荚膜肿胀反应是用于对Streptococcus pneumoniae进行血清型分型的金标准技术。该技术利用显微镜和特异性肺炎链球菌抗血清，广泛应用于全球的参考实验室和研究实验室。
本文内容
摘要
摘要
肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae，又称 pneumococcus）有90多种不同的荚膜血清型。荚膜血清分型不仅是了解肺炎链球菌流行病学的工具，还能为疫苗效力和影响研究提供有价值的信息。 奎ellung反应是肺炎链球菌荚膜血清分型的金标准方法。该方法通过将肺炎链球菌细胞悬液与针对荚膜多糖的混合及特异性抗血清进行反应，并在显微镜下观察抗原-抗体反应。该实验方案主要包括三个步骤：1）制备细菌细胞悬液，2）在玻片上混合细胞与抗血清，3）使用显微镜读取奎ellung反应结果。奎ellung反应操作相对简便，只要具备合适的显微镜和抗血清，即可在相应实验条件下开展。
引言
Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）每年导致约80万名五岁以下儿童死亡，疾病负担主要集中在资源匮乏的国家1。肺炎链球菌引起的疾病严重程度不一，从急性中耳炎等局部感染到败血症、脑膜炎和肺炎等危及生命的严重感染均有涉及2。目前已描述的肺炎链球菌荚膜血清型超过90种3,4。现有的肺炎链球菌疫苗可预防引起大多数侵袭性疾病的血清型5,6。然而，疫苗的广泛使用与鼻咽部定植及侵袭性感染中疫苗所含血清型被非疫苗血清型取代的现象相关7,8。这凸显了血清分型在流行病学监测和长期疫苗效果评估研究中的重要性9。
肺炎球菌分型的金标准方法是荚膜肿胀试验，即Quellung反应，该方法最早由Neufeld于1902年描述（参见Austrian10）。不同实验室之间以及Quellung反应与其他血清分型方法之间均显示出高度的一致性11-13。Quellung反应有多种变异方法10,14-16。 本文所述方法无需使用复染剂或油镜，而是将一滴制备好的标本与分型血清混合后，立即在400倍放大倍数下进行镜检。
Quellung 反应通常使用市售的抗血清进行。此处描述的方法与其他一些方法相比所需抗血清用量更少16,17，因此更具成本效益。一旦分离株被鉴定为肺炎链球菌，便依次用抗血清混合池进行检测，直至观察到阳性反应。每个抗血清池包含针对 91 种肺炎链球菌血清型制备的不同组合的抗血清18。确定反应阳性所在的血清池后，再依次单独测试该池中包含的各个型别和群组抗血清。型特异性抗血清通常仅与单一血清型发生反应（例如，1 型抗血清仅与 1 型血清型反应），而群组抗血清则与特定群内的所有血清型发生反应（例如，22 群抗血清与 22F 和 22A 血清型均反应）。群内某些血清型还需进一步使用因子抗血清加以区分（例如，22F 血清型与因子 22b 反应，但不与因子 22c 反应）。在此情况下，需继续使用所有相关的因子抗血清进行测试，直至确定血清型19,20。Quellung 反应操作简便、快速14，可在任何配备高质量显微镜和适当抗血清组合的实验室中开展。
方案
1. 分型用细胞悬液的制备
- 使用无菌一次性1 µl接种环，取少量在固体非选择性马血琼脂上培养过夜的新鲜纯肺炎链球菌菌落，接种于100 µl心浸液（HI）肉汤中。菌液应呈现轻微可见的浑浊。轻轻振荡试管使菌体乳化均匀。
注意：其他培养基如脑心浸液肉汤也可能适用。添加血清（例如 使用前在37 °C孵育约1小时，可加入终浓度为10%（v/v）的马血清以增强反应。
2. 检查细胞悬液密度
步骤1.1中制备的细胞悬液将同时用作阴性对照，在加入分型血清前应检测细胞密度。
- 使用1 µl接种环，将步骤1.1中制备的接种液一滴转移至玻璃显微镜载玻片上。
- 使用镊子，将一小片圆形盖玻片置于悬液上。
