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方法文章

评估基因毒性应激后小鼠发育大脑中神经干细胞与前体细胞的细胞周期进程

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DOI：

10.3791/51209

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2014年5月7日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Radiopathologie, CEA DSV iRCM SCSR, 2INSERM, U967, 3Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, 4Université Paris Sud, UMR 967

本文内容

摘要

在怀孕小鼠中给予两种胸苷类似物EdU和BrdU，可分析胚胎小鼠脑内神经细胞和前体细胞的细胞周期进程。该方法有助于确定基因毒性应激（包括电离辐射）对脑发育的影响。

摘要

大脑皮层的神经元在脑发育过程中由不同类型的神经干细胞和前体细胞（NSPC）产生，这些细胞形成一种假复层上皮，衬于胚胎脑侧脑室的内壁。基因毒性应激（如电离辐射）对发育中的大脑具有严重有害影响，这与NSPC的高度敏感性密切相关。阐明其中涉及的细胞与分子机制，依赖于对这些特定类型细胞DNA损伤应答的表征，而这需要一种精确的方法来测定受损组织中NSPC在细胞周期中的进程。本文展示了一种方法：对怀孕小鼠连续进行腹腔注射EdU和BrdU，随后在胚胎脑的冠状切片中检测这两种胸苷类似物。EdU和BrdU均可在S期被复制中的细胞掺入DNA中，并通过两种不同的技术（分别为叠氮化物反应或特异性抗体）进行检测，从而便于实现双重同时标记。随后，根据背侧端脑标准区域内每个NSPC细胞核距脑室边缘的距离，分别确定其EdU和BrdU的染色情况。因此，这种双标记技术能够区分那些已通过细胞周期的细胞与那些因DNA损伤而激活细胞周期检查点、导致细胞周期停滞的细胞。

本实验示例中，在照射前注射EdU，照射后立即注射BrdU，并在照射后4 hr 内进行分析。该方案可根据神经干细胞前体细胞（NSPC）受照射时所处的细胞周期时相，精确分析其急性DNA损伤反应。该方法可轻松适用于许多其他系统，以确定特定处理对活体组织中细胞周期进程的影响。

引言

在胚胎脑发育过程中，大脑皮层的投射神经元产生于室管膜区，该区域是一种假复层上皮结构，由多种类型的神经干细胞和前体细胞（NSPC）组成，衬于侧脑室壁。在NSPC中，放射状胶质细胞（RGC）作为神经干细胞，会进行有丝分裂间期核迁移（INM）：它们在脑室表面进行有丝分裂，在室管膜区（VZ）的基底边界进行S期DNA复制1,2,3。RGC可进行对称分裂产生两个RGC，也可进行不对称分裂产生一个RGC以及一个神经元或一个中间前体细胞（IPC）4,5。IPC迁移至其上方的一个增殖层，即脑室下区（SVZ），在此经过最后一次对称分裂后，生成两个未成熟的投射神经元6-8。与RGC不同，IPC不进行INM（综述见9）。新生成的神经元沿着放射状纤维，通过中间带（IZ）进行径向迁移，最终到达皮层板（CP）的指定位置10,8。上述所有事件的精确时序对于皮层的正常发育至关重要。例如，神经前体细胞群体从增殖向分化的转变由G1期持续时间所调控11,12。G1期的延长因此与细胞分化密切相关。

基因毒性应激（如电离辐射）会严重损害大脑发育（详见文献13综述）。我们及其他研究者已证实，神经干细胞/前体细胞（NSPC）极易因辐射而发生凋亡14,15,16。电离辐射可诱导DNA双链断裂，这是对增殖细胞最严重的损伤形式。在增殖细胞中，DNA损伤应答（DDR）的一个关键组分是在G1/S期或G2/M期转换阶段，或S期期间（即S期内在检查点）激活细胞周期检查点17-21。这些检查点可阻滞细胞周期进程，以提供足够时间进行DNA损伤修复，或清除损伤过重的细胞。因此，细胞死亡以及细胞周期进程的延迟可能在电离辐射暴露后影响大脑发育22-24。因此，建立一种方法来评估经电离辐射处理的小鼠胚胎脑中NSPC细胞周期检查点的激活情况具有重要意义。

细胞周期的进程通常通过掺入胸苷类似物5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）来进行监测。在细胞周期的S期，即DNA复制时，BrdU会被整合到新合成的DNA中。随后使用抗BrdU抗体，即可检测出在BrdU脉冲期间处于S期的细胞。

一种新型的胸苷类似物 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）可通过荧光叠氮化合物进行检测。EdU 与 BrdU 的检测方法互不干扰25，因此可实现两种胸苷类似物的同步检测，这对于细胞周期进程的研究具有重要意义。通常情况下，细胞首先被短时间脉冲标记 EdU，随后再进行 BrdU 脉冲标记，两次标记之间的间隔通常为数小时25,26。在含有 EdU 的培养基中加入 BrdU 时，BrdU 会优先掺入 DNA，而 EdU 的掺入则被排除；而在培养基中同时加入等摩尔或半等摩尔浓度的 EdU25 和 BrdU 时，仅 BrdU 被掺入27。这一特性简化了双标记实验流程，无需在添加第二种标记物前通过洗涤步骤去除培养基中的第一种标记物。这对于体内（in vivo）研究尤其重要，因为在体内实验中无法实施洗涤步骤，该方法可用于精确确定细胞群体进入或退出 S 期的时间点。

