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利用实验设计方法表征复杂系统：以烟草中瞬时蛋白表达为例

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DOI：

10.3791/51216

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2014年1月31日

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

通讯作者： Johannes Felix Buyel <johannes.buyel@rwth-aachen.de>

本文内容

摘要

我们介绍一种实验设计方法，可用于确定并建模转基因调控元件、植物生长与发育参数以及培养条件对植物中单克隆抗体和报告蛋白瞬时表达的影响。

摘要

植物在生物制药生产方面具有多种优势，包括成本低、可扩展性强以及安全性高。瞬时表达还具有研发和生产周期短的额外优点，但不同批次间的表达水平可能存在显著差异，从而在良好生产规范（GMP）背景下引发监管方面的关注。我们采用实验设计（DoE）方法，评估了表达载体中的调控元件、植物生长与发育参数以及表达期间的孵育条件等主要因素对批次间表达变异性的影响。我们测试了表达一种模型抗HIV单克隆抗体（2G12）和一种荧光标记蛋白（DsRed）的植物。我们讨论了选择该模型特定特性的依据，并指出了其潜在局限性。该通用方法可轻松推广至其他问题，因为该模型的原则具有广泛适用性：基于知识的参数选择、通过将初始问题分解为较小模块以降低复杂性、由软件指导设置最优实验组合以及逐步优化实验设计。因此，该方法不仅适用于植物中蛋白表达的表征，也适用于缺乏机制性描述的其他复杂系统的研究。所建立的描述参数间相互关联性的预测方程可用于构建其他复杂系统的机制模型。

引言

利用植物生产生物制药蛋白具有优势，因为植物种植成本低廉，该平台只需通过增加种植数量即可实现规模扩大，且人类病原体无法在植物中复制1,2。基于农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）侵染叶片等方法的瞬时表达策略可带来额外益处，因为从DNA递送到获得纯化产物的时间可从数年缩短至不到2个月3。瞬时表达还常用于功能分析，例如检测基因是否能够弥补功能缺失型突变体的表型，或研究蛋白质相互作用4-6。然而，瞬时表达水平的批次间变异通常大于转基因植物中的表达水平7-9。这会降低基于瞬时表达的生物制药生产工艺在现行药品生产质量管理规范（GMP）下获得批准的可能性，因为可重复性是一项关键质量属性，需接受风险评估10。此类变异还可能掩盖研究人员拟研究的任何相互作用。因此，我们着手鉴定影响植物中瞬时表达水平的主要因素，并构建一个高质量的定量预测模型。

一次只改变一个因素（OFAT）的方法常被用于表征影响（效应) 某些参数的因素) 对结果的影响（反应实验的） 11。但这种方法并不理想，因为各个检测（运行) 在调查期间实验将通过所测试因素构成的潜在作用范围，像串珠一样对齐排列（设计空间）。如图所示，实验设计空间的....

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方案

1. 规划实验设计策略

  1. 确定设计中需包含的相关因素与响应变量。
    1. 定义一个或多个用于测量的响应指标。此处使用了2G12和DsRed的表达水平（μg/ml），包括被视为有意义的最小可检测差异（10 和 20 μg /毫升，分别）以及系统估计标准偏差的近似值（4 和 8 μg/ml根据先前的实验结果。
    2. 利用现有文献、前期实验数据或专业筛选设计方案（例如 析因设计，参见引言）以筛选出对响应值具有显著影响的因素，并对其影响程度进行量化（表1) 7,8,19,20.
    3. 分配因子类型（数值型或类别型），并选择在实验设计（DoE）研究中将要变动的数值型因子的取值范围表1).
    4. 确定难以实现连续变化的数值因素。
      1. 避免对无法精确调节至特定水平的因素使用连续变化。 例如 孵育温度通常只能控制在 ±2 °C因此，使用如下数值进行连续变化 27.2 °C, 25.9 °C，以及 29.3 °C 必须避免。
      2. 相反，为这些因素选择若干个离散的水平（表1）。层数应与预期的基础模型（步骤 1.2）相匹配。 这一点仅对最优设计重要，因为中心复合设计的因子水平始终是离散的。
      5. ....

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结果

利用不同启动子和5'非翻译区进行瞬时表达过程中DsRed积累的描述性模型

采用叶片提取物中的DsRed荧光来指示重组蛋白的表达水平，因此在实验设计（DoE）策略中将其作为响应值。我们认为具有实际意义的最小可检测差异为20 μg/ml，系统估计的标准差根据初步实验结果为8 μg/ml。瞬时表达模型中所包含的因素是基于文献数据7,8以及我们先前的研究结果9选定的，所考察的因素范围也依据这些数据确定（表1）。对于所有离散的数值型因素，均至少选择三个水平，以便建立二次基础模型。在选择DoE实验运行方案时，采用D-最优选择算法，以获得回归模型系数的最精确估计。DesignExpert软件最初建议的设计包含90次运行，但其FDS不足以实现1%的预测标准误差（图3A）。通过D-最优增补设计，将总运行次数增加至210次，解决了这一问题，使FDS达到100%，且在整个设计空间内预测准确性的分布更加均匀，表现为曲线平坦（图3B