- 使用相差显微镜，在400倍放大倍数下观察制备的样品，以检查悬液的密度（图1A）。
- 如果接种量过浓 （图2A），向步骤1.1中制备的细胞悬液中加入更多培养基进行稀释，并轻轻混匀。
- 如果接种量过稀，例如在显微镜视野中可见的细胞数<50个 （图2B），则向步骤1.1中制备的细胞悬液中添加更多细菌，并轻轻混匀。
注意：随着经验积累，可通过轻轻摇动并对着光线观察细胞悬液的浑浊程度来判断其密度，理想情况下应刚好呈现轻微浑浊。
- 重复步骤2.1–2.3，直至在显微镜视野中观察到适量的细胞。
注意：玻璃载玻片和盖玻片具有锐器风险。使用后，这些物品已被传染性材料污染，必须丢弃至生物危害锐器容器中。
3. 打字
- 转移约 1 µl 制备好的接种物（例如 使用1 µl加样环将样品加到玻璃显微镜载玻片上。将加样环丢弃至生物危害锐器容器中。
- 加入等体积（1 µl 环状量）的室温抗血清至载玻片上，并用接种环充分混合两滴液体。
- 用一对镊子将一小片圆形盖玻片放置在悬液上，注意不要触碰液滴。在加入抗血清后应立即放置盖玻片，以防止载玻片上的液体干燥。
- 使用显微镜在400倍放大倍数下以相差显微镜观察悬液。当肺炎链球菌细胞在400倍放大倍数下几乎无或无明显“肿胀”现象时，判定为阴性Quellung反应，其表现与未添加抗血清的肺炎链球菌细胞悬液（阴性对照）中所观察到的相似。当细胞较阴性对照中的细胞明显增大或呈现“肿胀”且更易见时，判定为阳性Quellung反应。
注意：对于模棱两可的反应，应进一步调查，例如在室温下孵育5-10分钟后观察反应结果，或使用更多抗血清重复实验。 - 通过连续测试单个抗血清池进行肺炎球菌血清型鉴定，直至观察到阳性反应。或者，可根据当地血清型的流行情况，将抗血清池分“轮”应用。
注意：以“轮次”进行检测可确保优先测试含有最常见血清型抗体的混合样本，从而减少工作量和成本。同时检测多个混合样本还可提供额外的阴性对照，有助于结果判读。若某一轮次中的所有混合样本检测结果均为阴性，则使用后续轮次的混合样本对分离株进行检测。 - 使用反应池中包含的相应类型或群组抗血清对分离物进行检测。如适用，使用因子抗血清进一步区分血清型。
注意：制造商提供的肺炎链球菌抗血清编码用于选择适当的混合抗血清、型、群或因子抗血清，并用于结果判读（包括任何交叉反应）。 - 如果所有混合血清检测结果均为阴性，则使用Omniserum试剂（含有针对91个血清型的抗体）对分离株进行检测21）。如果使用Omniserum试剂检测肺炎链球菌分离株时仍无法观察到阳性Quellung反应，可能是因为该分离株表达的荚膜极少或不表达，或者Omniserum中未包含针对该血清型的抗体。后一种情况可能包括新型血清型。
结果
当型别特异性抗体与肺炎链球菌的荚膜结合时，会发生阳性荚膜肿胀反应，导致其折射率发生变化10。在显微镜下观察时，细菌呈现“肿胀”状，且更易见14。图1A显示了HI肉汤中的肺炎链球菌细胞。当加入型别特异性抗血清至细菌悬液后，肺炎链球菌呈现“肿胀”、折光性强且更加圆润的形态（图1B）。
向肉汤中添加过多的细菌细胞可能导致细胞聚集或出现假阴性反应。图2展示了肺炎链球菌细胞在HI肉汤中的接种物，其中接种量“过重”（图2A）或“过轻”（图2B）。
图1. 肺炎链球菌Quellung反应的阴性与阳性结果。 对血清型9V肺炎链球菌分离株未加抗血清（1A）和加入第9群抗血清（1B）的标本进行显微观察，放大倍数为400倍。后者显示了典型的阳性Quellung反应特征，即细菌细胞出现“肿胀”和变圆现象。
图 2. 接种量过重与过轻的情况。 在 400 倍放大下观察到的肺炎链球菌细胞悬液，其接种量过重（2A）或过轻（2B）的制备结果。
讨论
