24 °C，相对湿度40-65%），采用长日照光周期（光照14小时，黑暗10小时，光照强度为130-150 μE m-2 sec-1），N. benthamiana 和 N. excelsiana 培养4-5周，N. excelsior 培养5-6周。

2. 农杆菌浸润载体的构建

  1. 分别将合成报告基因（绿色荧光蛋白 [GFP]）、来自流感病毒株 A/California/04/2009 的全长血凝素（HA）（HAC1）以及重新设计的地衣酶（LicKM）18 插入启动载体 pBID418（基于烟草花叶病毒的载体）中，获得 pBID4-GFP、pBID4-HAC1 和 pBID4-LicKM 分别对应18,32,41,47。
  2. 将 10–50 ng 携带 GFP 或 HAC1 的 pBID4 载体导入农杆菌 A. tumefaciens 菌株 GV3101 的电感受态细胞中，将 LicKM 导入农杆菌 A. tumefaciens 菌株 GV3101、C58C1、GLA4404、At06、At10、At77 和 A4 的电感受态细胞中，使用基因 MicroPulser 电穿孔仪完成转化。
  3. 除非另有说明，使用转化后的 Agrobacteria 进行侵染实验。

3. 真空浸润 农杆菌 进入 烟草属 植物

  1. 培养 A. tumefaciens 在LB培养基、YEB培养基或AB培养基中加入50 mg/L卡那霉素，于28 °C、200-250 rpm振荡条件下过夜培养菌株。
  2. 稀释 农杆菌 在600 nm处的光密度（A）用Milli-Q水将溶液调至6000.5 的光密度或离心 农杆菌 在LB、YEB或AB培养基中培养的细胞，4,000 × 4 °C下离心10 min，弃上清，用诱导培养基（1× MS盐，10 mM MES，200 µM乙酰丁香酮，2%蔗糖 [MMA]）重悬至A600 0.5，并在室温下搅拌1-3小时，除非另有说明。
  3. 在真空室中通过浸没法渗透植物 烟草属 植物地上组织 农杆菌 悬浮并施加50-400 mbar的真空压力，持续30或60秒。通常在50-100 mbar压力下持续60秒以实现最佳渗透效果。
  4. 真空解除后，将植物从真空室中取出，用水冲洗，并在与浸润前相同的生长条件下培养5-7天。
  5. 测试诱导化学物质的功效 农杆菌 vir基因，添加不同浓度的乙酰丁香酮（0、100、200 或 400 µM）至 农杆菌 悬浮于侵染缓冲液（1x MS、10 mM MES、2% 葡萄糖）中。为考察单糖对vir基因诱导的影响，向缓冲液中分别添加不同浓度的葡萄糖（0、1、2 或 4%）。 农杆菌 悬浮于侵染缓冲液（1x MS，10 mM MES，200 µM 乙酰丁香酮）中。 N. benthamiana 植物按上述步骤3.3和3.4进行侵染。
  6. 农杆菌 实验室菌株GV3101、C58C1和LBA4404，以及携带pBID4-LicKM载体的野生型菌株A4、At06、At10和At77，用Milli-Q水稀释至A600 0.5。 N. benthamiana 按照上述步骤3.3和3.4，用每种特定菌株对植物进行侵染。

4. 病毒沉默抑制子的共农杆菌渗透实验步骤

  1. 按 1:1、2:1、3:1 和 4:1 的比例混合携带 GFP 基因的 Milli-Q 水稀释的 Agrobacterium GV3101 菌液与携带番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV）的病毒沉默抑制子 p19 的菌液。按上文所述方法侵染 N. benthamiana 植株。
  2. 将两种经 Milli-Q 水稀释的 Agrobacterium GV3101 菌液混合后侵染 N. benthamiana 植株：第一种携带 pBID4-HAC1 质粒，第二种携带任一沉默抑制子——TBSV 的 p19 或柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus）的 p23，分别位于 pCassp 质粒（pCassp19）和 pGR 双元质粒的 35S 启动子下游（pGR-P23），混合比例为 4:1。

