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方法文章

利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

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DOI：

10.3791/51216

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2014年1月31日

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

本文内容

摘要

我们介绍一种实验设计方法，可用于确定并建模转基因调控元件、植物生长与发育参数以及培养条件对植物中单克隆抗体和报告蛋白瞬时表达的影响。

摘要

植物在生物制药生产方面具有多种优势，包括成本低、可扩展性强以及安全性高。瞬时表达还具有研发和生产周期短的额外优点，但不同批次间的表达水平可能存在显著差异，从而在良好生产规范（GMP）背景下引发监管方面的关注。我们采用实验设计（DoE）方法，评估了表达载体中的调控元件、植物生长与发育参数以及表达期间的孵育条件等主要因素对批次间表达变异性的影响。我们测试了表达一种模型抗HIV单克隆抗体（2G12）和一种荧光标记蛋白（DsRed）的植物。我们讨论了选择该模型特定特性的依据，并指出了其潜在局限性。该通用方法可轻松推广至其他问题，因为该模型的原则具有广泛适用性：基于知识的参数选择、通过将初始问题分解为较小模块以降低复杂性、由软件指导设置最优实验组合以及逐步优化实验设计。因此，该方法不仅适用于植物中蛋白表达的表征，也适用于缺乏机制性描述的其他复杂系统的研究。所建立的描述参数间相互关联性的预测方程可用于构建其他复杂系统的机制模型。

引言

利用植物生产生物制药蛋白具有优势，因为植物种植成本低廉，该平台只需通过增加种植数量即可实现规模扩大，且人类病原体无法在植物中复制1,2。基于农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染叶片等方法的瞬时表达策略可带来额外益处，因为从DNA递送到获得纯化产物的时间可从数年缩短至不到2个月3。瞬时表达还常用于功能分析，例如检测基因是否能够弥补功能缺失型突变体的表型，或研究蛋白质相互作用4-6。然而，瞬时表达水平的批次间变异通常大于转基因植物中的表达水平7-9。这会降低基于瞬时表达的生物制药生产工艺在现行药品生产质量管理规范（GMP）下获得批准的可能性，因为可重复性是一项关键质量属性，需接受风险评估10。此类变异还可能掩盖研究人员拟研究的任何相互作用。因此，我们着手鉴定影响植物中瞬时表达水平的主要因素，并构建一个高质量的定量预测模型。

一次只改变一个因素（OFAT）的方法常被用于表征影响（效应) 某些参数的因素) 对结果的影响（反应实验的） 11。但这种方法并不理想，因为各个检测（运行) 在调查期间实验将通过所测试因素构成的潜在作用范围，像串珠一样对齐排列（设计空间）。如图所示，实验设计空间的覆盖范围较低，因此从实验中获得的信息量也较少。 图1A 12此外，不同因素之间的相互依赖性（因素相互作用) 可能会隐藏，导致模型效果不佳和/或预测出虚假的最优值，如图所示 图1B 13.

通过采用实验设计（DoE）方法，可以避免上述缺点，该方法使实验运行在设计空间内更均匀地分布，这意味着在两次运行之间可以同时改变多个因素14。针对混合物、因素筛选（因子设计）以及因素对响应影响的定量分析（响应面方法，RSM）已有专门的设计15。此外，RSM 可以通过中心复合设计实现，也可以借助专用软件有效实现，此类软件可根据不同标准选择实验运行点。例如，所谓的 D-最优性标准会选择使最终模型系数误差最小的实验运行，而 IV-最优性标准则选择在整个设计空间内预测方差最低的实验运行15,16。本文所述的 RSM 方法可用于精确量化植物中瞬时蛋白表达，也可轻松推广至任何涉及多个（约 5–8 个）数值型因素（例如 温度、时间、浓度）和少量（约 2–4 个）类别型因素（例如 启动子、颜色）且缺乏机制性描述或机制过于复杂而难以建模的系统。

实验设计（DoE）方法起源于农业科学，但由于其可推广至任何需要减少实验次数以获得可靠数据并为复杂过程建立描述性模型的场景，现已扩展到其他领域。这也促使实验设计（DoE）被纳入由人用药品注册技术要求国际协调会议（ICH）发布的《工业指南 Q8(R2) 药物开发》17。目前，DoE 已在科学研究和工业界得到广泛应用18。然而，在实验的规划与实施过程中必须谨慎，因为为多元线性回归模型（基础模型）选择不合适的多项式阶数可能导致需要额外的实验运行次数，才能正确建模所有因素效应。此外，数据的损坏或缺失会产生错误的模型和有缺陷的预测结果，甚至可能如本方案与讨论部分所述，导致无法进行任何模型构建18。在本方案部分，我们将首先阐述基于响应面法（RSM）实验最重要的规划步骤，然后以 DoE 软件 DesignExpert v8.1 为例说明实验设计的构建过程。但使用其他软件（如 JMP、Modde 和 STATISTICA）也可构建类似的设计。实验步骤之后将提供数据分析与评估的操作说明。

主成分分析和响应面图，因素 A、B、C；多变量分析，统计模型
图 1. OFAT 与 DoE 方法的比较。 A. 在实验中依次每次改变一个因素（OFAT）（黑色、红色和蓝色圆圈）对设计空间的覆盖范围较低（阴影区域）。相比之下，采用实验设计（DoE）策略同时改变多个因素（绿色圆圈）可提高覆盖范围，从而提升所得模型的精确性。B. 由于设计空间覆盖存在偏差，OFAT 实验（黑色圆圈）可能无法识别最优操作区域（红色），并预测出次优解（大黑色圆圈）；而 DoE 策略（黑色星号）更有可能识别出更优条件（大黑色星号）。