该技术中的一个关键步骤是确保使用纯培养物制备菌悬液，并向肉汤中加入适量的细菌细胞。需要注意的是，不同肺炎链球菌分离株在琼脂平板上的菌落生长情况和形态存在差异。某些菌株产生干燥且粗糙的菌落，难以用接种环挑取，且在肉汤中不易乳化。因此，在制备细胞悬液时可能需要取更多菌体。无论何种情况，阴性对照中必须清晰可见单个细菌细胞而非细胞聚集体，以便将其大小与加入抗血清后的细胞进行比较。此外，若细菌细胞过多，可能导致假阴性反应，即过量的荚膜抗原可能抑制荚膜肿胀反应10。因此，制备具有合适细胞密度的细菌悬液至关重要（图1）。通过加入数滴浓甲醛溶液，菌悬液可保存数月之久。这有利于批量检测，同时也能灭活肉汤中的细菌，降低实验室获得性感染的风险；但必须权衡甲醛本身带来的安全风险，因其具有毒性、腐蚀性、致癌性、致敏性及易燃性。此外，我们观察到某些分离株在含有甲醛的情况下反应较弱（数据未显示）。
使用显微镜观察荚膜肿胀反应。采用相差显微镜可增强荚膜的可见性。一些实验室使用油镜在1,000倍放大倍数下观察该反应14,16。 此外，部分实验室使用复染剂（亚甲蓝）以进一步增强阳性反应的可见性10,16,22。本文所述方法无需使用油镜，且在400倍放大倍数下观察15,17。该方法快速、简便且相对易于判读23。
必须保持良好的内部质量控制程序，以确保抗血清和检测流程处于正常状态。参加外部质量保证计划通常是有益的。
用于肺炎链球菌血清型鉴定的宽氏反应（Quellung反应）主要局限性在于所需抗血清的成本较高。然而，上述方案中由于每次反应所用抗血清量较少，从而显著降低了成本。已有多种其他方法被报道用于肺炎链球菌的血清型鉴定23,24。然而，宽氏反应仍是血清分型的金标准，任何新方法的开发均需以其作为标准化参照23。 使用适当的抗血清，宽氏反应还可用于鉴定和分型其他产荚膜细菌25。宽氏反应在当前及新出现的肺炎链球菌血清型特征分析中具有重要作用，同时可为疫苗效力评估以及疫苗接种对定植和疾病长期影响提供重要信息。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由比尔和梅琳达·盖茨基金会（PneuCarriage项目，资助号52099）和维多利亚州政府运营基础设施支持计划资助。 感谢Eileen Dunne、Janet Strachan和Kim Hare对稿件的审阅。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 肺炎球菌（Neufeld）抗血清 | SSI Diagnostica | http://www.ssi.dk/ssidiagnostica 使用前将所有抗血清恢复至室温 | |
| 肺炎球菌（Omni）抗血清 | SSI Diagnostica | 2438 | 使用前将所有抗血清置于室温 |
| 光学显微镜 | Leica Microsystems | Leica DML | |
| 校准一次性接种环 1 µl | Copan | CD175S01 | |
| 马血琼脂（HBA）平板 | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | http://www.thermofisher.com.au/ 使用前恢复至室温 |
| 心浸液（HI）肉汤 | 墨尔本大学媒体制备单元（MPU） | 40HIN | 使用前恢复至室温 |
| 76 mm × 26 mm 玻璃载玻片 | Lomb Scientific | 7101 | 锐器危险：应弃置于生物危害锐器容器中 |
| 圆形玻璃盖玻片 | NeuVitro | GG-5 | |
| *除抗血清外，所有其他材料均可从其他供应商处购买 | |||
| 使用脱纤维绵羊血制备的平板适用，但柠檬酸钠抗凝血或人血制备的平板不适用 |
参考文献
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