荚膜血清型肺炎链球菌使用荚膜肿胀反应

摘要

该荚膜肿胀反应是血清型肺炎链球菌的金标准技术，该技术利用显微镜和具体的肺炎球菌血清和参考和研究实验室常用全世界。

摘要

有肺炎链球菌超过90种不同的血清型囊（肺炎球菌）。除了作为了解肺炎球菌流行病学的工具，荚膜血清型可以提供有用的信息，疫苗效力和影响研究。该荚膜肿胀反应是肺炎球菌荚膜血清分型的金标准方法。该方法涉及测试一种肺炎球菌的细胞悬浮液与汇集和特异性抗血清针对荚膜多糖。抗原 - 抗体反应的显微观察。该协议具有三个主要步骤:1）制备的菌体悬浮液，将细胞与抗血清在载玻片上的2）的混合，和3）读出用显微镜荚膜肿胀反应。该荚膜肿胀反应是相当简单的执行并且可以应用于任何地方的合适显微镜和抗血清是可用的。

引言

肺炎链球菌 （肺炎球菌）负责五岁以下的估计有80万儿童每年的死亡，疾病负担主要落在资源贫乏的国家^1。肺炎球菌性疾病的局部感染，如急性中耳炎严重威胁生命的感染，如败血症，脑膜炎和肺炎²范围的严重程度。超过90荚膜肺炎球菌血清型已经描述了^3，4。目前肺炎球菌疫苗可抵御负责大部分侵袭性疾病^5，6的血清型。然而，广泛使用的疫苗已与取代非疫苗血清型包括在疫苗血清型的关联，无论是在鼻咽部和侵入性疾病^7，8。这突出血清分型的流行病学的重要性监视和长期影响疫苗的研究^9。

肺炎球菌分型的金标准方法是荚膜反应试验，被称为荚膜肿胀反应，首先通过罗芬德在1902年描述（参见奥^10）。一致性程度高已经发现实验室之间，以及荚膜肿胀反应和其他血清分型方法^11-13之间。还有的荚膜肿胀反应^10，14-16的几个变化。这里所描述的方法并不需要使用一个计数器污点或油浸没透镜，而是一滴制备试样是与打字血清混合并在400倍放大立即检查。

通常进行使用市售的抗血清的荚膜肿胀反应。这里描述的方法使用较少的抗血清与某些其他方法^16，17相比，使其更符合成本效益。一旦ISOL吃了被识别为肺炎双球菌，其依次用抗血清池测试，直到阳性反应是观察。每个池的抗血清含有抗血清的不同混合物提出对91肺炎球菌血清型^18。一旦池中被建立时，个人类型和组的抗血清中所包含的反应性池按顺序逐个进行试验。型抗血清通常与单个血清型（ 例如，1型的抗血清反应与血清型1）进行反应，而基团的抗血清与所有血清型的反应，在一个特定的组（血清型22F和22A，例如 22组的抗血清起反应）。组内的某些血清型采用因子抗血清（ 如血清型22F反应与22b的因素，但不是22C）被进一步分化。在这种情况下测试是继续与所有相关因素，抗血清，直到血清型确定^19，20。该荚膜肿胀反应是简单快捷^14，可以在任意的l进行aboratory是配备了优质的显微镜和相应的一组抗血清。

方案

1。用于制备打字细胞悬液

1. 使用一次性无菌1微升环，取一小扫肺炎球菌生长在固体非选择性的马血琼脂的新鲜过夜纯培养，接种100微升心浸液（HI）的肉汤。悬挂应该看起来只是明显混浊。轻轻搅动管至乳化。
   注:其他媒体，例如脑心浸液肉汤也可能是合适的。除了 ​​血清（10％，例如终浓度（体积/体积）的马血清），并温育于37℃下在使用前约1小时内可用于提高反应。