5. 蛋白质印迹分析

  1. 从植株上随机采集叶片样本 N. benthamiana，N. excelsior 或 N. excelsiana 在接种后4-7天采集植株，于液氮中研磨成细粉。
  2. 向每个样本中加入三倍体积的含0.5% Triton X-100的1×PBS缓冲液。
  3. 在 4 °C 条件下轻轻振荡提取的样品 15 分钟。
  4. 离心提取物5分钟，收集总可溶性蛋白至新的离心管中。
  5. 将提取物用1× PBS提取缓冲液稀释至适当浓度（1:50 至 1:100），并加入5×上样缓冲液（250 mM Tris-HCl [pH 6.8]、10% SDS、0.5%溴酚蓝、50%甘油 v/v 和 500 mM DTT），使终浓度为1×。
  6. 将样品煮沸5分钟。
  7. 使用10% SDS-PAGE分离蛋白质，转移至Immobilon-P转印膜，并用0.5% I-block封闭。
  8. 使用兔多克隆抗GFP抗血清（1:5,000）和小鼠抗多聚组氨酸单克隆抗体（1:1,000）在封闭液中孵育1小时，以检测GFP和HAC1。
  9. 一抗孵育后，用1× PBST-20洗涤膜三次，每次10分钟，随后分别加入1:5,000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记抗兔抗体（用于GFP检测）或1:10,000稀释的HRP标记抗小鼠抗体（用于HAC1检测），室温孵育1小时。
  10. 使用 SuperSignal West Pico 化学发光底物处理 Western 印迹。
  11. 使用 GeneTools 软件分析蛋白条带强度，并获得条带校准定量结果。

蛋白质产量计算公式：（校准量 × 样品稀释倍数）/ 上样量）× 4 = mg/kg。
公式说明：蛋白质产量（P），校准量（C），样品稀释倍数（D），上样量（S）。

6. 酶谱分析

  1. 采集经 pBID4-LicKM 浸润的 N. benthamiana 随机组织样本。
  2. 采用上述用于 Western blot 分析的相同方法提取蛋白质，然后通过含有 0.1% 地衣多糖的 10% SDS-PAGE 进行分析。
  3. 电泳结束后，用洗涤缓冲液（100 mM Tris-HCl [pH 8.0] 和 0.1% Triton X-100）洗涤凝胶两次，每次 10 分钟，随后在 65 °C 的洗涤缓冲液中孵育 1 小时。
  4. 孵育后，弃去洗涤缓冲液，在室温下用 0.5% 刚果红染色 5 分钟。
  5. 用 Milli-Q 水冲洗凝胶三次，每次 10 分钟，然后加入 1 M NaCl 以显色地衣酶活性。纯化的细菌地衣酶蛋白作为酶活性的阳性对照。

7. GFP 成像

  1. 使用手持式长波长紫外灯对瞬时转化的完整植株进行GFP荧光的目视检测。
  2. 通过Yellow 8, ES 52滤光片，用数码相机拍摄瞬时转化植株的图像（曝光时间15秒）。
  3. 使用GeneGnome设备上的GeneSnap软件获取Western印迹分析图像，并利用GeneTools软件进行结果定量，定量依据为纯化的GFP标准品绘制的校准曲线。
  4. 使用基于流感病毒A/Indonesia/05/05株纯化HAC蛋白标准品绘制的校准曲线，对HAC1蛋白进行定量。
  5. 所有实验均基于3–4个重复样本计算平均值。

结果

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植物生长的营养需求。 使用水培植物生长介质（岩棉）和营养液可确保N. benthamiana生长的一致性，并避免使用土壤进行植物栽培时存在的机械、调控和效率方面的复杂性。我们将在商业肥料溶液中浸泡过的岩棉板上种植N. benthamiana，以确定植物生长和生物量积累的最佳条件。我们观察到种子发芽率为95-100%。需要注意的是，磷元素的添加对实现发芽至关重要，因为我们发现缺乏磷的营养液无法支持N. benthamiana种子的发芽和生长（图1A）。

影响 农杆菌 生长与侵染培养基对植物健康及蛋白质生产的影响 我们测试了多种培养基条件，以优化农杆菌浸润技术在大规模生产中的效率。细菌（A. tumefaciens GV3101菌株（携带pBID4-GFP质粒）在不同培养基条件（YEB、LB或AB）下过夜培养，随后离心并重悬于诱导培养基（MMA）中（含1× Murashige & Skoog [MS] 基本盐混合物，10 mM MES，pH 5.6，20 g/L 蔗糖 200 µM 乙酰丁香酮）或用超纯水稀释至A600 在用于植物浸润前，将菌液稀释至光密度值为0.5。我们观察到，将细菌用水稀释后对植物进行真空浸润，所得蛋白表达水平与以往文献报道中使用任何浸润培养基所达到的水平相当。42,48。相比之下，使用未稀释的 农杆菌 在 YEB 或 LB 培养基中培养导致完全萎蔫 N. benthamiana 接种后24小时内叶片出现症状，而未稀释的 农杆菌 在AB培养基中培养对侵染植物的健康状况无影响（数据未显示）。如图所示 图1B，用……侵染的植物 农杆菌 在 YEB、LB 或 AB 培养基中培养的菌液，用 Milli-Q 水稀释（1:5，A600 0.6–0.8 或 1:10，A600 OD值为0.3–0.4时）未表现出任何症状，GFP平均表达量分别为1645、1520和1839。 农杆菌 离心并重悬于诱导培养基（MMA）中后，未表现出任何症状，且蛋白质产量与对照组相比无显著差异 农杆菌 直接用 Milli-Q 水稀释（分别为 1671 ± 102 和 1667 ± 131 mg/kg）。因此，建议使用 Milli-Q 水进行稀释 农杆菌 用于植物浸润的培养物，并在后续实验中常规使用以达到A600 0.5

