方法文章

神经干细胞和祖细胞在小鼠脑开发基因毒性应激后的评估细胞周期进程

DOI：

10.3791/51209

⸱

2014年5月7日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Radiopathologie, CEA DSV iRCM SCSR, 2INSERM, U967, 3Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Université Paris Sud, UMR 967

本文内容

摘要

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胸苷两个类似物管理，埃杜和BrdU，在孕鼠允许在神经细胞和祖细胞在胚胎小鼠大脑细胞周期进程的分析。这个方法是有用的，以确定基因毒性应激，包括电离辐射，脑发育过程中的作用。

摘要

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从不同类型的神经干细胞和祖细胞（NS​​PC），它形成一个假复层上皮衬里胚胎脑的侧脑室脑发育过程中产生的大脑皮层神经元。遗传毒性压力，如电离辐射，对发育中的大脑与NSPC的高灵敏度非常有害的影响。所涉及的细胞和分子机制的阐明依赖于这些特定类型的细胞中，DNA损伤反应，需要一个准确的方法通过细胞周期来确定受损组织NSPC进展的表征。这里显示的基础上的EdU和BrdU对孕鼠和进一步检测在胚胎大脑冠状切片这两个胸腺嘧啶核苷类似物的连续腹腔注射的方法。的EdU和BrdU都在复制细胞的DNA在S期注册成立，并通过两种不同的方法（叠氮化物或检测的特异性抗体，分别），这有利于它们的同时检测。的EdU和BrdU染色，然后在其从心室率在背端脑的标准区域距离的函数确定每个NSPC核。因此，这种双标记技术允许区分细胞，通过细胞周期进展从那些在DNA损伤反应已经激活细胞周期检查点，导致细胞周期阻滞。

实验的一个例子给出，其中的EdU被照射和BrdU前后立即注入和分析的4小时内下照射进行。这个协议提供了NSPC在细胞周期在它们已经被照射的相位的函数的急性DNA损伤反应的精确分析。这种方法是很容易的转座到许多其他系统，以确定在生物体组织上的细胞周期进展的特定治疗的影响。

引言

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在胚胎脑发育，在脑室区产生的大脑皮层的投射神经元中，假复层上皮的不同类型的神经干细胞和祖细胞（NS​​PC）所组成的行侧脑室。其中NSPC，径向胶质细胞（RGC），其作为神经干细胞，经过interkinetic核迁移（INM）：它们在心室和心室区的基极限的S-相的表面进行有丝分裂（VZ） 1，2,3。它们可分为两种对称地产生两个RGC或不对称，以生成一个RGC和一个神经元或中间祖细胞（IPC）的4，5。工控机迁移到上覆的增殖层称为脑室下区（SVZ），其中最后一个对称分裂后，便产生两个不成熟的投射神经元6-8。相反，研资局，IPC不进行INM（9审查）。新生成的神经元MIGR吃了径向沿径向纤维通过中间区（IZ）到达其 ​​最终目的地，皮质板（CP）10，8。所有这些事件的最佳时机是正确的皮质发育至关重要。例如从扩散切换到神经祖细胞群分化是由G1期持续时间11，12控制。 G1期的延长，细胞分化从而关联。

基因毒性应激，如电离辐射，严重危害大脑的发育（13审阅）。我们和其他人已经表明，NSPC是极易受辐射诱导的细胞凋亡14，15,16。电离辐射诱导DNA双链断裂是对增殖细胞的最严重的损害。 DNA损伤反应（DDR）的循环细胞的一个重要组成部分是细胞周期检查点在G1 / S期或G2 / M期的转换或S在激活相....