2。检查细胞悬液密度

在步骤1.1中制备的细胞悬浮液也将被用作阴性对照，并加入分型血清前应检查的细胞密度。

1. 使用1微升循环，转移跌幅在步骤1.1制备的接种物到GLASs显微镜幻灯片。
2. 使用镊子，放置一个小的圆形盖玻片上悬挂。
3. 采用相位对比度设置，观察准备在显微镜放大400倍，检查悬挂的密度（ 图1A）。
   1. 如果接种物是过重（ 图2A），添加更多的液体培养基在细胞悬浮液，在步骤1.1以冲淡制成。再次轻轻混匀。
   2. 如果接种物过轻，例如，有<50细胞中可见的微观领域（ 图2B）中，添加更多的细菌在步骤1.1制成细胞悬浮液制剂，并轻轻混合。
      注:随着经验的积累，细胞悬浮液的密度可以通过摇动和举起来的光，它应该看起来只是明显浑浊来判断。
4. 重复步骤2.1-2.3，直到细胞的合适数量是在微观领域可见。
   注:玻璃幻灯片和coverslIPS呈现锐器危险。使用后，载玻片和盖玻片被污染的传染性物质，必须配置成一个生物危害锐器容器。

3。打字

1. 转移（ 例如使用1微升环）到玻璃载玻片〜1微升的准备接种。丢弃循环进入生物危害锐器容器。
2. 添加的室温抗血清等体积（1微升菌环）到幻灯片和混合都与循环下降好。
3. 使用镊子，放置一个小的圆形盖玻片上的悬挂，小心不要触碰下降。放置在悬浮液中加入抗血清后，立即盖玻片，以防止在滑动流体干燥。
4. 利用显微镜，观察下用400X放大率相衬的悬浮液。负荚膜肿胀反应观察时很少或没有肺炎球菌的细胞"肿胀"中可以看出，在400X倍率，类似的是，在肺炎球菌的细胞悬浮液用无血清观察到添加（阴性对照）。当细胞相比，细胞的阴性对照出现放大或"肿"和更明显的阳性荚膜肿胀反应被观察到。
   注意:模棱两可的反应，应通过检查反应后5-10分钟，在室温下培养，或通过重复与更多的抗血清的反应进一步研究，例如。
5. 进行肺炎球菌血清型与个体的抗血清池的连续测试，直到一个积极的反应观察。另外，池可以在'发'取决于血清型的发病率局部应用。
   注意:测试在"轮"保证含有抗体的最常见的血清型的池首先测试，最小化的努力和成本。几个池的并发测试还提供了额外的阴性对照，它可以在解译器是有用的看的旋转。如果在一个特定的'圆'所有的池为负，测试与随后的几轮池的分离。
6. 使用包含在反应池内适当的类型或组抗血清测试分离。在适当情况下，采用因子抗血清，以进一步区分血清型。
   注:按键肺炎球菌血清制造商提供在适当的游泳池，类型，团体或抗血清因子和结果（包括任何交叉反应）的解释的选择使用。
7. 如果负的成绩与所有池获得，测试分离与Omniserum试剂（含有抗91种血清型^21）。如果测试的肺炎球菌隔离与Omniserum试剂时的正荚膜肿胀反应仍然没有观察到的，这可能是因为菌株被表达很少或无包膜，或该抗体的血清中未Omniserum表示。后一类可能包括新的血清型。

结果

当型特异性抗体结合的肺炎双球菌的胶囊，从而在其折射率¹⁰发生变化时的正荚膜肿胀反应。当在显微镜下观察，细菌出现'肿'和更明显^14。 图1A显示肺炎球菌细胞在HI肉汤。当特定类型的抗血清加入到细菌悬浮液中，肺炎球菌出现"肿"，折射和更圆的（ 图1B）。