Effects of 农杆菌 悬浮细胞密度与靶标表达的时间进程。 接下来，我们检测了细菌细胞密度是否影响侵染效率及目标蛋白的表达水平。为此，我们评估了四种不同细胞悬浮液密度的 农杆菌 携带 pBID4-GFP，A600 1.0、0.5、0.1 和 0.05。浸润后 N. benthamiana 对植株进行监测，通过在接种后4、7和10天采集样本，观察其可见症状的发展以及目标基因表达的时间进程。在接种后4天，我们观察到用不同细胞悬浮液密度浸润的植株之间GFP荧光存在明显差异。 农杆菌 （未观察到A处的GFP表达）600 0.05）。在接种后7天，用细胞悬浮液密度为A的农杆菌侵染的植株中，GFP荧光强度相似600 1.0、0.5 和 0.1，但在 A 值渗透的植株中较低600 0.05。如图所示 图1C，这些数据通过在4 dpi采集的样本进行的蛋白质印迹分析得以证实，显示A组蛋白表达量极低600 0.05（5 mg/kg）时最低，而在 A 处最高600 1.0（1739 mg/kg）。在接种后第7天（7 dpi），植物中估计的GFP产量在A处无显著差异600 1.0、0.5 和 0.1（分别为 1,662、1,870 和 1,890），而 A600 在OD600为0.05时，GFP产量较低（1,199 mg/kg）。相比之下，在接种后10天（10 dpi），用四种不同细胞悬浮液密度接种的植株之间GFP产量无显著差异（分别为1,181、1,197和1,304 mg/kg）。

使用替代菌株进行侵染 农杆菌. 为了增加多样性 农杆菌 可用于瞬时蛋白表达的菌株，我们测试了野生型分离株。这些菌株分离自天然宿主的冠瘿瘤，由Gelvin博士（Purdue University，West Lafayette，Indiana）惠赠。为评估其在瞬时蛋白表达中的应用价值，我们进行了浸润实验。 N. benthamiana 携带 pBID4-LicKM 质粒的以下菌株18: A. rhizogenes （A4）和 A. tumefaciens 野生型Nester菌株A348、A208和A281（分别命名为At6、At10和At77），以及遗传改造的实验室菌株 A. tumefaciens GV3101、C58C1 和 LBA4404。在接种后7天收集侵染的叶片，通过Western blot检测LicKM的表达水平。如图所示 图2A在菌株GV3101、A4和LBA4404中，LicKM的产量最高（分别为~1,750 ± 163、1,650 ± 26和1,450 ± 117 mg/kg），差异较小；在C58C1中表达水平最低（~900 ± 102 mg/kg）；在At6、At10和At77中产量居中（分别为~1,250 ± 19、1,100 ± 42和1,200 ± 111 mg/kg）。通过Zymogram实验检测证实了地衣酶的酶活性。 图2B 表明，使用任一方法在侵染的植物组织中产生的溶菌酶均使其 农杆菌 菌株具有酶活性。还应注意 N. benthamiana 接种A4和At77菌株的植株表现出病理症状（植株矮化、叶柄伸长和卷曲以及叶片卷曲），而接种At10菌株的植株症状较轻。未在 N. benthamiana 接种了实验室菌株GV3101的植物（图2C).

不同 Nicotiana 物种的农杆菌浸润。 我们比较了 Nicotiana 属的两种野生型物种（N. benthamiana 和 N. excelsior）以及一种杂交物种 N. excelsiana（N. benthamiana × N. excelsior）在生物量积累和蛋白表达水平上的差异。在所测试的物种中，N. benthamiana 是利用根癌农杆菌（Agrobacterium）介导或病毒载体表达系统进行瞬时蛋白表达的常用宿主2,34,49，其在萌发后 4–5 周即可达到适合浸润的生长状态。对于 N. excelsiana，获得最佳生物量所需的生长期同样为 4–5 周，而 N. excelsior 则需要更长时间（6–7 周）。此外，与其他 Nicotiana 物种相比，N. excelsior 的植株节间相对较短。

此外，我们观察到，在50-250 mbar的真空度下对N. benthamiana和N. excelsiana进行60秒的真空渗入，可高效实现整片叶片的农杆菌浸润；而N. excelsior由于植株冠层较低且叶片革质，难以进行渗入，即使在添加非离子型表面活性剂（如Sillwet-77或S240）的情况下，重复施加真空三次、每次1分钟，仍效果不佳。同时，N. excelsiana和N. excelsior种子的萌发率约为40-50%；为将萌发率提高至90-100%，播种前需用10%次氯酸钠处理1小时。在相同生长条件下，N. excelsiana所能产生的最高叶片生物量约为N. benthamiana的两倍（表1）。

