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使用 HEp-2 细胞进行抗核抗体筛查

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DOI：

10.3791/51211

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2014年6月23日

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1IFA Development Manager, INOVA Diagnostics, Inc., 2IFA Development, INOVA Diagnostics, Inc., 3Product Manager, Rheumatology, INOVA Diagnostics, Inc., 4Medical Director, INOVA Diagnostics, Inc.

本文内容

摘要

间接免疫荧光（IIF）检测法传统上用于检测人血清中的抗核抗体（ANA）。这些抗体的存在有助于系统性自身免疫性风湿病（SARD）的诊断。本方案展示了如何有效进行IIF技术，以准确检测这些自身抗体。

摘要

美国风湿病学会关于抗核抗体（ANA）检测的立场声明规定，将免疫荧光法（IIF）作为ANA筛查的金标准方法1。尽管在经验丰富的操作者手中，IIF是一种优秀的筛查试验，但其在处理和判读IIF载玻片时存在诸多技术难题，例如耗时耗力的玻片处理过程、需人工判读、依赖经过培训且经验丰富的技术人员，以及需要使用暗室等，这些因素使得IIF方法难以融入现代自动化实验室的工作流程中。

实现高质量抗核抗体（ANA）筛查的第一步也是至关重要的一步，是细致的玻片处理。该过程劳动密集，需要充分理解整个流程，同时注重细节并具备相关经验。

在暗室中通过荧光显微镜进行玻片判读，由经过培训的技术人员操作，这些人员需熟悉细胞周期背景下间期细胞和分裂期细胞的各种荧光模式。鉴于间接免疫荧光（IIF）是结缔组织病相关自身免疫性风湿病（SARD）的首选初筛工具，掌握正确实施该技术的各个步骤至关重要。

近年来，已开发出用于自动读取间接免疫荧光（IIF）玻片的数字成像系统。此类系统（如NOVA View全自动荧光显微镜）旨在简化常规IIF工作流程。NOVA View可获取并存储反应孔的高分辨率数字图像，从而将图像采集与判读过程分离；操作人员可在高分辨率计算机显示器上查看和判读图像。系统可保存图像以供日后参考，并通过提供图像上的荧光强度数据辅助操作人员判读。此外，该系统可初步将结果分类为阳性或阴性，并对阳性样本提供荧光模式识别。总之，该系统消除了对暗室的需求，实现了IIF读片/判读流程的自动化和流程化。更重要的是，它提高了不同操作人员之间以及同一名操作人员多次判读之间的一致性。此外，通过使用条形码玻片，系统可实现样本可追溯性和患者身份的准确识别，从而避免转录错误，提高患者数据的完整性和安全性。

本视频的总体目标是演示间接免疫荧光（IIF）实验流程，包括载玻片处理、常见IIF模式的识别，以及介绍简化和标准化该技术的新进展。

引言

抗核抗体（ANA）这一术语描述的是一类多种多样的自身抗体，可与细胞核内的各种成分发生反应，包括DNA、蛋白质和核糖核蛋白1,2。HEp-2细胞作为一种含有数百种抗原的天然蛋白质阵列，是检测抗核抗体的理想底物1。在人血清中检测抗核抗体是结缔组织病重要的筛查手段，而间接免疫荧光法（IIF）是抗核抗体检测的参考方法1。近年来，部分实验室已采用抗原特异性免疫测定和多重检测方法取代了基于HEp-2细胞的间接免疫荧光法。然而，由于抗原特异性检测方法存在假阴性结果的风险，且对临床医生而言检测过程缺乏透明度，美国风湿病学会成立了专门工作组，最终得出结论：使用HEp-2细胞的间接免疫荧光法应作为抗核抗体筛查的“金标准”1。

由于抗核抗体（ANA）筛查具有主观性，因此HEp-2细胞的质量对于准确且可靠地报告结果至关重要。高数量的有丝分裂细胞、理想的细胞形态、足够的融合度以及相关抗原的表达尤为关键。间接免疫荧光（IIF）模式识别是辅助患者诊断的重要工具。了解各种荧光模式的意义，有助于临床医生和实验室人员开展适当的后续检测以确认诊断。例如，均质型ANA荧光模式可由抗双链DNA（dsDNA）抗体或染色质抗体引起，常与系统性红斑狼疮（SLE）相关3。另一方面，近年来研究发现，所谓的致密细颗粒型（dense fine speckled, DFS）模式在常规检测样本中出现率可达12%，通常与抗DFS70抗体相关。当此类自身抗体单独存在（无其他疾病特异性ANA抗体）时，不提示系统性自身免疫性风湿病4-9。因此，针对抗DFS70抗体的确认性检测有助于减少不必要的序贯检测，显著节约成本，并减轻患者的焦虑情绪。