加到肉汤太多的细菌细胞，可能会导致细胞的聚集或假阴性反应。 图2显示了接种肺炎球菌细胞在HI肉汤是"太重"（ 图2A）或"过轻"（ 图2B）的。

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图1。阴性和阳性荚膜肿胀反应。血清型肺炎球菌9V隔离的准备，没有抗血清（1A）和第9组抗血清（1B），在放大400倍进行观察。后者显示了"消肿"和舍入细菌细胞通常出现在一个积极的荚膜肿胀反应。

图2。过重和过轻接种。下放大400倍观察时，肺炎球菌细胞悬液过于沉重（2A）或过轻（2B），准备工作。

讨论

在该技术中的一个关键步骤是确保的纯培养物用于制备一起添加细菌细胞的适当数目的肉汤的悬浮液中。但应注意的是，集落生长和形态在琼脂平板上的不同肺炎球菌菌株之间变化。一些产生干燥和粗糙的殖民地，这可能很难用一个循环接机送机，不要在肉汤乳化很好。出于这个原因，制备细胞悬浮液时，可能需要细菌的较大扫描。在任何情况下，当务之急是单个细胞，并且不聚集体，是明显的负控制，使得它们的相对尺寸可以相比的细胞与抗血清中加入。此外，过多的细菌细胞，可能会导致假阴性反应，其中过量的荚膜抗原可以抑制荚膜肿胀反应^10。出于这个原因，重要的是要创造一种细菌悬浮液与合适的细胞密度（ 图1）。技能提升计划退休金可以通过加入几滴浓甲醛水溶液的保存数月。这使得更容易批量测试，并在消毒液中减少了实验室获得性感染的风险;尽管这必须与福尔马林处理的安全风险，这是有毒的，腐蚀性，致癌，致敏和易燃加以权衡。此外，我们观察到一些菌株表现较弱的反应在福尔马林（数据未显示）的存在。

荚膜肿胀反应是用显微镜检查。使用相位对比增强了胶囊的可见性。在一些实验室中，反应是使用油镜在1000倍放大^14,16被观看。此外，一些实验室使用一个计数器染色（亚甲蓝），以进一步增强了积极的反应^10，16，22的可见性。这里介绍的方法无油我被看作mmersion下放大400倍^15，17。这种方法快速，简单，比较容易阅读^23。

重要的是要保持良好的内部质量控制程序，以确保抗血清和测试程序是顺序很重要。参与外部质量保证计划往往是有益的。

对肺炎球菌的血清型的荚膜肿胀反应的一个主要限制是必需的抗血清成本高。然而，这是最小化在上面的协议由于用于各反应的少量血清的。其它几种方法已经被描述为肺炎球菌血清型^23和24。然而，荚膜肿胀仍然是金标准和新方法的发展需要标准化对荚膜肿胀反应^23。使用适当的抗血清中，荚膜肿胀反应也可用于识别并输入其他上限ULE产生菌^25。该荚膜肿胀反应是有助于当前和新兴的肺炎球菌血清型的鉴定，以及提供有关疫苗的疗效和预防接种对马车和疾病的长期影响的信息。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
肺炎球菌 （Neufeld） 抗血清	SSI Diagnostica		http://www.ssi.dk/ssidiagnostica 使用前将所有抗血清降至室温
肺炎球菌 （Omni） 抗血清	SSI Diagnostica	2438	使用前将所有抗血清降至室温
光学显微镜	徕卡显微系统	Leica DML
校准一次性接种环 1 µl	Copan	CD175S01
马血琼脂 （HBA） 板	Thermo Fisher Scientific	PP2001	http://www.thermofisher.com.au/ 使用前加热至室温
心脏浸泡液 （HI） 肉汤	培养基制备装置 （MPU），墨尔本大学	40HIN	使用
前加热至室温玻璃显微镜载玻片 76 mm x 26 mm	Lomb Scientific	7101	锐器危险：丢弃在生物危害性锐器容器中
圆形玻璃盖玻片	NeuVitro	GG-5
*除抗血清外，所有其他材料均可从其他供应商
*由去纤维化羊血制备的板适用，但由柠檬酸盐血或人血制备的血板不适用