在怀孕小鼠中给予两种胸苷类似物EdU和BrdU，可分析胚胎小鼠脑内神经细胞和前体细胞的细胞周期进程。该方法有助于确定基因毒性应激（包括电离辐射）对脑发育的影响。
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本文内容
摘要
摘要
大脑皮层的神经元在脑发育过程中由不同类型的神经干细胞和前体细胞（NSPC）产生，这些细胞形成一种假复层上皮，衬于胚胎脑侧脑室的内壁。基因毒性应激（如电离辐射）对发育中的大脑具有严重有害影响，这与NSPC的高度敏感性密切相关。阐明其中涉及的细胞与分子机制，依赖于对这些特定类型细胞DNA损伤应答的表征，而这需要一种精确的方法来测定受损组织中NSPC在细胞周期中的进程。本文展示了一种方法：对怀孕小鼠连续进行腹腔注射EdU和BrdU，随后在胚胎脑的冠状切片中检测这两种胸苷类似物。EdU和BrdU均可在S期被复制中的细胞掺入DNA中，并通过两种不同的技术（分别为叠氮化物反应或特异性抗体）进行检测，从而便于实现双重同时标记。随后，根据背侧端脑标准区域内每个NSPC细胞核距脑室边缘的距离，分别确定其EdU和BrdU的染色情况。因此，这种双标记技术能够区分那些已通过细胞周期的细胞与那些因DNA损伤而激活细胞周期检查点、导致细胞周期停滞的细胞。
本实验示例中，在照射前注射EdU，照射后立即注射BrdU，并在照射后4 hr 内进行分析。该方案可根据神经干细胞前体细胞（NSPC）受照射时所处的细胞周期时相，精确分析其急性DNA损伤反应。该方法可轻松适用于许多其他系统，以确定特定处理对活体组织中细胞周期进程的影响。
引言
在胚胎脑发育过程中，大脑皮层的投射神经元产生于室管膜区，该区域是一种假复层上皮结构，由多种类型的神经干细胞和前体细胞（NSPC）组成，衬于侧脑室壁。在NSPC中，放射状胶质细胞（RGC）作为神经干细胞，会进行有丝分裂间期核迁移（INM）：它们在脑室表面进行有丝分裂，在室管膜区（VZ）的基底边界进行S期DNA复制1,2,3。RGC可进行对称分裂产生两个RGC，也可进行不对称分裂产生一个RGC以及一个神经元或一个中间前体细胞（IPC）4,5。IPC迁移至其上方的一个增殖层，即脑室下区（SVZ），在此经过最后一次对称分裂后，生成两个未成熟的投射神经元6-8。与RGC不同，IPC不进行INM（综述见9）。新生成的神经元沿着放射状纤维，通过中间带（IZ）进行径向迁移，最终到达皮层板（CP）的指定位置10,8。上述所有事件的精确时序对于皮层的正常发育至关重要。例如，神经前体细胞群体从增殖向分化的转变由G1期持续时间所调控11,12。G1期的延长因此与细胞分化密切相关。
基因毒性应激（如电离辐射）会严重损害大脑发育（详见文献13综述）。我们及其他研究者已证实，神经干细胞/前体细胞（NSPC）极易因辐射而发生凋亡14,15....
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方案
1. 动物实验操作
本方案已根据1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）制定，并已获得本机构动物福利委员会（CETEA-CEA DSV IdF）批准。
- 对E14.5天的孕鼠进行EdU/BrdU注射及辐照处理（图2A）。
- 在PBS中配制浓度为1 mg/ml 的EdU溶液和浓度为5 mg/ml 的BrdU溶液。使用25 G针头对孕鼠进行腹腔注射（IP），每只注射100 µl EdU溶液。1.5小时后，对小鼠进行全身辐照，剂量为0 Gy或2 Gy（0.6 Gy/min）。辐照后立即使用25 G 针头腹腔注射200 µl BrdU溶液。
- 胚胎脑冠状切片的制备。
- 辐照后1小时或4小时，使用二氧化碳对孕鼠实施安乐死。
- 用剪刀切开约三厘米长的腹腔，将两个子宫角从子宫其余部分分离，切断子宫角的两端。将子宫角转移至含有0.6%葡萄糖PBS的培养皿中。用镊子打开子宫角以分离胚胎，并用镊子去除每个胚胎的羊膜囊。
- 用镊子分离胚胎头部，并将其浸入4%多聚甲醛（PFA，pH=7.4）中，在4 °C下固定过夜。
- 在PBS中漂洗胚胎头部，至少在4 °C下过夜。头部样本可在PBS中保存数天。
- 使用真空....