近期，一种利用EdU和BrdU对小鼠胚胎脑组织进行双脉冲标记的方法23,24,22 已开发用于分析NSPC细胞周期进程及核膜迁移（INM） 在子宫内 照射。此外，已有研究表明，在S期，小鼠细胞首先复制常染色质区域，然后复制着丝粒周围异染色质区域。28,29,30有趣的是，不同染色体的着丝粒周围异染色质在间期细胞核中聚集形成异染色质灶，也称为染色中心，可通过DAPI染色清晰地观察到明亮的焦点。因此，对常染色质和染色中心进行差异性的EdU与BrdU染色，有助于我们更精确地分析NSPC的S期进程。

该方法揭示了NSCP中G1/S检查点明显缺失的现象22-24这相当令人惊讶，因为该检查点本应对于基因组稳定性至关重要。  基于EdU和BrdU脉冲标记的不同组合，已有多种实验设计被用于分析端脑腹侧和背侧的细胞周期进程。本文提供了一个实验方案示例，可用于研究NSPC在4小时内发生的急性DNA损伤 随后 在子宫内 E14.5小鼠胚胎的照射

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方案

1. 动物实验操作

本方案已根据1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）制定，并已获得本机构动物福利委员会（CETEA-CEA DSV IdF）批准。

  1. 对E14.5天的孕鼠进行EdU/BrdU注射及辐照处理（图2A）。
    1. 在PBS中配制浓度为1 mg/ml 的EdU溶液和浓度为5 mg/ml 的BrdU溶液。使用25 G针头对孕鼠进行腹腔注射（IP），每只注射100 µl EdU溶液。1.5小时后，对小鼠进行全身辐照，剂量为0 Gy或2 Gy（0.6 Gy/min）。辐照后立即使用25 G 针头腹腔注射200 µl BrdU溶液。
  2. 胚胎脑冠状切片的制备。
    1. 辐照后1小时或4小时，使用二氧化碳对孕鼠实施安乐死。
    2. 用剪刀切开约三厘米长的腹腔，将两个子宫角从子宫其余部分分离，切断子宫角的两端。将子宫角转移至含有0.6%葡萄糖PBS的培养皿中。用镊子打开子宫角以分离胚胎，并用镊子去除每个胚胎的羊膜囊。
    3. 用镊子分离胚胎头部，并将其浸入4%多聚甲醛（PFA，pH=7.4）中，在4 °C下固定过夜。
    4. 在PBS中漂洗胚胎头部，至少在4 °C下过夜。头部样本可在PBS中保存数天。
    5. 使用真空浸润处理仪按照表1所示程序将头部组织包埋于石蜡中。也可在通风橱中完成乙醇和二甲苯浸泡步骤，随后在65 °C烘箱中完成石蜡浸泡。
    6. 使用切片机制备5-µm厚的冠状切片。
    7. 将切片贴附于多聚赖氨酸包被的载玻片上。
    8. 载玻片可在室温（RT）下保存数月。

2. EdU/BrdU 染色

  1. 脱蜡与抗原修复
    1. 将载玻片浸入三道甲苯溶液中，每道5分钟，以脱去石蜡包埋的脑切片中的石蜡。
    2. 依次在浓度递减的乙醇溶液中各进行两次、每次3分钟的水化处理，顺序如下：100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇，最后在H2O中浸泡5分钟。载玻片可在去离子水中保存数小时。
    3. 将切片在柠檬酸盐溶液（10 mM，pH 6）中煮沸10分钟，随后在去离子水中孵育5分钟。
  2. EdU染色
    1. 按照试剂盒说明书进行EdU检测。用含0.5% Triton X-100的PBS溶液透化细胞10分钟。
    2. 将10X EdU缓冲液添加剂用去离子水稀释至1X。该溶液需现配现用，并于当日使用完毕。
    3. 配制EdU反应混合液，包含EdU Alexa Fluor 488叠氮化物。必须严格按照表2中列出的顺序添加组分，否则反应无法最佳进行。EdU反应混合液应在配制后15分钟内使用。
    4. 去除透化缓冲液（步骤2.1.1），然后用PBS洗涤两次。
    5. 加入150 µl EdU反应混合液，加盖盖玻片，在室温避光条件下孵育30分钟。
    6. 去除EdU反应混合液，然后用PBS洗涤一次。
  3. BrdU染色
    1. 在PBS中配制含7.5%山羊血清和7.5%胎牛血清的封闭缓冲液。向脑切片上加入150 µl 封闭缓冲液，加盖盖玻片，在室温下孵育1小时，以阻断非特异性抗体结合。
    2. 移去盖玻片，加入用封闭缓冲液按1:300稀释的小鼠抗BrdU一抗150 µl ，加盖盖玻片，于4 °C孵育过夜。
    3. 移去盖玻片，然后用PBS洗涤三次。
    4. 加入用封闭缓冲液按1:400稀释的山羊抗小鼠Alexa594二抗150 µl ，加盖盖玻片，在室温下孵育1小时。
    5. 移去盖玻片，然后用PBS洗涤一次。
    6. 核染色：在PBS中加入终浓度为1 µg/ml的4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染液150 µl，加盖盖玻片，在室温下孵育2分钟。
    7. 用封片剂封片。