由于间接免疫荧光法（IIF）是检测自身抗体的首选初筛方法，因此用户必须了解试剂和组织底物的选择如何影响检测结果。由于IIF技术本身具有主观性，因此所用试剂必须能够提供最高质量的结果。

本视频方案的目标是使用户熟悉执行IIF方法所需的正确步骤、与ANA相关的常见模式，并介绍可简化实验室工作流程和标准化结果的新进展。

方案

1. 样品制备与基底选择

  1. 取出试剂并拆开包装，将各物品恢复至室温。根据说明书准备试剂，并按说明稀释患者血清。注意：NOVA Lite 载玻片带有条形码，可轻松与实验室信息系统（LIS）结合，集成到自动化系统中。本流程描述的是手动处理载玻片的操作；然而，高通量实验室可选择使用自动化载玻片处理设备。

2. 对照组与样本的添加

  1. 将阳性对照和阴性对照各1滴分别加入相应的玻片孔中。 用移液器向其余孔中加入20–25 μl稀释后的患者血清。每次处理一张玻片。
  2. 将玻片放入染色容器中，容器底部放置一张湿润的纸巾。 盖上容器，孵育30分钟。注意：湿润的环境可防止底物干燥，孔内干燥可能导致人为假象染色。在此孵育期间，患者血清中的抗核抗体将与固定在各孔细胞上的抗原结合。
  3. 孵育结束后，用轻柔的洗涤缓冲液流冲洗血清。 为避免损伤底物及防止样本在孔间交叉污染，应将玻片略微倾斜，避免缓冲液流直接冲击孔位。轻敲去除多余的洗涤缓冲液，然后将玻片放入盛有洗涤缓冲液的考普林罐中，浸泡约5分钟。

3. 添加荧光偶联物

  1. 逐一从洗涤缓冲液中取出载玻片，轻轻敲击以去除多余的缓冲液。在每孔中加入一滴荧光素偶联物（FITC标记的抗人IgG）。将载玻片置于湿盒中孵育30分钟，并确保盖上染色盒盖子。注意：对于抗核抗体（ANA）检测，建议使用针对IgG Fc段的特异性偶联物。该偶联物对光敏感，盖子不仅能维持湿化环境，还能防止载玻片暴露于光照下。在此孵育过程中，偶联物将结合已与细胞抗原结合的患者抗核抗体，从而在孔中产生荧光信号。
  2. 按照上述方法冲洗并洗涤载玻片。
  3. 将盖玻片放置在纸巾上，在其底边连续滴加封片介质。
  4. 从洗涤缓冲液中取出每张载玻片，轻轻敲击以去除多余的缓冲液，然后将载玻片底边接触盖玻片边缘。
  5. 缓慢地将载玻片放至盖玻片上，使盖玻片上的封片介质均匀覆盖至载玻片顶端，避免产生气泡。注意：封片操作，包括使用适量的封片介质，是一项需要练习才能掌握的技术。

4. 阳性与阴性结果的鉴定

人工解读

  1. 在暗室中使用荧光显微镜观察载玻片。采用20X或25X物镜对整个孔进行扫描，以评估细胞分布及荧光均匀性
  2. 切换至40X物镜，对阳性结果及其荧光模式进行最终判读
  3. 观察阳性与阴性对照。使用1+至4+的反应性分级标准对阳性程度进行评分。注意：阴性对照可能并非完全无荧光，通常会显示低水平的非特异性荧光。阳性对照将在细胞核中呈现明亮的苹果绿色荧光（图1）