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方案

1. 规划实验设计策略

  1. 确定设计中需包含的相关因素与响应变量。
    1. 定义一个或多个用于测量的响应指标。此处使用了2G12和DsRed的表达水平（μg/ml），包括被视为有意义的最小可检测差异（10 和 20 μg /毫升，分别）以及系统估计标准偏差的近似值（4 和 8 μg/ml根据先前的实验结果。
    2. 利用现有文献、前期实验数据或专业筛选设计方案（例如 析因设计，参见引言）以筛选出对响应值具有显著影响的因素，并对其影响程度进行量化（表1) 7,8,19,20.
    3. 分配因子类型（数值型或类别型），并选择在实验设计（DoE）研究中将要变动的数值型因子的取值范围表1).
    4. 确定难以实现连续变化的数值因素。
      1. 避免对无法精确调节至特定水平的因素使用连续变化。 例如 孵育温度通常只能控制在 ±2 °C因此，使用如下数值进行连续变化 27.2 °C, 25.9 °C，以及 29.3 °C 必须避免。
      2. 相反，为这些因素选择若干个离散的水平（表1）。层数应与预期的基础模型（步骤 1.2）相匹配。 这一点仅对最优设计重要，因为中心复合设计的因子水平始终是离散的。
    5. 指定分类因子为名义型， 即 无隐含顺序例如 不同制造商），或为有序的离散数值参数（例如 植物上的不同叶片。
    6. 选择两种类型分类因子的水平。
  2. 选择一个有用的基础模型。
    1. 根据预实验和文献资料，预测各因素与响应之间的关系，以及因素间交互作用与响应的关系。例如，线性关系（越多越好）、二次曲线关系（单一最优值或非线性增加/减少）或三次曲线关系（偏斜的最优值）。
    2. 确保离散数值因子的水平数为 n + 1，其中 n 为因子与响应之间关系的多项式次数。例如，若温度对响应的影响预计为二次关系，则 n = 2，因此至少应考察三个温度水平，以实现对二次效应的拟合。
  3. 定义预测方差应低于某一阈值（α水平）的设计空间比例（FDS）。该FDS应为 >0.95（覆盖超过设计空间的95%），以获得在整个设计空间内均能实现稳健预测的模型 21-23 .
    注：0.05 的阈值对应于 5% 的显著性水平（I 类错误），是典型取值。提高该值将减少实验设计（DoE）策略所需的实验次数，但同时会增加遗漏显著效应的可能性，并导致对响应影响的估计出现错误。

显示某项研究中数值型、类别型变量及其水平值的实验因素表。
表1. 影响烟草中瞬时蛋白表达的因素，包括实验设计（DoE）中的变化范围。 加粗的因素仅包含在“利用不同启动子/5'非翻译区建立DsRed瞬时表达积累的描述性模型”所述实验的设计中；斜体因素仅包含在“通过瞬时表达优化植物中单克隆抗体生产的孵育条件与采收方案”所述实验的设计中。

因子分析图，包含属性分配、模型选择、预测能力定义和数据传输。
图 2. 实验设计（DoE）规划流程。 根据现有数据，选择对所研究响应具有显著影响的因子。然后确定因子属性（例如 数值型）、范围和水平。利用先前的知识和实验结果，确定一个合适的基础模型。根据最终模型的应用/目的，定义其预测能力要求。随后可将整理好的数据导入相应的实验设计（DoE）软件中。