利用携带 pBID4-GFP 质粒的农杆菌 GV3101 菌株侵染N. benthamiana、N. excelsior 和 N. excelsiana，检测其蛋白表达情况。在侵染后第 7 天（7 dpi），通过紫外光照射整体侵染叶片观察绿色荧光蛋白（GFP）的积累情况，随后进行蛋白质印迹（Western blot）分析。图 3A 显示，N. benthamiana 和 N. excelsiana 中 GFP 分布均匀，而 N. excelsior 中分布不均（这是由于难以完全侵染 N. excelsior 的整个叶片区域所致）。图 3B 展示了在侵染后第 7 天从三种Nicotiana物种中采集的叶片经紫外光照射估算的 GFP 表达水平。N. benthamiana 中的 GFP 积累量（约 2.23 g/kg）高于 N. excelsiana 和 N. excelsior（分别为约 1.89 和 1.54 g/kg）。N. excelsior 中蛋白表达水平较低，是由于侵染不均以及采集叶片中 GFP 积累分布不均所致。

我们观察到，直接暴露在光照下的上部叶片通常比冠层下方的叶片更早且更高水平地表现出瞬时GFP积累（在接种后2-4天），但在我们的研究中，GFP积累在接种后7天达到最高水平，并均匀分布于大部分叶片中，未浸润的新生叶片除外，这些叶片未显示GFP积累。

真空压力和作用时间对瞬时蛋白表达的影响 真空渗透显著提高瞬时表达水平，相较于使用无针注射器手动施加压力的方法42. 施加真空会使气体通过气孔从浸没的植物叶片中排出。当真空被打破且压力迅速升高时，悬浮液的 农杆菌 被驱动进入叶片以替换已抽出的气体50.

为了检验真空压力对叶片的影响 N. benthamiana，我们用以下方法对植物进行了侵染 农杆菌 在不同真空压力（50–400 mbar）下，对携带 pBID4-GFP 的菌株 GV3101 进行 30 或 60 秒的真空渗透。结果表明，在低于 50 mbar 的较强真空条件下处理 30 或 60 秒会导致被渗透叶片发生机械损伤，进而在渗透后 24–48 小时内出现组织萎蔫和植株死亡。相反，在较温和的 400 mbar 真空条件下，仅能实现 50% 叶片面积的渗透，且 GFP 表达水平降低（303 ± 90 mg/kg）。图4A）。重要的是，我们在 50、100 和 200 mbar 条件下观察到 GFP 产量无显著差异（分别为 1,651 ± 107、1,688 ± 40、1,594 ± 26 mg/kg）（图 4A在施加50-200 mbar的真空压力持续30或60秒时，对植物健康的影响轻微或无不利影响。因此，建议在渗透实验中采用50-100 mbar的真空压力。

真空处理时间对目标表达的影响通过浸润一个培养盘来评估 N. benthamiana 每小时用 A 处理植物600 含有 pBID4 的 GV3101 菌株的 0.5 倍量-GFP 处理 8 小时，在相同条件下 农杆菌 培养 图 4B 表明GFP的表达水平在8小时内的各个时间点均相似，提示在此时间段内 农杆菌 保持其启动单链DNA的能力。

化学诱导对蛋白质生产的影响。 某些植物酚类代谢物和糖类可诱导根癌农杆菌（A. tumefaciens）的致病基因1,52。因此，已有多种化学物质和单糖被报道可增强在不同植物物种中的瞬时蛋白质表达。在农杆菌渗入前，通常将乙酰丁香酮添加到A. tumefaciens培养物中以诱导vir操纵子40,53-57。

我们评估了不同浓度乙酰丁香酮（0、100、200 和 400 µM) 和葡萄糖（0-4%）对瞬时GFP蛋白表达的影响 N. benthamiana 浸润有 农杆菌 携带 pBID4 质粒的 GV3101 菌株-GFP。为此，我们重新悬浮 农杆菌 在含有不同浓度乙酰丁香酮和葡萄糖的MMA诱导培养基中培养1–3小时后再进行浸润。根据肉眼观察结果（数据未显示）和Western印迹分析结果（图 4C)，与对照组（诱导培养基中不含乙酰丁香酮或葡萄糖）相比，这些化合物在所测试的浓度下均未引起GFP荧光或蛋白产量的显著增加。

共渗透沉默抑制子对GFP和HAC1基因瞬时表达的影响 N. benthamiana 叶片 此前已证实，共表达一种基因沉默抑制子（p19）可 番茄丛矮病毒 [TBSV] 干扰转录后基因沉默（PTGS），导致报告蛋白的产量增加34.