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讨论

每个实验都需要精心规划，因为资源通常稀缺且昂贵。这一点对于实验设计（DoE）策略尤为如此，因为在规划阶段出现的错误（例如 选择一个未涵盖所有重要因子交互作用的基础模型，会显著降低所得到模型的预测能力，从而降低整个实验的价值。然而，遵循基本的操作流程即可轻松避免此类错误。

实验设计规划期间的注意事项

首先，选择一个适合评估每次实验设计（DoE）运行结果（阳性或阴性）的响应变量至关重要。例如：通过紫外吸收测定的目标蛋白浓度 37 可用于评估特定启动子/5'非翻译区组合的活性。然而，对蛋白质的功能评估（例如。对于DsRed而言，可通过荧光检测；对于2G12，则可通过其与蛋白A的结合能力进行检测，此类方法更优，因其同时反映了蛋白质的质量特性。响应值也可由两个或多个独立参数计算得出，例如功率数 NP 在发酵实验中（根据输入功率、转速和搅拌器直径计算）。响应应产生高精度的数值（即 低标准差）和准确性（即 零或极少干扰参数）以提高模型质.......

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披露

出版费用由美国 Statease, Inc. 公司和德国 Statcon 公司部分赞助，这两家公司未参与稿件的撰写，也不对稿件的任何内容负责。

致谢

作者感谢 Thomas Rademacher 博士提供了 pPAM 植物表达载体，以及 Ibrahim Al Amedi 为本研究培育了所用的烟草植株。我们感谢 Richard M. Twyman 博士在稿件编辑方面提供的帮助。本工作部分由欧洲研究理事会高级资助项目“Future-Pharma”（项目编号 269110）和弗劳恩霍夫未来基金会（Fraunhofer Future Foundation）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Design-Expert(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.实验设计软件
胰蛋白胨Carl Roth GmbH8952.2培养基组分
酵母提取物Carl Roth GmbH2363.2培养基组分
氯化钠Carl Roth GmbHP029.2培养基组分
氨苄青霉素Carl Roth GmbHK029.2抗生素
琼脂Carl Roth GmbH5210.2培养基组分
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012微生物
pPAMGenBankAY027531克隆/表达载体； 
NucleoSpin Plasmid MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250质粒DNA提取试剂盒
NucleoSpin Gel and PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250质粒DNA纯化试剂盒
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.分光光度计
NcoINew England Biolabs Inc.R3193L限制性内切酶
EcoRINew England Biolabs Inc.R3101L限制性内切酶
AscINew England Biolabs Inc.R0558L限制性内切酶
NEB 4New England Biolabs Inc.B7004S限制性内切酶缓冲液
TRISCarl Roth GmbH4855.3培养基组分
四硼酸钠Carl Roth GmbH4403.3培养基组分
EDTACarl Roth GmbH8040.2培养基组分
琼脂糖Carl Roth GmbH6352.4培养基组分
溴酚蓝Carl Roth GmbHA512.1显色指示剂
二甲苯青Carl Roth GmbHA513.1显色指示剂
甘油Carl Roth GmbH7530.2培养基组分
Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406凝胶电泳槽
Agrobacterium tumefaciens 菌株 GV3101:pMP90RKDSMZ12365微生物
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658电穿孔仪
牛肉提取物Carl Roth GmbHX975.2培养基组分
蛋白胨Carl Roth GmbH2365.2培养基组分
蔗糖Carl Roth GmbH4621.2培养基组分
硫酸镁Carl Roth GmbH0261.3培养基组分
羧苄青霉素Carl Roth GmbH6344.2抗生素
卡那霉素Carl Roth GmbHT832.3抗生素
利福平Carl Roth GmbH4163.2抗生素
FWD 引物Eurofins MWG Operonn.a.CCT CAG GAA GAG CAA TAC
REV 引物Eurofins MWG Operonn.a.CCA AAG CGA GTA CAC AAC
2720 热循环仪Applied Biosystems4359659PCR仪
RNAfold 网络服务器维也纳大学n.a.软件
Ferty 2 MegaKammlott5.220072肥料
Grodan 岩棉块 10×10 cmGrodann.a.岩棉块
温室n.a.n.a.用于植物培养
植物生长室Ilka Zelln.a.用于植物培养
Omnifix-F SoloB. Braun6064204注射器
Murashige 和 Skoog 盐DuchefaM 0222.0010培养基组分
葡萄糖Carl Roth GmbH6780.2培养基组分
乙酰丁香酮Sigma-AldrichD134406-5G植物激素类似物
 BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008光度计
Osram 冷白光 36 WOsram4930440光源
磷酸氢二钠Carl Roth GmbH4984.3培养基组分
Centrifuge 5415DEppendorf5424 000.410离心机
Forma -86°C 超低温冰箱ThermoFisher88400冰箱
Synergy HTBioTekSIAFRT荧光酶标仪
Biacore T200GE Healthcaren.a.表面等离子共振仪
蛋白ALife Technologies10-1006抗体结合蛋白
HEPESCarl Roth GmbH9105.3培养基组分
吐温-20Carl Roth GmbH9127.3培养基组分
2G12 抗体PolymunAB002参考抗体

参考文献

  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

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