2. 在 DesignExpert 中设置 RSM

  1. 启动 DesignExpert 并选择“新建设计”。在“响应曲面”窗口中，选择“最优设计”，并输入第 1.1 节中选定的数值因子和类别因子的数量。
  2. 在相应字段中输入所有因子的名称、单位、类型、子类型、水平数/水平边界以及各水平的具体数值。
  3. 进入下一页，在“搜索”选项中选择“最佳”，并选择所需的“最优性”准则，此处为“D-最优性”。
  4. 在“编辑模型…”菜单中，选择包含第 1.2 节中预期因子及交互作用的模型。若不确定，可选择一个完整的模型，涵盖特定多项式阶数下的所有因子及交互作用，此处为“二次模型”。注意：选择包含所有交互作用的完整模型可能会增加实验设计（DoE）所需的实验次数。
  5. 选择“区组”数量。此处使用单个区组，因为所有植物来自同一批次，所有细菌同时培养，且所有注射操作均由同一操作者在同一天完成。若使用多批植物或由多名操作者进行注射，则应使用多个区组。
  6. 平衡设计
    1. 启用“强制类别因子平衡”，以使实验运行在类别因子各水平之间均匀分布，例如测试的不同启动子。
      注意：这可能会在一定程度上降低设计的最优性，DesignExpert 将根据最优性算法所选点位报告为一个百分比值。
    2. 使用内置的随机种子算法多次重新计算设计，以最小化最优性下降。
      注意：使用相同输入数据时，最优性损失可能在 ~3–40% 范围内波动，但可通过调整重复次数来维持类别因子的平衡。
  7. 软件将根据基础模型建议“模型点”数量，此处为 70 次运行。调整“重复”和“用于估计失拟”的运行次数，确保每项均超过“模型点”总数的 >5%，此处各为 10 次运行。
  8. 进入下一页，选择响应变量数量，并输入其名称和单位。在数据分析过程中，可随时添加额外响应变量，不会对设计产生任何负面影响。
  9. 继续启动算法，计算实验设计（DoE）各次运行的因子水平。若所选基础模型与某一因子的水平数不匹配，系统将显示通知且计算不会开始。此时可采取以下任一措施：
    1. 增加该因子的水平数；或
    2. 取消选择基础模型中无法根据当前水平数计算的项。
    3. 例如，若当前设计中因子“孵育时间”t 有两个水平（即 2 d 和 5 d），而所选基础模型为包含项 t2 的二次模型，则可为 t 增加第三个水平（即 8 d），或从模型中移除因子 t2。
  10. 计算完成后，保存显示的最优因子组合电子表格。
  11. 在“设计”节点中选择“评估”子节点，并进入“图形”选项卡。
    1. 在“图形工具”中选择“FDS”，在“FDS 图形”框中选择“Pred”作为误差类型。然后输入最小可检测差异以及第 1.1.1 节中定义的系统估计标准差近似值，分别作为“d”和“s”的值（此处 DsRed 为 20 和 8 μg/ml）。同时输入适用于该应用的显著性水平 α（可接受的漏检显著效应百分比），通常为 0.05（5%）。
    2. 确保计算得到的 FDS 与第 1.3 节中定义的百分比相符（预测模型通常要求 >0.95）。FDS 图中曲线越平坦越好，表明在整个设计空间内预测精度均匀。
      1. 若不符合此要求（如此处所示，FDS 为 1%，见图 3A），返回“设计”节点，在工具栏中选择“设计工具”，然后选择“增强设计…”，并选择“增强”。
      2. 选择与之前相同的“搜索”和“最优性”准则，以及相同的“编辑模型”和“强制类别因子平衡”设置。若在任何实验开始前进行设计增强（如此处所示），则将“将运行放入区组”设置更改为“Block1”。
      3. 在“运行”部分输入额外的“模型点”数量，确保在整个设计中“重复”和“用于估计失拟”至少占 5%。此处增加了 100 次额外运行，未包含“重复”和“用于估计失拟”。
      4. 计算完成后，按上述方法重新检查 FDS 图形。若 FDS 仍不理想，重复上述设计增强步骤。此处增强后 FDS 达到 100%，因此无需进一步增强（图 3B）。

标准误差预测图 A 和 B，显示设计空间分数分析。
图 3. FDS 图的比较。A. 一个包含 90 次实验的实验设计（DoE）仅产生 1% 的 FDS，用于预测标准误差，该结果基于二次基础模型，并结合最小可检测差异（20 μg/ml）和系统估计标准偏差（8 μg/ml）的取值。 B. 将实验设计（DoE）扩充至总共 210 次实验后，实现了 100% 的 FDS 和一条平坦的曲线，表明在整个设计空间内模型具有均匀的精确度。