3. 分析

  1. 使用20倍物镜的荧光显微镜或共聚焦显微镜观察脑切片，并在三个通道（488 nm、594 nm 和紫外光）中分别采集图像文件。
  2. 使用 Photoshop 软件对图像进行叠加。
  3. 分析大脑背内侧脑壁标准区域的脑切片。该区域在内侧-外侧方向上为100 µm，沿径向方向使用叠加在图像上的网格（图1）将其划分为18个（或更多）10 µm高的区间，方法如前所述31。
    1. 调整网格，使第一个区间位于脑室表面，其长轴与脑室边界平行。然后对每个区间中标记的EdU、BrdU和/或浓染核（对应凋亡细胞核）进行计数。当一个细胞核位于两个区间的边界上时，将其计入包含其较大一部分的区间；若细胞核在两个区间中所占面积相等，则计入下方的区间。
  4. 统计分析。

每只胚胎至少分析两个皮质切片。对来自不同窝的至少3只胚胎重复实验。结果以均值 ± 均值标准误（SEM）表示。采用Graphpad Prism软件进行统计分析，使用双因素方差分析（two-way ANOVA）及Bonferroni多重比较事后检验。

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结果

在图2所述实验中，EdU在照射前1.5小时给予，BrdU则在照射后立即给予。在照射后1小时或4小时制备的皮质切片中，根据细胞是否掺入EdU或BrdU、两者均掺入或均未掺入，可区分出四种类型的细胞（图2A和图2B）。重要的是，EdU或BrdU的掺入均未改变辐射诱导的细胞凋亡水平（数据未显示）。此外，染色方法仅能检测S期DNA复制过程中掺入的EdU和BrdU，无法灵敏地检测到即使在照射后与DNA修复相关的DNA合成。事实上：i）在照射后1小时（PI），位于皮质板中处于G0期的终末分裂后神经元细胞中均未观察到EdU或BrdU染色信号；ii）与未照射大脑相比，照射后大脑中EdU(+)和/或BrdU(+)细胞的数量并未增加。

EdU(+)BrdU(+) 细胞核

EdU(+)BrdU(+) 细胞核对应于在 0 小时 PI 前后均处于 S 期的 NSPC。因此，这些细胞在 S 期受到了照射。如

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讨论

此处所述的实验设计基于在照射前1.5小时掺入EdU、照射后立即掺入BrdU，从而证明NSPCs能够在1小时内激活S期和G2/M期检查点，但无法激活G1/S期检查点st 在胎儿小鼠脑部受到基因毒性应激后1小时。我们进行了其他实验，在照射后不同时间点注射EdU，并在小鼠处死前1小时注射BrdU，从而能够特异性地评估S期进入的速率。这些实验表明，神经干细胞/前体细胞（NSPC）在受到基因毒性应激后不会激活G1/S期阻滞。 体内22,23.

因此，DNA修复与细胞凋亡之间的选择并非发生在G1/S检查点，这引发了一个问题：这些细胞中保障基因组稳定性的机制本质是什么？

该方案简单快速，各个步骤均无明显难度。此技术可替代氯代脱氧尿苷（CldU）和碘代脱氧尿苷（IdU）的使用，已有研究表明二者存在交叉反应32。

由于该方案具有高度的灵活性和可适应性，可广泛应用于多种生物学问题。Roque 及其合作者

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致谢

这些研究成果获得了欧洲联盟第七框架计划（FP7/2007-2013）在资助协议编号° 323267，来自法国电力公司（EDF）以及法国国家科研署—健康-环境与职业健康部门（ANR-SEST，Neurorad）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
EdULife TechnologiesA100441 mg/ml
BrdULife TechnologiesB50025 mg/ml
IBL 637CIS BIO International
Tissu Tek VIPLeica
切片机LeicaRM 2125 RT
吐温 X-100Sigma-Aldrich93443
Click-iT EdU Alexa 488 成像试剂盒Life TechnologiesC10083
抗 BrdU 抗体GE HealthcareRPN2021/300
山羊抗小鼠-Alex594Life TechnologiesA110011/400
Fluoromount 封片剂SouthernBiotech0100-01
多聚赖氨酸载玻片Thermo scientificJ2800AMNZ
多聚甲醛Sigma-AldrichP6148
PBSLife Technologies20012-068
DAPISigma-AldrichD9542
显微镜 BX51Olympus
共聚焦显微镜 SPELeica
Prism 软件Graphpad版本 5.0c
Photoshop 软件Adobe

参考文献

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