小鼠模型中的子宫-输卵管胚胎移植与输精管结扎术

摘要

子宫-输卵管胚胎移植利用子宫-输卵管连接处作为屏障，防止胚胎在进行子宫移植时发生外流。获取用于胚胎移植的假孕受体需要使用输精管结扎的雄性动物。本文讨论了这两种技术。

摘要

将植入前胚胎移植到代孕雌性个体是生产基因修饰小鼠或研究植入前发育期间表观遗传改变对后续胎儿发育及成年健康影响的必要步骤。采用一种高效且稳定的胚胎移植技术，对于提高基因修饰动物的制备效率、确定不同处理对胚胎着床率及足月存活率的影响至关重要。囊胚阶段的胚胎通常通过子宫移植方式进行移植，即在子宫壁上打孔以插入胚胎操作移液管。然而，移液管撤出后子宫上的穿刺孔无法闭合，由于子宫内正压的存在，胚胎可能流入腹腔。此外，穿刺还可能引起出血，从而影响胚胎着床、堵塞移植移液管，并可能损害胚胎发育，尤其是在移植无透明带（zona）胚胎时更为明显。因此，该技术常导致胚胎存活率总体偏低且结果变异较大。为避免上述不利影响，子宫-输卵管胚胎移植技术利用子宫-输卵管连接处作为天然屏障，防止胚胎外流，并避免对子宫壁进行穿刺。该方法需要使用输精管结扎的雄性小鼠以获得假孕受体。本文还描述了一种输精管结扎术的操作方法，作为子宫-输卵管胚胎移植的配套技术。

引言

胚胎移植可能是小鼠模型中最常见的外科手术操作。该技术对于获得经过特定处理的胚胎所产生的后代至关重要 体外 操作技术，因此成为通过原核显微注射、慢病毒转导或嵌合体形成构建转基因模型所必需的步骤。此外，该技术可用于研究植入前发育期间各种损伤对胚胎发育的影响。人工生殖技术的应用¹ 或暴露于不同物质或代谢物的异常浓度² 可能影响胚胎发育，导致着床或胎盘形成失败，并对子代产生长期影响。一种可靠且可重复的胚胎移植技术对于以一致的方式检测实验处理对着床和胎儿发育可能产生的负面影响至关重要。

小鼠着床前胚胎可根据其发育阶段，移植到假孕受体雌鼠的输卵管中（通过0.5天交配后（dpc）受体的壶腹部进行输卵管移植）^3,4，或移植到2.5 dpc假孕受体雌鼠的子宫内（子宫移植）^5,6。囊胚阶段的胚胎（例如通过注射胚胎干细胞或诱导多能干细胞制备嵌合小鼠所用的胚胎）通常采用子宫移植。囊胚也可移植至0.5 dpc受体的输卵管，但这种方法对发育干扰因素的检测生理相关性较低，因为胚胎会经历植入前的滞育期，并在着床前有2天时间从损伤中恢复。子宫移植需要使用细针穿刺子宫壁，以形成一个开口，使胚胎操作移液管能够进入子宫腔。尽管该技术可能获得一定成功，但胚胎发育至出生后代的存活率（即移植胚胎中最终发育为仔鼠的比例）通常较低且难以预测^7,8。

方案

所有动物实验均经贝尔茨维尔地区动物护理与使用委员会（BAACUC 11-015）批准，符合美国农业部动物护理与使用指南的要求。

1. 麻醉与镇痛（两种外科手术通用）

1. 称重 小鼠并加载以下内容 麻醉剂 以及分别装有镇痛剂的两个1 ml注射器（27 G针头）：
   1. 氯胺酮（0.1 mg/g：10 mg/ml 溶液，0.01 ml/g）和赛拉嗪（0.01 mg/g：2 mg/ml 溶液，0.005 ml/g）。
   2. 布托啡诺（0.1 μg/g：0.01 ml 的 0.01 mg/ml 溶液。
2. 用拇指和食指尽可能靠近小鼠下颌处抓起其颈背部皮肤，同时用小指和无名指夹住尾巴，以固定小鼠。
3. 注射 氯胺酮-赛拉嗪 混合物 腹腔内为避免刺穿内脏器官，应将小鼠头部略低于其髋部进行固定图 1A)
4. 注射 皮下注射布托啡诺 用拇指和食指捏住颈部后方的皮肤图 1B).
5. 将小鼠置于笼中（笼子需清洁且无其他动物），放在加热台上。
6. 失去意识后，检查是否无