3. 表达盒的克隆与分析

  1. 培养 大肠杆菌 在5 ml LB培养基（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母提取物，170 mM NaCl，50 mg/L氨苄青霉素；制备LB琼脂平板时另加15 g/L琼脂）中 37 °C 在160 rpm的摇床中孵育6-8小时或过夜。注意：氨苄青霉素为有害物质。将LB培养基接种以下任一菌种 50 μl 液体培养物或使用移液器吸头从平板上生长的菌落中转移细胞。
  2. 用于从pPAM（GenBank AY027531）及其其他衍生物中纯化pSo质粒DNA， E. coli K12 菌株 DH5α，按照 DNA 纯化试剂盒说明书中的指示操作 24 注意：纯化试剂盒含有有害化学物质（详见上述说明书）。质粒序列在 图4 和买家 等 20 .
  3. 通过测量纯化洗脱液的吸光度来确定其DNA浓度 2 μl 使用 NanoDrop 仪器在 260 nm 处测定样品。
  4. 通过限制性内切酶（REs）消化鉴定纯化质粒DNA的正确性。
    1. 根据质粒序列选择限制性内切酶（REs），以产生独特且可区分的片段模式。遵循制造商推荐的消化反应条件，如反应体积、时间、温度以及稳定剂牛血清白蛋白的浓度。根据分析设备的灵敏度，每次消化使用50–500 ng质粒DNA。
    2. 制备0.8–2.0%凝胶以分离DNA片段，方法是在Tris-硼酸-EDTA（TBE）缓冲液（90 mM Tris，90 mM 硼酸，2 mM EDTA；pH 8.0）中煮沸琼脂糖。预期片段越大，凝胶中使用的琼脂糖含量应越低。
    3. 添加 5 μl 五倍上样缓冲液（5x SABU，0.1% (w/v) 溴酚蓝，0.1% (w/v) 茴香青，10% (w/v) 甘油溶于TBE中） 50 μl RE处理的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，100 V条件下电泳约40分钟，或直至DNA片段实现清晰分离。每块凝胶均需设置一条加样孔用于加载DNA分子量标记物，以便比较。 例如 2-3 μl 1-kb DNA ladder
  5. 将 pSo 中的 omega 5'UTR 替换为其他三个 5'UTR 之一。
    1. 释放 omega 5'UTR 序列从 ~4 μg 用20单位的酶处理纯化pSo DNA 生态学RI-HF 和 NcoI-HF 限制性内切酶在 NEBuffer 4 中 37 °C 约60分钟。然后按照第3.4.2和3.4.3节所述分离片段。
    2. 使用凝胶回收试剂盒，按照制造商说明书从琼脂糖凝胶中回收较大片段（pS，“骨架”） 25 并按照第3.3节所述方法测定纯化后DNA的浓度。注意：凝胶回收试剂盒含有有害化学物质，详见说明书。
    3. 从合适的供体质粒中分离CHS、CHS-LPH和TL的5'非翻译区（5'UTR），通过处理约10 μg 每种载体使用20个单位 生态学RI-HF 和 NcoI-HF REs 在 NEBuffer 4 中 37 °C 约60分钟。然后按照3.4.2和3.4.3节所述分离片段，并按照3.5.2节所述纯化含有较小5'UTR的片段。
    4. 将分离纯化的5'UTR分别与分离纯化的线性pS载体在不同等份中连接 25 °C 根据制造商的建议，孵育5分钟 26使用约 50 ng 的载体 DNA 和三倍摩尔过量的 5'UTR DNA，总体积为 20 μl.
  6. 转化 大肠杆菌 含有重组质粒的细胞 26,27.
    1. 加入约 10 ng（约 4-5 μl）连接反应混合物（参见第 3.5.4 节）至 50 μl RbCl 感受态 E. coli 轻轻混匀，然后在冰上孵育30–60分钟。在42°C下热激1.5分钟 42 °C 并在冰上孵育5-30分钟。
    2. 添加 950 μl 无抗生素LB培养基中，37°C孵育1小时 37 °C 以及 160 rpm。转化子筛选时，取 50 和 100 μl 在含有氨苄青霉素的LB琼脂平板上培养，并于37°C培养约16-20小时 37 °C.
    3. 接种3.1节所述的每种启动子-5'非翻译区连接产物的5-10个独立菌落，分别加入含氨苄青霉素的5 ml LB培养基中。随后按照3.2至3.4节所述方法提取质粒DNA，并验证其正确性。
  7. 将35SS启动子替换为 鼻部 每个5'UTR质粒中的启动子使用 Asc我与 生态在 NEBuffer 4 中使用 RI REs 37 °C 1 小时，具体步骤见第 3.5 和 3.6 节。
  8. 将获得的八种质粒分别导入 A. tumefaciens 通过电穿孔法将菌株GV3101:pMP90RK进行转化 28.
    1. 加入约 500 ng 纯化的质粒 DNA 50 μl 感受态 A. tumefaciens 将细胞置于冰上。轻轻混匀后转移至预冷的0.2 cm电穿孔比色皿中。确保混合物位于比色皿底部且不含气泡。
    2. 以 2.5 kV 对细胞进行 5 msec 的电击，并确认脉冲的强度和持续时间。
    3. 避免DNA样本中盐浓度过高或感受态细胞制备不当 A. tumefaciens 细胞，因为这些细胞可能导致高离子电流，引起细胞悬液瞬间汽化，从而显著降低转化效率。
    4. 添加 950 μl 不含抗生素的 YEB 培养基（5 g/L 牛肉提取物，1 g/L 酵母提取物，5 g/L 蛋白胨，5 g/L 蔗糖，2 mM MgSO₄）4，pH 7.0），轻轻混匀后立即转移至无菌的 1.5 ml 反应管中。在 26–28 °C 和 160 rpm。
    5. 铺展 1-2 μl 接种于含有抗生素（50 mg/L 羧苄青霉素、25 mg/L 卡那霉素、25 mg/L 利福平）的 YEB 琼脂平板上，用于转化子的筛选。注意：利福平为有毒物质。
    6. 接种三个含有抗生素的5 ml YEB培养基 aliquot，分别加入代表每个启动子-5'UTR连接产物的单菌落细胞，并在26-30 °C下培养48-72小时。28 °C 和 160 rpm。
  9. 确认成功的 A. tumefaciens 转化
    1. 转移 2 μl 来自第3.8.6节的每份等分试样分别处理 48 μl PCR预混液的等分试样（2 μl 每一项的 10 μM 引物储备液（每种引物终浓度为 400 nM） 1 μl 10 mM dNTP 混合液（200 μM 每种脱氧核苷三磷酸的终浓度）， 5 μl 10倍稀释高保真缓冲液含15 mM MgCl2, 0.75 μl 扩增高保真酶混合物，并 39.25 μl 无菌蒸馏水
    2. 使用适当的引物（FWD：5'-CCT CAG GAA GAG CAA TAC-3'，结合于启动子上游1026个核苷酸处；REV：5'-CCA AAG CGA GTA CAC AAC-3'，结合于35S多聚腺苷酸化位点内）在适当的PCR条件下扩增各质粒的表达盒。此处， 94 °C 用于初始变性，随后进行30个循环的 94 °C 变性 15 秒， 51 °C 退火30秒 72 °C 延伸120秒，以及最后的延伸步骤在 72 °C 8 分钟
    3. 按照第3.4.3节所述，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR产物的大小。
  10. 准备 A. tumefaciens 通过混合甘油菌种保存液 500 μl 50% (v/v) 无菌甘油 500 μl 的 A. tumefaciens 来自第3.8.6节且已确认转化成功的菌种（参见第3.9.3节）。将甘油菌种保存于-80 °C 直至进一步使用。
  11. 使用 RNAfold 网络服务器计算不同 mRNA 的折叠能 29 并包含从转录起始位点至编码区前50个碱基对的核苷酸序列。
    1. 在“折叠算法和基本选项”部分，选择“最小自由能（MFE）和配分函数”以及“避免孤立碱基对”选项。
    2. 在“高级折叠选项”中，选择“始终考虑螺旋两端的悬垂能量”、“RNA 参数（Turner 模型，2004）”，并将“将能量参数重缩放至指定温度（C）”更改为 25 °C.
    3. 在“输出选项”部分，选择所有选项。
    4. 从输出文件的“热力学系综预测结果”部分提取“热力学系综的自由能”和“系综中MFE结构的出现频率”数值，用于比较。