自动解读

注意：除了人工判读外，还可使用 NOVA View 全自动荧光显微镜或其他全自动数字成像仪器加载并扫描载玻片，无需暗室。通过选择适当的玻片类型创建项目后，仪器将自动获取并存储每个孔中细胞的高分辨率数字图像。此外，NOVA View 可测量荧光强度，将结果分类为阳性或阴性，并对阳性样本提供模式识别。操作人员可在高分辨率计算机显示器上查看图像，从而对 NOVA View 的结果进行最终判读、修正和确认。可根据确认后的结果生成报告。数字显微镜应由经验丰富的实验室技术人员配合使用，因其旨在辅助结果判读。

结果

在评估 HEp-2 细胞染色结果时，最常见的五种主要核型模式为：均质型、斑点型、着丝点型、核仁型和核点型。这些模式是自身抗体与细胞核内特定组分结合的结果。尽管抗核抗体（ANA）检测主要针对核结构，但有时也可观察到与针对细胞质结构的自身抗体相关的细胞质染色模式。在某些情况下，样本中可能同时存在多种自身抗体，图像可能呈现为混合型模式。

还存在其他一些较少见且常与细胞周期特定阶段相关的荧光模式，可通过间接免疫荧光法（IIF）检测到；最近，已在部分抗核抗体（ANA）阳性血清中发现一种具有特殊临床意义的所谓密集细颗粒样（dense fine speckled）模式。

均一型模式

为识别均质型模式，需扫描孔板并寻找有丝分裂或正在分裂的细胞。有丝分裂细胞的凝集染色质（图2，橙色箭头）表现出坚实且均匀的荧光，通常比静止期细胞核的荧光更明显。在均质型模式中，静止期细胞表现出整个细胞核的均匀、弥散性荧光（图2，白色箭头）。这种特征性模式通常由抗dsDNA抗体引起10。

斑点型模式

在粗颗粒型模式中，有丝分裂细胞的凝缩染色体区域无着色（图3，橙色箭头）。静止期细胞在整个细胞核内呈现颗粒状荧光。核内颗粒分布可分为粗颗粒型或细颗粒型。粗颗粒型模式通常由抗Sm抗体和抗RNP11引起。

在细颗粒型模式中，静止细胞的细胞核内呈现细小或弥散的颗粒状荧光，通常分布均匀（图4，白色箭头）。细颗粒型模式常由抗SSA和抗SSB抗体引起12。

致密细颗粒型荧光模式

目前公认，在常规检测中，致密细颗粒型（DFS）较为常见，多达12%的样本可检测到抗DFS70自身抗体。然而，当这些自身抗体单独存在时，与系统性自身免疫风湿性疾病（SARD）无关4-6。这些抗体在健康个体以及患有非SARD相关疾病患者中均较为普遍6。对抗DFS70抗体进行确证检测，有助于减少不必要的追加检测，显著节约成本，并减轻患者的焦虑情绪。

由于DFS模式难以识别，且ANA阳性可能引起患者和医生的焦虑，因此在发现提示抗DFS70抗体的模式后，强烈建议进行确证试验，以明确ANA阳性的临床意义5,6。

在此模式中，有丝分裂细胞（图5，橙色箭头）显示中期染色质呈阳性斑点状染色，而静止期细胞核（图5，白色箭头）则在整个细胞核内呈现均匀分布的细小斑点。

着丝粒模式

为识别着丝粒模式，需扫描孔板并鉴定有丝分裂或分裂期细胞。在有丝分裂细胞中（图6，橙色箭头），这些离散的斑点会紧密聚集，通常被称为“中期板”。在着丝粒模式中，静止期细胞（图6，白色箭头）的细胞核内可见约40–60个离散的斑点，分布于整个核内。该着丝粒模式是由抗CENP A、B、C抗体所致13。

核仁型荧光模式

某些核仁型荧光模式伴有有丝分裂细胞中弥散的胞质染色（图7，橙色箭头）以及染色体区域的阴性染色，而其他核仁型则表现为染色体区域阳性染色。核仁型通常表现为核仁呈均质型或颗粒型染色（图7，白色箭头），同时伴有核质弱颗粒型或弱均质型染色。此类荧光模式与抗RNA聚合酶III抗体、抗纤维蛋白抗体、抗Th/To抗体以及抗PM/Scl抗体相关14,15。