结果

子宫-输卵管胚胎移植提供了一种将胚胎移植至子宫的方法，可避免与子宫内胚胎移植相关的一些并发症^2,9,10在 表1 我们展示了一些代表性结果，这些结果是通过将经历不同操作处理的CD1囊胚按照所述方案移植到CD1受体小鼠体内获得的。仅进行培养的胚胎与经慢病毒处理的胚胎在存活至出生（发育为仔鼠的胚胎百分比）或存活至E15阶段的比率上相似。 体外 从受精卵阶段（IVC）开始，将胚胎进行iPSC注射以产生嵌合幼崽，以及那些已对其 透明带 移除后暴露于慢病毒中7小时，再进行胚胎移植。因此，子宫-输卵管胚胎移植是一种可靠的胚胎转移技术，尤其适用于较复杂的胚胎，例如那些缺失特定成分的胚胎 透明带 并与慢病毒共孵育。

讨论

输精管结扎术是一种相对简单的外科手术技术，不涉及重大操作困难。使用聚维酮碘和乙醇进行消毒时，需确保最后一次乙醇冲洗彻底清除聚维酮碘，因其可能刺激腹膜。手术入路的暴露需 输精管 也可以通过阴囊或在腹部做横向切口来实现⁸与横腹切口相比，阴囊切口因所需切口较小且术后行为略优，已被推荐使用¹¹然而，我们更倾向于采用腹部切口而非阴囊切口，因为它能更方便、更清晰地暴露手术视野 输精管 来自双侧睾丸，避免初学者外科医生对同一部位重复电凝 输精管 并留下一个功能性 输精管在两种腹部手术技术之间，我们更倾向于采用纵行切口 白线 横切口不切断任何腹肌纤维，因此可避免腹疝的发生。然而，输精管结扎术和子宫输卵管胚胎移植操作步骤可根据现有设备或研究者的个人偏好进行调整。例如，可使用玻璃珠灭菌器加热用于烧灼的镊子 输精管在任何情况下，都必须遵循无菌操作技术，提供适当的麻醉和镇痛，以最大程度地保障动物福利，并遵守当地法规。

另一个可进行修改的方面是麻醉方案。如果.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	VEDCO	Ketaved ANADA 200-257	须由持证兽医订购。
赛拉嗪	Lloyd Laboratories	Anased NADA #139-236	须由持证兽医订购。
丁丙诺啡	通用	NDC 400-42-010-01	须由持证兽医订购。
眼膏	诺华	Genteal
抗生素	辉瑞	Clavamox NADA #55-101.	加入饮用水中（每毫升含0.3 mg三水合阿莫西林和0.075 mg克拉维酸钾）。将15 ml重悬后的药瓶取1.5 ml加入250 ml水中。
持针齿镊（直型）	ROBOZ	RS-8120	任何中等尺寸的外科级不锈钢直镊均可使用。
显微齿镊（带锯齿）	ROBOZ	RS-5137	此类镊子呈90º弯曲。如需要，也可使用直型镊子。
微细弯头显微解剖镊	ROBOZ	RS-5136	该型号特别适用于夹持输卵管。
剪刀	ROBOZ	RS-5880	任何常规的小型外科级不锈钢直剪均可使用。
27 G针头	贝克顿-迪金森	305136	也可使用更细的针头（30 G）；25 G可能略粗。
夹钳施加器	MiKRon	42763
9 mm夹钳	MiKRon	427631
夹钳移除器	MiKRon	7637	可用两把带齿镊（ROBOZ RS-8160）替代。
缝合针持	ROBOZ	RS-7820
缝合线	Dowist Gell	5-0 Dexon S 7204-21	可替换为任何4-0至6-0的可吸收缝线，配细小弯针。
玻璃毛细管	VWR	100 ul校准移液器 53432-921	包含口吸系统，仅需在管路中连接一个0.22 µm滤器即可使用。更多信息可参见Nagy et al.8
燃气灯	KISAG AG	Typ 2002	气体驱动的燃气灯，可使用同厂家提供的Kigas气体（CH-4512）。也可使用酒精灯，但燃气灯温度更高，且此型号可提供小而精确的火焰。
体视显微镜	徕卡	MZFLIII	这是一台带荧光功能的高端体视显微镜，也可用于其他用途。也有更经济的选择，例如徕卡MZ8、尼康SMZ-10或SMZ-2B等。建议使用两台体视显微镜，一台用于胚胎操作（无需高端型号），另一台用于受体操作。用于受体的显微镜应具备较长的工作距离，即载物台到物镜之间的距离应足够长，以便能对焦于载物台上方3-4 cm处（输卵管放置位置），同时为手术操作留出空间；大多数体视显微镜具备此功能，但部分型号不能。
光纤照明系统	Dolan Jenner	Fiber lite	用于照亮手术区域。市面上有多种系统可供选择。
加热载物台	American scope	http://store.amscope.com/tcs-100.html	可放置于体视显微镜的载物台上。若加热台过短，可能需要进行一些改装（如插入支撑杆以调平）。如有条件，可使用较大的加热台为笼盒保温；若无，也可使用普通加热垫，但必须监测温度。
胚胎操作用培养皿	Falcon	353001	也可使用351008型号；后者形成的液滴更窄。