Gene editing diagram; vectors with EcoRI, HindIII restriction sites; promoter analysis.
图4. 启动子和5'UTR 变异体 表达盒通过逐步替换5'非翻译区（5'UTR）构建而成，形成了四种组合，均以CaMV 35SS启动子起始，随后将该启动子替换为 鼻部 序列产生四个额外的变异体，共形成八种不同的启动子/5'非翻译区组合。

4. 植物培养

  1. 将肥料 Ferty 2 Mega 用去离子水配制成 0.1% 的溶液，调节 pH 至 5.9。
  2. 将 10 × 10 × 8 cm 的岩棉块用去离子水充分冲洗，以去除残留化学物质，最后用肥料溶液平衡。
  3. 在每个岩棉块上放置 1–2 粒烟草种子进行播种，随后短时间用肥料溶液冲洗，注意避免将种子冲走。
  4. 将烟草植株在温室中培养 42 天，培养条件为：昼夜温度 25/22 °C，相对湿度 70%，光周期 16 小时（光照强度 180 mmol sec-1 m-2；波长 λ = 400–700 nm）。在此光周期期间，每小时进行一次水培灌溉，每次持续 15 分钟，使用肥料溶液。

5. 瞬时蛋白表达

  1. 准备 A. tumefaciens 用于叶片注射。
    1. 接种含有抗生素的 YEB 培养基 5–50 ml，添加 1% A. tumefaciens 冻存菌种并在指定条件下培养 27 °C 直到OD600 nm 达到5.0（根据体积和容器类型，约需48–72小时）。
    2. 稀释 A. tumefaciens 用清水和2倍浓度的浸润培养基（4.3 g/L Murashige and Skoog 盐（pH 5.6）、5 g/L 蔗糖、1.8 g/L 葡萄糖、100 mM 乙酰丁香酮）进行培养，调节至相应的OD值600 nm 注射所需。确认OD600 nm 注射前。注意：OD600 nm 1.0 对应于约 1.43 ± 0.12 × 109 每毫升菌落形成单位
  2. 注射 A. tumefaciens 将悬浮液注入叶片。
    1. 选择并标记拟进行处理的非子叶叶片及其处理位置（例如 根据一项实验设计（DoE）策略。
    2. 不要注射不同的 A. tumefaciens 将溶液注入同一肋间区域时，应避免重复使用相同位置，而应选择中脉轴两侧相对的区域进行注射。若需在同一位置注射两种以上不同溶液，则应使用另一株植物。
    3. 充分振荡 A. tumefaciens 用溶液重悬因稀释制备后可能沉降的细胞，并用1 ml注射器吸取。
    4. 用移液器吸头或类似工具在预定注射位置轻轻刮擦表皮，以促进注入物的进入 A. tumefaciens 溶液。操作时避免撕裂叶片。
    5. 将注射器垂直于叶片，使针筒筒身接触待处理的叶脉间区域，并轻轻将出口端（不带针头）推至叶片下表面。同时轻压叶片上表面，以防止叶片移动或破裂。
    6. 轻轻下压注射器活塞。 A. tumefaciens 溶液将进入叶片内部的细胞间隙，表现为处理区域颜色变深、呈深绿色且湿润。重复此操作，直至整个叶脉间区域均被浸润 A. tumefaciens然后继续下一个肋间区域。
    7. 确保注射器始终与叶片垂直。倾斜注射器会导致细菌悬浮液在高压下喷出。
    8. 如果不同 A. tumefaciens 溶液被使用（例如 为测试不同的启动子，在施加下一种溶液之前，使用纸巾或类似物清除第一次注射后残留在叶片下表面的多余溶液。
  3. 植物接种后孵育与取样
    1. 在注射前约24小时为处理过的植物准备植物生长室，以使温度和湿度达到实验设计（DoE）要求的平衡水平。
    2. 注射后，将植株转移至植物生长室，并放置于足够大的托盘中，以便在整个由实验设计（DoE）确定的孵育期间进行浇水灌溉。
    3. 使用每0.7 m²配备六根Osram冷白光36 W荧光灯管的方式建立16小时光周期2 (75 mmol sec-1 m-2；λ = 400–700 nm）。通过将每0.7 m²内的植株数量限制为六株，防止植株间相互遮荫2.
    4. 采样前，通过比对第5.2.1节中添加的标签与实验设计（DoE）方案，确认已选择正确的肋间区域。
    5. 使用打孔器从实验设计（DoE）所指示的位置和时间点的处理后叶脉间区域取下 4–5 个叶片圆片。取样时不要将整片叶子从植株上摘下。打孔时用手持纸巾固定叶片，以防止叶片破裂。
    6. 称取每个样品的质量，并将其放入已标记样品名称和质量的 1.5 ml 塑料反应管中。将样品储存在 -20 °C 或 -80 °C 在蛋白质定量之前。根据样品稳定性和储存温度，此步骤可暂停数月。