核点型模式

核点型模式与分裂中期细胞呈阴性（图8，橙色箭头）以及静止期细胞核中少量离散的颗粒状荧光（图8，白色箭头）相关。这种特征性模式通常由SP-100、PML或p80螺旋蛋白自身抗体引起。这些抗体与原发性胆汁性胆管炎和自身免疫性肝炎相关16。

荧光显微镜图像，绿色荧光细胞显示基因表达分析结果。
图1. 阴性对照（左）：细胞显示低水平的非特异性荧光，无特异性细胞核染色。阳性对照（右）：细胞显示苹果绿色的细胞核荧光。

经荧光显微镜成像的细胞培养物中DNA染色的细胞核，用于观察细胞分裂。
图2. 均质型模式。 有丝分裂细胞（橙色箭头）呈现完整荧光，静止期细胞显示均匀、弥散的染色（白色箭头）。

荧光显微镜下的细胞分裂；细胞核染色，有丝分裂细胞标记；生物学分析。
图3. 粗颗粒型染色模式。 有丝分裂细胞（橙色箭头）呈阴性染色，静止期细胞则显示明显的颗粒状染色（白色箭头）。

荧光显微镜图像，带有标记的细胞；细胞生物学，蛋白质定位研究。
图 4. 细颗粒型模式。 有丝分裂细胞（橙色箭头）显示阴性染色，静止期细胞则呈现明显的细颗粒状染色（白色箭头）。

荧光显微镜图像，细胞核标记，突出显示蛋白质定位。
图 5. 致密细颗粒斑点模式。 有丝分裂细胞（橙色箭头）显示细颗粒状均匀染色。静止期细胞显示非常细微、弥散的斑点状染色（白色箭头）。

显示细胞核中DNA标记的荧光显微镜图像；突出显示蛋白质定位。
图6. 着丝粒模式。 有丝分裂细胞（橙色箭头）显示均匀、离散的斑点。静止期细胞（白色箭头）显示每个细胞核中有40-60个离散的斑点。

细胞的荧光显微镜图像，显示细胞膜和细胞核结构。
图7. 核仁型模式。 有丝分裂细胞（橙色箭头）呈现为大片颗粒状染色的聚集。静止期细胞的细胞核在核仁处显示荧光（白色箭头）。

显示蛋白质定位的细胞荧光显微镜图像；细胞研究；绿色荧光。
图8. 核点型模式。 有丝分裂期细胞（橙色箭头）呈阴性。静止期细胞在细胞核内显示少数离散的颗粒状荧光点（白色箭头）。此外，核点型模式可与针对线粒体抗原的自身抗体相关的胞质染色共存（红色箭头）。

讨论

采用HEp-2细胞进行筛查是诊断自身免疫性风湿病（SARD）患者的首要关键步骤。然而，间接免疫荧光（IIF）方法缺乏标准化。造成变异性的来源包括载玻片的制备、荧光标记抗体的特异性、荧光显微镜的性能以及读片人员的经验。尽管存在这些局限性，IIF仍是抗核抗体（ANA）检测的“金标准”。HEp-2细胞含有多种多样的自身抗原，是检测这些自身抗体的理想底物。在一些实验室中，IIF已被固相筛查方法（如多重检测或ELISA）所取代。此类检测的不足之处在于无法充分展示全部抗原谱，导致敏感性不足。因此，可能漏检真正的阳性患者，从而带来不良后果。除了治疗延误和误诊问题外，还可能因重复确认性检测或不必要的诊断性检查而增加医疗成本。鉴于IIF本身存在的固有挑战，正确规范地执行该技术至关重要，以避免结果的主观性。

为了确保抗核抗体（ANA）筛查结果的准确解读与报告，使用最高质量的底物至关重要。在选择HEp-2底物时，必须确保细胞经过优化，能够在天然蛋白状态下表达具有临床意义的抗原表位。转染或其他方式修饰的HEp-2细胞系可能无法实现抗体与抗原的正常结合。此外，当多种不同的自身抗体同时存在时，重组细胞可能会掩盖其中一种或多种荧光模式。底物中还应含有较多数目的有丝分裂细胞，足够数量的有丝分裂细胞有助于快速而准确地识别荧光模式。