我们已评估共浸润的影响 N. benthamiana 携带GFP报告基因（pBID4-GFP）和p19的启动子载体。在侵染前，一种A600 0.5 稀释度的 A. tumefaciens 分别将含有 pBID4-GFP 和 p19 的 GV3101 菌株以 1:1、2:1、3:1 和 4:1 的比例混合培养. 沉默抑制子的表达由 花椰菜花叶病毒 35S 启动子。如 7 dpi 时的 Western 印迹分析结果所示（图5A)，p19的存在并未增加或减少GFP的产生 N. benthamiana，无论两者的比例如何 农杆菌 悬浮液。

我们还比较了两种病毒基因沉默抑制子——p23 和 p19——在防止 HAC1 的转录后基因沉默（PTGS）中的作用。将携带启动载体 pBID4-HAC1（H1N1 A/California/04/2009）和两种病毒沉默抑制子质粒之一的 Agrobacterium 菌液稀释至 A600 为 0.5，按 4:1 的比例混合后共注射到 4–5 周龄的 N. benthamiana 植物中。以仅携带 pBID4-HAC1 的 A. tumefaciens 菌液注射作为对照。在接种后 3 至 8 天采集叶片样本，实验重复三次，通过 Western 印迹分析测定 HAC1 表达水平的平均值。

如图5B所示，在6 dpi时，与不使用基因沉默抑制子相比，将p23或p19与N. benthamiana共浸润分别使HAC1的产量提高了(642 ± 157 和 764 ± 108 mg/kg)，提高幅度分别为约15-25%。这表明p23和p19在我们的系统中具有高效性。然而需要注意的是，当pBID4-HAC1与p19共浸润时，HAC1的积累比其他条件提前了一天。因此，我们的结果表明，沉默抑制子p19对HAC1和GFP积累的影响存在差异，提示其可能选择性增强某些蛋白在N. benthamiana中的瞬时表达和/或稳定性。

我们还观察到，无论是否存在基因沉默抑制子，HAC1 蛋白的表达水平均从 7 dpi 开始下降。这表明，在N. benthamiana中通过启动载体侵染介导的瞬时蛋白表达水平下降的时间具有靶标特异性。

Agrobacterium 菌种库携带启动载体，每年均对其目标基因稳定性、Agrobacterium 活性及蛋白积累水平进行评估。经转化并携带 pBID4-HAC1 质粒的 GV3101 菌株甘油保存菌种库在 -80 °C 条件下保存，已证实其稳定性超过三年，在浸润的 N. benthamiana 植物中瞬时蛋白表达水平未发生改变。图5C 显示，通过 Western 印迹法测定 2010、2011、2012 和 2013 年 HAC1 蛋白的产量分别为 670、685、566 和 683 mg/kg。在 N. benthamiana 植物中 HAC1 蛋白的平均产量为 651 ± 49.4 mg/kg。

烟草属物种生物量分析表；叶片和茎的质量计算，含平均值与偏差。
表1. N. benthamiana 与 N. excelsiana 植物生物量产出的比较。

植物生长条件、培养基稀释分析以及凝胶电泳蛋白表达结果。
图1. N. benthamiana中瞬时基因表达的蛋白质印迹分析。（A） 六周龄的N. benthamiana 1）在含4.8%磷的肥料溶液中生长的植株，以及2）在含0%磷的肥料溶液中生长的植株。每道上样量为25 µg鲜叶重等量提取物。（B） 对比经真空浸润携带pBID4-GFP质粒的Agrobacterium GV3101菌株后，GV3101菌液在三种不同培养基（YEB、AB和LB）中培养时GFP的产量。GV3101菌液在YEB或LB培养基中过夜（O/N）培养后，低速离心并重悬于诱导培养基（MMA）中（泳道：MMA-1和MMA-2）；或在YEB、LB或AB培养基中过夜（O/N）培养后，直接用Milli-Q水稀释至1:5或1:10（泳道：YEB/5和YEB/10；AB/5和AB/10；LB/5和LB/10）。（C） 在不同浓度（A600为1.0、0.5、0.1和0.05）的携带pBID4-GFP质粒的A. tumefaciens GV3101菌株真空浸润后，于4、7和10 dpi（接种后天数）检测GFP表达水平的比较。

Agrobacterium strain comparison: bar graph, electrophoresis, plant growth results.
图2. 真空浸润后瞬时地衣酶产生与活性的比较 N. benthamiana 不同菌株的植物 农杆菌. 培养物 农杆菌 菌株（GV3101、A4、At77、C58C1、At6、At10 和 LBA4404）携带启动载体 pBID4-LicKM，分别侵染烟草叶片 N. benthamiana接种后7天采集侵染叶片。 （A） 通过蛋白质印迹法定量测定地衣酶的产生。 (B) 通过酶活性检测展示地衣酶产生的zymogram实验。 (C) 效应 农杆菌 （野生型A4、At10、At77及实验室菌株GV3101）浸润处理 N. benthamiana 7 dpi 时的植物健康状况。二十五 µg 每泳道上样量为等量新鲜叶片重量。