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结果
在图2所述实验中，EdU在照射前1.5小时给予，BrdU则在照射后立即给予。在照射后1小时或4小时制备的皮质切片中，根据细胞是否掺入EdU或BrdU、两者均掺入或均未掺入，可区分出四种类型的细胞（图2A和图2B）。重要的是，EdU或BrdU的掺入均未改变辐射诱导的细胞凋亡水平（数据未显示）。此外，染色方法仅能检测S期DNA复制过程中掺入的EdU和BrdU，无法灵敏地检测到即使在照射后与DNA修复相关的DNA合成。事实上：i）在照射后1小时（PI），位于皮质板中处于G0期的终末分裂后神经元细胞中均未观察到EdU或BrdU染色信号；ii）与未照射大脑相比，照射后大脑中EdU(+)和/或BrdU(+)细胞的数量并未增加。
EdU(+)BrdU(+) 细胞核
EdU(+)BrdU(+) 细胞核对应于在 0 小时 PI 前后均处于 S 期的 NSPC。因此，这些细胞在 S 期受到了照射。如
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讨论
此处所述的实验设计基于在照射前1.5小时掺入EdU、照射后立即掺入BrdU，从而证明NSPCs能够在1小时内激活S期和G2/M期检查点，但无法激活G1/S期检查点st 在胎儿小鼠脑部受到基因毒性应激后1小时。我们进行了其他实验，在照射后不同时间点注射EdU，并在小鼠处死前1小时注射BrdU，从而能够特异性地评估S期进入的速率。这些实验表明，神经干细胞/前体细胞（NSPC）在受到基因毒性应激后不会激活G1/S期阻滞。 体内22,23.
因此，DNA修复与细胞凋亡之间的选择并非发生在G1/S检查点，这引发了一个问题：这些细胞中保障基因组稳定性的机制本质是什么？
该方案简单快速，各个步骤均无明显难度。此技术可替代氯代脱氧尿苷（CldU）和碘代脱氧尿苷（IdU）的使用，已有研究表明二者存在交叉反应32。
由于该方案具有高度的灵活性和可适应性，可广泛应用于多种生物学问题。Roque 及其合作者
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致谢
这些研究成果获得了欧洲联盟第七框架计划（FP7/2007-2013）在资助协议编号° 323267，来自法国电力公司（EDF）以及法国国家科研署—健康-环境与职业健康部门（ANR-SEST，Neurorad）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| EdU | Life Technologies | A10044 | 1 mg/ml |
| BrdU | Life Technologies | B5002 | 5 mg/ml |
| IBL 637 | CIS BIO International | ||
| Tissu Tek VIP | Leica | ||
| 切片机 | Leica | RM 2125 RT | |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Click-iT EdU Alexa 488 成像试剂盒 | Life Technologies | C10083 | |
| 抗 BrdU 抗体 | GE Healthcare | RPN202 | 1/300 |
| 山羊抗小鼠-Alex594 | Life Technologies | A11001 | 1/400 |
| Fluoromount 封片剂 | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| 多聚赖氨酸载玻片 | Thermo scientific | J2800AMNZ | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-068 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 显微镜 BX51 | Olympus | ||
| 共聚焦显微镜 SPE | Leica | ||
| Prism 软件 | Graphpad | 版本 5.0c | |
| Photoshop 软件 | Adobe |
参考文献
- Rakic, P. Specification of cerebral cortical areas. Science. 241, 170-176 (1988).
- Sauer, F. Mitosis in he neural tube. J Comp Neurol. , 377-399 (1935).
- Taverna, E., Huttner, W. B. Neural p....
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重印与许可