除了底物的特性外，本视频方案的目的还在于通过展示关键步骤来描述间接免疫荧光（IIF）技术，这些步骤包括样本的添加、玻片洗涤、结合物的添加、盖玻片封片以及阳性与阴性结果的判定。如果这些步骤中未采用正确的操作技术，结果可能会受到影响。正确的洗涤步骤对于去除所有未结合的抗体至关重要。某些患者体内存在非常高浓度的自身抗体，在这些情况下，必须彻底清洗反应孔中的血清，以防止其污染其他孔。

尽管间接免疫荧光法（IIF）传统上是一种非常耗时且依赖主观判断的实验室方法，但新型技术如切片处理器、条形码载玻片和自动数字显微镜可显著简化操作流程，提高结果一致性，并减少判读过程中的变异来源。

披露

作者 Gabriella Lakos、Cassandra Bryant、Carol Buchner 和 Anna Eslami 是 INOVA 诊断公司的员工。

致谢

感谢Cassandra Bryant完成IIF实验，以及Carol Buchner对本文的技术审校。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NOVA Lite HEp-2 IgG（DAPI 结合物）INOVA Diagnostics708102
NOVA View 仪器INOVA DiagnosticsNV2000
QUANTA Link 工作站INOVA DiagnosticsLINK010
QUANTA Link 工作站许可证INOVA DiagnosticsLINK001
条形码扫描仪INOVA DiagnosticsLINK019

参考文献

  1. Meroni, P. L., Schur, P. H. ANA screening: an old test with new recommendations. Ann Rheum Dis. 69 (8), 1420-1422 (2010).
  2. Tan, E. M. Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in immunology. 33, 167-240 (1982).
  3. Sack, U., et al. Autoantibody detection using indirect immunofluorescence on HEp-2 cells. Ann NY Acad Sci. 1173, 166-173 (2009).
  4. Watanabe, A., et al. Anti-DFS70 antibodies in 597 healthy hospital workers. Arthritis Rheum. 50 (3), 892-900 (2004).
  5. Mahler, M., et al. Importance of the dense fine speckled pattern on HEp-2 cells and anti-DFS70 antibodies for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Autoimmun Revi. 11 (9), 642-645 (2012).
  6. Mahler, M., Fritzler, M. J. The clinical significance of the dense fine speckled immunofluorescence pattern on HEp-2 cells for the diagnosis of systemic autoimmune diseases. Clin Dev Immunol. , (2012).
  7. Miyara, M., et al. Clinical phenotypes of patients with anti-DFS70/LEDGF antibodies in a routine ANA referral cohort. Clin Dev Immunol. , (2013).
  8. Mariz, H., et al. Pattern on the antinuclear antibody-HEp-2 test is a critical parameter for discriminating antinuclear antibody positive healthy individuals and patients with autoimmune rheumatic diseases. Arthritis Rheum. 63 (1), 191-200 (2011).
  9. Muro, Y., et al. High concomitance of disease marker autoantibodies in anti-DFS70/LEDGF autoantibody-positive patients with autoimmune rheumatic disease. Lupus. 17 (3), 171-176 (2008).
  10. Agmon-Levin, N., et al. International recommendations for the assessment of autoantibodies to cellular antigens referred to as anti-nuclear antibodies. Ann Rheum Dis. 73 (1), 17-23 (2014).
  11. Craft, J., et al. The U2 small nuclear ribonucleoprotein particle as an autoantigen. J Clin Invest. 81 (6), 1716-1724 (1998).
  12. Salomonsson, S., et al. A serologic marker for fetal risk of congenital heart block. Arthritis Rheum. 46 (5), 1233-1241 (2002).
  13. Miyawaki, S., et al. Clinical and serological heterogeneity in patients with anticentromere antibodies. J Rheumatology. 32 (8), 1488-1494 (2005).
  14. Raijamkers, R., et al. PM-Scl-75 is the main autoantigen in patients with the polymyositis/scleroderma overlap syndrome. Arthritis Rheum. 50 (2), 565-569 (2004).
  15. Yang, J. M., et al. Human scleroderma sera contain autoantibodies to protein components specific to the UC small nucleolar RNP complex. Arthritis Rheum. 48 (1), 210-217 (2003).
  16. Granito, A., et al. Antinuclear antibodies as ancillary markers in primary biliary cirrhosis. Expert Rev Mol Diagn. 12 (1), 65-74 (2012).

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