Fluorescent protein expression diagram and Western blot results in Nicotiana species analysis.
图3. 叶片中瞬时GFP表达 N. benthamiana、N. excelsiana 和 N. excelsior 在真空浸润后第7天 A. tumefaciens 含有启动载体 pBID4-绿色荧光蛋白。（A） 在紫外光下观察GFP表达的视觉检测 (B) GFP累积的Western印迹分析

GFP expression analysis, Western blot results, varying mbar/sec, hours, acetosyringone, glucose levels.
图4. (A) 真空压力对瞬时GFP表达及植物健康的影响 N. benthamiana 植物经 pBID4 浸润处理-在400、200、100或50 mbar的真空压力下，真空保持时间为30或60秒时的GFP （B） 稳定性和感染性 A. tumefaciens 在 N. benthamiana 浸润 农杆菌 GV3101 菌株携带 pBID4-GFP，在 AB 培养基中培养并稀释至 A600 0.5。农杆菌浸润通过浸润一个平板进行 N. benthamiana 每小时用相同稀释度的植物 农杆菌 培养（泳道 0-8）。 (C) 不同浓度乙酰丁香酮和葡萄糖对GFP瞬时表达的影响。 农杆菌 携带 pBID4 质粒的 GV3101 菌株-GFP 在 YEB 培养基中过夜培养，离心后重悬至 A600 在含有2%葡萄糖和乙酰丁香酮（浓度分别为0、100、200或）的MMA中，OD600值为0.5 400 µM，或在含有 MMA 的培养基中 200 µM 乙酰丁香酮与葡萄糖在0%、1%、2%或4%条件下的 农杆菌 悬浮液在室温下放置3小时后进行浸润。

Protein analysis: electrophoresis results, GFP protein levels (A); bar graphs (B, C).
图5. 沉默抑制因子对瞬时蛋白表达的影响 N. benthamiana 叶片。（A） 不同比例共浸润pBID4-GFP和p19后GFP蛋白的Western印迹分析。样品于接种后7天收集（7 dpi）25 µg 每泳道上样量为等量鲜叶重量。 (B) 一种培养物 农杆菌 携带 pBID4-HAC1 的菌株分别与携带 p19 或 p23 沉默抑制子质粒的菌株以 4:1 的比例混合培养。所获得的组合为 农杆菌 将菌液通过真空渗透法导入植株。自渗透处理后每日采集HAC1植株的组织样本，直至接种后第8天，用于重组蛋白的定量分析。 (C) 稳定性 农杆菌 细胞库。植物用同一批次的 农杆菌 每年对细胞库进行检测以评估蛋白质积累情况。五十 µg 每泳道上样量为等量新鲜叶片重量。 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中，我们建立了一种简单的农杆菌浸润法，用于在选定的Nicotiana物种中利用携带启动载体的Agrobacterium菌株进行常规瞬时蛋白表达。此外，我们还确定了在该瞬时植物表达系统中实现最高重组蛋白表达水平的最佳条件。

稀释液的真空浸润 A. 根癌农杆菌 含有启动载体 pBID4 的菌株 GV3101 N. benthamiana, N. excelsiana 和 N. 卓越 在7 dpi时，与其他植物物种相比，导致了更高的靶蛋白产量 Pisum sativum 浸润含有GV3101的菌液 苜蓿花叶病毒- 或 黄瓜花叶病毒基于35S启动子驱动GFP报告基因表达的载体41，或  Lactuca sativa, Solanum lycopersicum 和 拟南芥 thaliana 用C58C1菌株侵染 A. tumefaciens 携带β-葡萄糖醛酸酶报告基因57. N. benthamiana 和 N. excelsiana 在50 mbar下真空浸润30-60秒易于操作，浸润效率达到90-95%。剩余5-10%的叶片区域未被浸润，原因是部分叶片在溶液表面漂浮所致 农杆菌 抽真空过程中保持悬浮状态。由于该载体具有细胞间移动的能力18，7 dpi时，整个叶片及叶柄中均出现瞬时蛋白积累。10 dpi时，GFP的表达量略有降低，因为pBID4表达载体可在细胞间移动，但不能进行系统性移动。18；因此，新长出的叶片不含载体，不参与目标蛋白的生产。此外，重组蛋白随时间的降解也可能导致10天时蛋白水平下降。我们的结果表明，农杆菌侵染 A. tumefaciens 菌株GV3101介导的瞬时蛋白高水平表达 N. benthamiana此外，目标蛋白可被设计为与地衣酶（LicKM）、β-1,3-1,4-葡聚糖酶（一种来源于嗜热菌的耐热酶）进行N端、C端或内部融合。 Clostridium thermocellum 并赋予许多目标蛋白融合体热稳定性18浸润 N. benthamiana 与 A. tumefaciens 野生型菌株（at6、at10 和 at77）携带目的基因后表现出轻度或重度症状：叶片卷曲、叶柄伸长和卷曲。在未观察到任何病理症状的 N. benthamiana 用含有空pBID4载体的实验室菌株GV3101进行浸润，而将某些基因插入pBID4并转化至实验室菌株GV3101、C58C1或LBA4404后，在叶片浸润区域引发轻微的坏死反应及叶片失绿/黄化症状。由野生型引起的坏死症状 农杆菌 或在茄科植物中报道过无毒菌株56,57坏死反应可能是由III型分泌系统的毒力因子、通过IV型分泌系统转移至植物细胞的细菌蛋白和/或对鞭毛蛋白的敏感性所导致58-60我们发现，异源蛋白的瞬时表达也可能引发侵染植物叶片的致病性及过敏反应。许多研究人员报道，利用农杆菌浸润法将不同植物物种与植物双元载体共培养，其瞬时蛋白表达水平可比稳定转化植株高出5至20倍。28,57我们的数据显示 N. benthamiana 用携带pBID4-GFP的GV3101侵染后瞬时表达高水平GFP，其GFP产量与报道的相似 N. benthamiana 浸润 农杆菌 携带pICH-GFPSYS病毒载体（占总可溶性蛋白的80%）44农杆菌浸润法使用我们的启动载体后，热稳定蛋白LicKM的产量显著提高，比使用标准双元质粒时高出50倍18.