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方案

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1，动物规程

该协议已经被设计符合欧共体理事会指令11月24日，1986（86/609/EEC），并已通过了动物福利（CETEA-CEA DSV IDF）机构委员会。

  1. 注射用EdU /的BrdU和E14.5孕鼠照射（ 图2A）。
    1. 制备的EdU的溶液在1毫克/毫升和BrdU在5 mg / ml的PBS中。执行腹腔注射100微升的溶液的EdU使用25号针头成孕鼠（IP）。 1.5小时后，照射小鼠（全身照射），在0戈瑞或2戈瑞（0.6格雷/分钟）。紧接在后，用25号针头进入孕鼠注射（IP）的200微升的BrdU溶液。
  2. 制备胚胎的大脑冠状切片。
    1. 在1小时或4小时照射后，通过二氧化碳安乐死的孕鼠。
    2. 打开腹腔CAVITY超过用剪刀3厘米。通过切片角的两个末端从子宫的其余部分分开的两个子宫角。转移子宫角到含有PBS 0.6％葡萄糖的培养皿中。为了分离胚胎打开子宫角用钳子。删除使用镊子每个胚胎的羊膜囊。
    3. 解剖胚胎头与钳和4％多聚甲醛（PFA，pH值= 7.4）O / N修复它们浸泡在4°C。
    4. 在4℃下冲洗胚胎头在PBS中的至少一个夜头可以保持在PBS中数天。
    5. 使用真空浸润处理器 ，如表1所示在石蜡中嵌入的头。头嵌入也可以根据化学罩在....

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结果

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在图2中描述的实验中，埃杜给药1.5小时照射和BrdU刚照射后前。四种类型的细胞，然后在1或4小时后照射制备的皮质切片区别，根据任一的EdU或的BrdU，双方或无的掺入（ 图2A和2B）。重要的是，既没有的EdU也不BrdU掺入改变辐射诱导的细胞凋亡（数据未示出）的电平。此外，该染色方法允许在S-期DNA复制过程中EDU和BrdU的唯一的检测中，而没有相应的灵敏度来检测与维修甚至照射后相关的DNA的合成。的确，i）两者的EdU也不的BrdU染色，观察到1小时照射后（PI）在皮质板，其中位于有丝分裂后神经元在G0期，和ii）的EdU（+）和/或的BrdU（数+的细胞）未在照射增加相比unirradiated大脑。

埃杜（+）的BrdU（+）核

埃杜（+）的BrdU（+）原子核对应NSPC那是在S期之前和之后0小时PI。因此，它们被照射在S期。 如图3B和

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讨论

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这里所描述的基础上的EdU 1.5小时掺入实验设计照射前和BrdU的掺入允许照射后立即NSPCs能够激活S期和G2 / M期检查点，但第1小时过程中没有在G1 / S检查点之后的一个示范基因毒性应激在胎鼠大脑。我们进行了在其中的EdU已经注入在不同时间照射和BrdU后，才刚刚1小时小鼠牺牲其他的实验中，让我们特别欣赏进入S期的速度。这些实验表明，NSPC不激活G1 / S期阻滞在体内 22,23基因毒性应激后。

因此，DNA修复和细胞凋亡之间的选择不会发生在G1 / S期检查点提出的问题对中保证基因组稳定性在这些细胞的机制的性质。

该协议是方便，快捷。不同步骤目前没有明显的困难。这种技术是一种可以替代使用氯脱氧尿苷的（CldU）和碘脱氧尿苷（IDU），其已经显示出交叉反应的32。

一，应用广泛的面板可以被考虑，因为该协议是轻松灵活地适应多种生物学问题。变化的例子提出了罗克和合作者.......

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披露

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该作者有没有利益冲突。

致谢

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这项研究导致这些结果根据出让协议已收到的资金来自欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）N°323267，来自法国电力公司（EDF）和L'法新社国立德拉RECHERCHE - 桑特 - 环境在等桑特-劬劳（ANR-SEST，Neurorad）。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EdULife TechnologiesA100441 毫克/毫升
BrdULife TechnologiesB50025 毫克/毫升
IBL 637CIS BIO 国际
Tissu Tek VIP徕卡
切片机LeicaRM 2125 RT
Triton X-100Sigma-Aldrich93443
Click-iT EdU Alexa 488成像套件Life TechnologiesC10083
抗BrdUGE医疗保健RPN2021/300
山羊抗小鼠-Alex594Life TechnologiesA110011/400
FluoromountSouthernBiotech0100-01
聚磷酸玻片Thermo ScientificJ2800AMNZ
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
PBSLife Technologies20012-068
DAPISigma-AldrichD9542
显微镜 BX51奥林巴斯
共聚焦显微镜 SPE徕卡
棱镜软件Graphpad版本 5.0c
Photoshop 软件Adobe

参考文献

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  1. Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
  2. Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
  3. Taverna, E., Huttner, W. B. Neural p....

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标签

EdU BrdU DNA S

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