6. 蛋白质定量

  1. 从叶盘样品中提取蛋白质。
    1. 每毫克样品质量加入 3 ml 提取缓冲液（50 mM 磷酸钠，500 mM 氯化钠；pH 8.0），在反应管中使用电动研磨杵研磨叶盘，直至无大块碎片残留。避免样品过热。
    2. 将样品在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 20 分钟，重复两次，以去除分散的固体。每次离心后，将上清液转移至洁净的 1.5 ml 反应管中，注意不要扰动沉淀。
    3. 离心后，可根据样品稳定性和储存温度，将植物提取物在 -20 °C 或 -80 °C 冷冻数月，以暂停后续操作。需确认冻融循环不会影响目标蛋白的浓度。
  2. 测定 DsRed 荧光。
    1. 将每个样品设置三个技术重复，加入黑色 96 孔半面积板中（每孔 50 μl 提取物）。移液过程中避免产生气泡。
    2. 每块 96 孔板使用六种浓度（0、25、75、125、175 和 225 μg/ml）的 DsRed 标准品，以生成线性参考曲线。用 PBS 配制标准品稀释液，并在 4 °C 保存，3 个月内使用。
    3. 使用配备 530/25 nm 激发滤光片和 590/35 nm 发射滤光片的 96 孔板读数仪，连续两次测量荧光值。
    4. 对每个样品，取两次读数和三个技术重复的荧光值平均值，并减去含 0 μg/ml DsRed 的空白对照所记录的数值。同样，从标准品稀释液的读数中减去该空白值，并使用这些空白校正后的数值进行线性回归，得到通过坐标原点的参考曲线。
    5. 利用参考曲线的斜率将样品测得的荧光值转换为 DsRed 浓度。如有必要，稀释样品以使读数落在标准品浓度范围内，并在后续计算中考虑稀释倍数。
  3. 测定 2G12 的浓度。
    1. 准备表面等离子共振（SPR）设备，通过将 Protein A 偶联至一个流通池的活化表面来测定抗体浓度。另一个流通池作为对照，其表面经钝化处理而不偶联 Protein A 30,31。
    2. 用 SPR 运行缓冲液（10 mM HEPES，pH 7.4，3 mM EDTA，150 mM NaCl，0.05% v/v Tween-20）将植物提取物稀释 1:20，对每个样品设置三个技术重复，在 90 μl 注射结束时（30 μl/min，持续 180 秒）测定抗体与 Protein A 结合的响应单位（RU）。从实验流通池（含 Protein A 表面）测得的 RU 值中减去对照流通池（无 Protein A）测得的 RU 值。
    3. 每检测 10–15 个样品后测定一次 585 ng/ml 的 2G12 标准品，并如上所述减去对照流通池的测量值。使用这些标准品的平均 RU 值绘制通过坐标原点的线性参考曲线。
    4. 根据 1:20 的稀释倍数和参考曲线的斜率，计算样品中 2G12 的浓度。
    5. 检查是否存在对对照流通池的强非特异性结合，这可能干扰测量结果。同时检查 2G12 标准品在整个分析过程中的数值是否保持相对恒定（变异 <5%），若变异较大，可能提示 Protein A 表面老化。