为了检测根癌农杆菌（A. tumefaciens）的侵染能力以及启动载体的稳定性，我们使用含有pBID4-GFP质粒的GV3101菌株培养液（以Milli-Q水稀释）对每小时接种一盘的N. benthamiana进行浸润，持续长达8小时 。实验结果表明，GV3101菌株在至少8小时内均具有高效的侵染能力，且pBID4（启动载体）在长达8小时的浸润过程中非常稳定。

在-80 °C保存的含有pBID4-HAC1启动载体的GV3101菌株甘油菌种（细胞库）已证明在三年内非常稳定，且在浸润植物中的瞬时蛋白表达未发生改变。 

在适宜条件下生长且播种后35至42天的N. benthamiana植株，最适合用于真空浸润介导的瞬时基因表达40。较年轻的植株（3–4周龄）由于叶片会漂浮在细胞悬浮液表面，且在施加真空时易受机械损伤，因此无法完全浸润。而在超过45天的植株中，N. benthamiana已进入抽薹期，在所采用的最适光照条件下，瞬时表达水平较低。

已知低分子量酚类化合物（乙酰丁香酮）和单糖（葡萄糖）能够诱导根癌农杆菌（A. tumefaciens）中的vir基因55,61。此外，有研究表明，在50–600 µM浓度的乙酰丁香酮存在下，将含有双元载体pCAMBIA(gfp)的农杆菌渗入本氏烟（N. benthamiana）叶片，可轻微提高瞬时基因表达水平40。在本研究中，我们通过在MMA培养基中向携带pBID4-GFP质粒的GV3101菌液添加不同浓度的乙酰丁香酮和葡萄糖，处理3小时，考察了这些化合物在本系统中的作用，结果发现GFP表达水平无显著差异。有趣的是，将携带pBID4-GFP质粒的GV3101菌液用超纯水稀释至A600为0.5后直接进行渗入，即使未进行vir基因诱导，其GFP表达量与经诱导处理的菌液渗入后相当。根癌农杆菌的vir基因可能被植物组织中存在的酚类化合物（如乙酰丁香酮和芥子酸）以及植物单糖（如葡萄糖和果糖）所诱导。因此，我们推测，在外源vir基因诱导剂存在或缺失的情况下GFP表达水平相似，可能是由于在植物细胞内GFP表达启动载体复制过程中，胞质中存在的内源vir基因诱导物质发挥了作用所致。

野生型 N. benthamiana 已被用作瞬时蛋白表达的模式宿主49。然而， N. benthamiana其相对较低的生物量产量限制了其在重组蛋白大规模生产中的应用。理想的宿主应兼具高水平的瞬时表达、温室中易于培养以及对...的易感性 农杆菌 浸润2. 为选择替代宿主，我们侵染了两种不同的野生型物种 烟草属 (N. benthamiana 和 N. excelsior以及一种杂交 N. excelsiana (N. benthamiana × N. excelsior）与 A. tumefaciens 菌株GV3101携带pBID4-GFP质粒。在这三种物种中，GFP表达水平略高 N. benthamiana. N. excelsior 由于叶片革质化，植物在真空农杆菌浸润过程中表现出困难，且 N. excelsiana 在相同生长条件下，其生物量大约高出两倍。在接种后7天（7 dpi）时，GFP的瞬时表达水平相对相似。 N. benthamiana 和 N. excelsiana因此， N. excelsiana 可能是更适合重组蛋白生产的宿主。