7. 数据分析与评估

  1. 手动分析表达实验中观察到的响应，包括：(i) 指示测量误差的极端值（过高或过低）；(ii) 异常结果， 例如 导致意外响应从而提示数据交换的因子组合；以及（iii）缺失值。
    注意：使用这些操作可防止基于错误数据构建模型。
  2. 将分析得到的响应数据（此处为蛋白质浓度）导入 DesignExpert 软件的“Design”节点中。确保响应数据已正确分配至相应的因素设置条件。DesignExpert 软件提供详尽的帮助文档，涵盖下述相关内容。
  3. 在“分析”节点中，选择要分析的响应变量，并在转换选项卡中最初选择“无”。
    注意：当反应的最小/最大比值大于10时，建议进行转换。最有效的转换方法可从下文所述的“诊断工具”（第7.8节）中“诊断”部分的“诊断”选项卡内的Box-Cox图获得。对数10 转化通常是合适的。
  4. 继续进入“拟合摘要”标签页，该页面提供有关对所研究系统重要的因素的一般信息（例如 二元交互作用、二次效应）。该软件将根据显著性推荐一个初始模型。
  5. 在“模型”选项卡中，系统会根据“拟合摘要”结果预先选择一个初始模型。请使用自动模式编辑此模型：
    1. 选择一个比推荐模型高一级的“处理顺序”， 例如 如果建议的模型为“2FI”（二因子交互作用），则选择“Quadratic”。
    2. 在“选择”字段中选择“向后”，然后转到“ANOVA”选项卡，将根据初始值为 0.100 的“Alpha out”值，从模型中逐步剔除无显著性意义的项。
    3. 如果软件提示，请始终自动校正模型层级结构，因为这是生成可靠模型所必需的 32,33.
  6. 在“ANOVA”选项卡中，检查建议的模型及所包含的因素。如有必要，可返回“Model”选项卡，将“Selection”更改为“Manual”，然后从模型中手动剔除那些 p 值高于预设阈值（此处为 0.05，对应 5% 显著性水平）或根据机制分析认为不合理的因素。
  7. 返回“ANOVA”选项卡，评估更新后的模型，重点关注“Model”的 p 值（值越低越好，因其表示具有显著性）和“Lack-of-fit”的 p 值（值越高越好，因其表示无显著性），以及“R-squared”、“Adjusted R-squared”和“Predicted R-squared”的数值（数值越接近 1 越好） > 0.80 为佳。
    1. 在多个显著性水平下，比较包含/排除不同因素的各模型的这些数值。
      注意：在“设计”节点中复制响应列并分别执行每个分析，或将整个“ANOVA”表导出至其他程序（如电子表格软件）中进行处理，可能会更方便。
  8. 继续前往“诊断”选项卡，通过查看“诊断工具”中的所有选项卡（“诊断”和“影响”部分），确认模型的质量并检测数据集中对模型具有较强影响的潜在离群值。
    1. 在“诊断工具”的“诊断”部分执行以下操作：
      1. 确保“残差 vs. 预测值”图中的点在限定范围内随机分布。此处，V 形分布表明需要对数据进行转换。
      2. 确保“残差 vs. 预测值”图中的点在限定范围内随机分布。此处，若分布呈人字形，则表明需要对数据进行转换。
      3. 检查“残差与运行顺序”图中的点是否在界限内随机散布。若出现某种模式（例如 “阶梯状”模式表明数据中存在趋势，可通过区块构建法来抵消其对模型的影响。
      4. 在“预测值 vs. 实测值”图中，寻找一条表示理想模型的直线对角线。数据点围绕对角线分布越分散，模型的准确性越低。
      5. 检查Box-Cox图中蓝色（最优）与绿色（实际）垂直线是否存在重叠，以判断数据转换方式。如果绿色线未与蓝色线重合（位于红色垂直线所标示区间之外），则返回第7.3节，根据Box-Cox图建议的数据转换方式改进模型构建过程。在此过程中，可再次复制响应变量列，以便比较不同模型。
      6. 确保“残差与因子”图中的各点（每个模型因子对应一张图）在界限内随机分布。数据分布中的曲率可能表明模型中遗漏了某个因子。
    2. 在“诊断工具”的“影响”部分，确保“外部学生化残差”、“杠杆值”、“DFFITS”和“DFBETAS”图中数据点在界限内呈随机散布，且“库克距离”图中分布均匀且数值较低，无极端值。
  9. 在“模型图”选项卡中，可视化已评估的模型。对于数量有限的数值因子（例如 3）响应曲面（“三维曲面”）图可用于手动评估最优值/特征。
    注意：响应曲面仅用于说明两个因素对所研究响应值的影响。其他因素对响应值的影响可通过在“因素工具”窗口中更改其数值（数值型因素）或水平（类别型因素）来观察。或者，也可通过在“因素游戏副本”窗口中右键单击相应因素并选择所需的自变量坐标轴，将因素分配至图表坐标轴。
    1. 使用“因子工具”调整因子水平，并将其分配给图表的纵坐标。
    2. 使用“文件”选项卡中的“将图表导出到文件…”命令导出图表。
  10. 使用“优化”节点中的“数值”子节点，根据模型因素对响应进行数值优化（最小化、最大化或在指定范围内），并对这些模型因素施加相应的约束条件例如 通过“条件”选项卡设置限制和权重。
    1. 在“条件”选项卡中输入参数后，于“解”选项卡中计算并查看相应的数值解。
    2. 将这些溶液导出至其他软件（例如 电子表格）以进行进一步分析（例如 直方图，揭示与高或低响应值相关的因素设置。
      注：当研究的数值因子超过三个且难以进行三维表示时，此方法非常有用。
  11. 使用“点预测”子节点来预测特定因子设置下的响应值。
    1. 将此预测用于所有待评估的条件（此处指所有启动子和5'非翻译区组合，以及所有叶片和孵育时间，或叶位和孵育温度）。
    2. 导出预测值并将其汇编为数据数组，可用于描述烟草植物中的瞬时表达。 例如 通过计算某一特定启动子-5'非翻译区组合在某一时间点于整株植物所有叶片位置或全部叶片中的平均表达量。
    3. 根据不同叶片的质量对表达数据进行归一化处理，以获得特异性表达水平（μg g-1）或特异性表达率（μg g-1 小时-1).
    4. 或者，将“ANOVA”选项卡底部“最终方程”的系数导出至电子表格，并将其与因子设置数组相乘，以得到相同的数组数据。
      注意：该数组只能包含初始设计空间内的因子值，因为拟合的模型方程不适用于外推。
  12. 对主要关注的模型点进行验证实验。
    1. 在“点预测”（第7.11节）选定的条件下进行瞬时蛋白表达。 例如。 使用相同的温度和叶片 等等。
    2. 根据上述方法（第6节）确定该瞬时表达实验的蛋白浓度，并将其与模型预测值进行比较。
    3. 检查验证实验中平均蛋白浓度是否落在响应面模型在点预测时获得的预测区间内。若结果相符，则证明模型具有良好的预测能力；若不符，则表明模型质量较低，可能需要增加实验次数。
    4. 注意：植物批次间的变异性会扩大预测区间，并可能降低使用不同植物批次进行验证实验的可靠性。然而，未用于模型构建但来源于模型所含样本同一植物批次的样品可作为有效的对照。