农杆菌介导的瞬时蛋白表达受转录后基因沉默（PTGS）限制26，可通过共表达植物病毒来源的基因沉默抑制因子来克服62瞬时蛋白表达在存在TBSV的p19蛋白时可提高50倍，该蛋白可抑制浸润组织中的转录后基因沉默（PTGS）34在本研究中，我们分别评估了两种病毒沉默抑制子（p19 和 p23）与启动载体 pBID4-HAC1 共同浸润对瞬时表达的影响。结果表明，共浸润这些沉默抑制子对 HAC1 的瞬时表达影响较小，仅在共浸润 p23 或 p19 时观察到 HAC1 蛋白积累量略有增加（15–25%）。为有效提高蛋白产量，可能需要针对目标植物物种和病毒载体特异性地选择沉默抑制子。63TMV解旋酶具有RNA沉默抑制活性64,65我们的数据证实了这一观察结果，将p23或p19与pBID4-HAC1共浸润并未导致GFP表达增加，或仅引起瞬时HAC1蛋白产生的轻微增加。

综上所述，我们改进并优化了植物和Agrobacterium的生长条件，提高了真空浸润的效率。该技术使我们能够在数小时内种植并浸润数百千克的植物材料。我们成功实现了植物瞬时表达技术的自动化，可在现行药品生产质量管理规范（cGMP）条件下，以工业规模进行高通量疫苗生产。有关在cGMP条件下自动化及利用植物瞬时蛋白表达系统生产重组蛋白（包括亚单位疫苗候选物）的更多信息，读者可访问网站 www.fhcmb.org/。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们没有需要披露的内容。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作由美国弗劳恩霍夫分子生物技术中心、iBio公司以及国防高级研究计划局（资助号 # HDTRA1-07-C-0054）提供支持。作者感谢普渡大学生物科学系Stanton Gelvin博士慷慨提供的赠品Agrobacterium tumefaciens 菌株）以及大型生物学公司（Large Scale Biology Corp.）的韦恩·菲茨莫里斯（Wayne Fitzmaurice）N. excelsiana 种子），以及美国的 Jennifer Nicholson 烟草属 采集，北卡罗来纳州立大学（N. excelsior 种子）。作者感谢Margaret Shillingford和Christopher Hull提供植物材料及出色的技术支持。作者还感谢Stephen Streatfield博士和Natasha Kushnir博士在编辑方面提供的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Nicotiana benthamiana烟草种质资源库，北卡罗来纳州立大学作物科学系PI 555478 TW16浸润
Nicotiana excelsior烟草种质资源库，北卡罗来纳州立大学作物科学系PI 555685 TW47浸润
Nicotiana excelsianaDr. Wayne Fitzmaurice，Large Scale Biology Corporation，Vacaville，CALSBC EBA 042304.02浸润
真空撬装装置Abbas，阿什兰，马萨诸塞州定制植物浸润
岩棉Grodan 公司，安大略省，加拿大AO 50/40用于植物栽培的水培介质
2-(N-吗啉代）乙磺酸Acros Organics，Thermo Fisher Scientific，新泽西州172595000缓冲液
穆拉希格 & 斯科格盐（MS盐）植物技术实验室M524组织培养基
乙酰丁香酮Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯D134406-5G农杆菌诱导
Immobilon-P 转印膜Millipore，Billerica，MAIPVH00010蛋白质印迹法
I型阻断剂应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特城，CAT2015蛋白质印迹法
兔多克隆抗GFP抗血清 华盛顿生物技术公司，马里兰州巴尔的摩市蛋白质印迹法
小鼠抗–多聚组氨酸单克隆抗体Qiagen GmbH, Hilden34670蛋白质印迹法
辣根过氧化物酶标记的抗兔抗体 杰克逊免疫研究实验室，宾夕法尼亚州韦斯特格罗夫111-035-003蛋白质印迹法
辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体杰克逊免疫研究实验室，韦斯特格罗夫，宾夕法尼亚州115-035-003蛋白质印迹法
SuperSignal® West Pico 化学发光底物Thermo Scientific Pierce，罗克福德，伊利诺伊州34078蛋白质印迹法
地衣聚糖（1-3:1-4-β-D-葡聚糖）Megazyme，爱尔兰威克洛郡布雷P-LICHN地衣酶活性
刚果红 Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯C6277凝胶染色
数码相机 奥林巴斯，美国宾夕法尼亚州森特瓦利C-8080化学发光成像
GeneGnomeSyngene, Frederick, 医学博士化学发光成像 
GFP 标准品 自制化学发光成像 
植物肥料溶液Griffin Greenhouse Nursery Supplies，纽瓦克，DE67-23-20植物培养
地衣酶标准品纯化于本实验室蛋白质印迹法
MicroPulser 电穿孔仪BioRad，Hercules，CA165-2100农杆菌转化 

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