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结果

利用不同启动子和5'非翻译区进行瞬时表达过程中DsRed积累的描述性模型

采用叶片提取物中的DsRed荧光来指示重组蛋白的表达水平，因此在实验设计（DoE）策略中将其作为响应值。我们认为具有实际意义的最小可检测差异为20 μg/ml，系统估计的标准差根据初步实验结果为8 μg/ml。瞬时表达模型中所包含的因素是基于文献数据7,8以及我们先前的研究结果9选定的，所考察的因素范围也依据这些数据确定（表1）。对于所有离散的数值型因素，均至少选择三个水平，以便建立二次基础模型。在选择DoE实验运行方案时，采用D-最优选择算法，以获得回归模型系数的最精确估计。DesignExpert软件最初建议的设计包含90次运行，但其FDS不足以实现1%的预测标准误差（图3A）。通过D-最优增补设计，将总运行次数增加至210次，解决了这一问题，使FDS达到100%，且在整个设计空间内预测准确性的分布更加均匀，表现为曲线平坦（图3B

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讨论

每个实验都需要精心规划，因为资源通常稀缺且昂贵。这一点对于实验设计（DoE）策略尤为如此，因为在规划阶段出现的错误（例如 选择一个未涵盖所有重要因子交互作用的基础模型，会显著降低所得到模型的预测能力，从而降低整个实验的价值。然而，遵循基本的操作流程即可轻松避免此类错误。

实验设计规划期间的注意事项

首先，选择一个适合评估每次实验设计（DoE）运行结果（阳性或阴性）的响应变量至关重要。例如：通过紫外吸收测定的目标蛋白浓度 37 可用于评估特定启动子/5'非翻译区组合的活性。然而，对蛋白质的功能评估（例如。对于DsRed而言，可通过荧光检测；对于2G12，则可通过其与蛋白A的结合能力进行检测，此类方法更优，因其同时反映了蛋白质的质量特性。响应值也可由两个或多个独立参数计算得出，例如功率数 NP 在发酵实验中（根据输入功率、转速和搅拌器直径计算）。响应应产生高精度的数值（即 低标准差）和准确性（即 零或极少干扰参数）以提高模型质...

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披露

出版费用由美国 Statease, Inc. 公司和德国 Statcon 公司部分赞助，这两家公司未参与稿件的撰写，也不对稿件的任何内容负责。

致谢

作者感谢 Thomas Rademacher 博士提供了 pPAM 植物表达载体，以及 Ibrahim Al Amedi 为本研究培育了所用的烟草植株。我们感谢 Richard M. Twyman 博士在稿件编辑方面提供的帮助。本工作部分由欧洲研究理事会高级资助项目“Future-Pharma”（项目编号 269110）和弗劳恩霍夫未来基金会（Fraunhofer Future Foundation）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.实验设计软件
胰蛋白胨Carl Roth GmbH8952.2培养基组分
酵母提取物Carl Roth GmbH2363.2培养基组分
氯化钠Carl Roth GmbHP029.2培养基组分
氨苄青霉素Carl Roth GmbHK029.2抗生素
琼脂Carl Roth GmbH5210.2培养基组分
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012微生物
pPAMGenBankAY027531克隆/表达载体； 
NucleoSpin Plasmid MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250质粒DNA提取试剂盒
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250质粒DNA纯化试剂盒
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.分光光度计
NcoINew England Biolabs Inc.R3193L限制性内切酶
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101L限制性内切酶
AscINew England Biolabs Inc.R0558L限制性内切酶
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004S限制性内切酶缓冲液
TRISCarl Roth GmbH4855.3培养基组分
四硼酸钠Carl Roth GmbH4403.3培养基组分
EDTACarl Roth GmbH8040.2培养基组分
琼脂糖Carl Roth GmbH6352.4培养基组分
溴酚蓝Carl Roth GmbHA512.1显色指示剂
二甲苯青Carl Roth GmbHA513.1显色指示剂
甘油Carl Roth GmbH7530.2培养基组分
Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406凝胶电泳槽
Agrobacterium tumefaciens 菌株 GV3101:pMP90RKDSMZ12365微生物
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658电穿孔仪
牛肉提取物Carl Roth GmbHX975.2培养基组分
蛋白胨Carl Roth GmbH2365.2培养基组分
蔗糖Carl Roth GmbH4621.2培养基组分
硫酸镁Carl Roth GmbH0261.3培养基组分
羧苄青霉素Carl Roth GmbH6344.2抗生素
卡那霉素Carl Roth GmbHT832.3抗生素
利福平Carl Roth GmbH4163.2抗生素
FWD 引物Eurofins MWG Operonn.a.CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV 引物Eurofins MWG Operonn.a.CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 热循环仪Applied Biosystems4359659PCR仪
RNAfold 网络服务器维也纳大学n.a.软件
Ferty 2 MegaKammlott5.220072肥料
Grodan 岩棉块 10×10 cmGrodann.a.岩棉块
温室n.a.n.a.用于植物培养
植物生长室Ilka Zelln.a.用于植物培养
Omnifix-F SoloB. Braun6064204注射器
Murashige 和 Skoog 盐DuchefaM 0222.0010培养基组分
葡萄糖Carl Roth GmbH6780.2培养基组分
乙酰丁香酮Sigma-AldrichD134406-5G植物激素类似物
 BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008光度计
Osram 冷白光 36 WOsram4930440光源
磷酸氢二钠Carl Roth GmbH4984.3培养基组分
Centrifuge 5415DEppendorf5424 000.410离心机
Forma -86°C 超低温冰箱ThermoFisher88400冰箱
Synergy HTBioTekSIAFRT荧光酶标仪
Biacore T200GE Healthcaren.a.表面等离子共振仪
蛋白ALife Technologies10-1006抗体结合蛋白
HEPESCarl Roth GmbH9105.3培养基组分
吐温-20Carl Roth GmbH9127.3培养基组分
2G12 抗体PolymunAB002参考抗体

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