利用位点特异性交联监测分泌型细菌毒力因子的组装

摘要

本文介绍了脉冲-追踪放射性标记与位点特异性光交联技术相结合的方法，用于监测目标蛋白与大肠杆菌（E. coli）中其他因子之间的相互作用。与传统的化学交联方法不同，该方法可在活细胞内获得有序组装途径的高分辨率“快照”。

摘要

本文介绍了一种用于检测和分析目标蛋白与其他因子之间动态相互作用的方法 体内我们的方法基于琥珀抑制技术，该技术最初由 Peter Schultz 及其同事开发。¹首先在目标蛋白编码基因的特定位点引入琥珀突变。随后将该琥珀突变体在 E. coli 以及编码琥珀抑制型tRNA和氨酰-tRNA合成酶的基因，这些基因来源于 Methanococcus jannaschii利用该系统，可将光激活氨基酸类似物对苯甲酰基苯丙氨酸（p-benzoylphenylalanine, Bpa）插入至琥珀密码子。随后用紫外光照射细胞，使Bpa残基与距离在3–8 Å范围内的蛋白质发生共价交联。通过将光交联与脉冲-追踪标记及目标蛋白的免疫沉淀相结合，可监测数秒至数分钟内发生的蛋白质-蛋白质相互作用变化。我们已优化该方法用于研究一种细菌毒力因子的组装过程，该因子由两个独立结构域组成：一个整合于外膜的结构域和一个转位至胞外空间的结构域。但该方法亦可用于研究原核与真核细胞中多种不同的组装过程及生物学通路。原则上，可通过质谱分析鉴定与目标蛋白相互作用的因子，甚至相互作用因子中具体参与结合的氨基酸残基。

引言

为了明确某种目标蛋白在生物通路中的作用、理解其组装过程或阐明其作用机制，通常必须识别并表征该蛋白与其他细胞组分之间的相互作用。目前有多种常用方法可用于研究蛋白-蛋白相互作用，但这些方法均存在一定的局限性。最简单的无偏倚方法是共纯化（或称免疫共沉淀），用以鉴定与目标蛋白结合的其他蛋白；但该方法要求蛋白复合物在纯化过程中保持完整。弱相互作用或瞬时相互作用可通过化学交联加以稳定，但这种方法通常需要使用通过蛋白质序列中广泛分布的伯胺基团进行连接的化合物，从而可能产生复杂且难以解释的交联图谱，尤其是在目标蛋白属于多蛋白复合物组分的情况下。此外，由于化学交联剂的间隔臂长度通常超过10 Å，因此可能与邻近但并不直接与目标蛋白相互作用的蛋白形成共价键。亲和层析和双杂交筛选等方法也常用于鉴定蛋白-蛋白相互作用。然而，前者需要在能够促进具有生理意义的相互作用的条件下进行，因而无法用于检测弱相互作用；后者则要求结合相互作用能够在宿主生物体中被复制，并且在目标蛋白及其结合伙伴被构建成融合蛋白时仍能维持。双杂交方法还容易产生假阳性结果²。一旦确认了蛋白-蛋白相互作用，通常还需要大量工作来定位相互作用位点。传统方法最显著的缺陷可能是：它们无法提供有关分子间相互作用的时间顺序或结合动力学的任何信息。

本文介绍了一种简单的方法，克服了其他用于研究蛋白质-蛋白质相互作用方法的一些局限性。首先，在编码目标蛋白质的基因中引入单个琥珀突变。随后，该琥珀突变体与一种琥珀抑制型tRNA以及来源于Methanococcus jannaschii的氨酰-tRNA合成酶共表达，该合成酶经过改造，仅在琥珀密码子处插入光活化氨基酸类似物对苯甲酰苯丙氨酸（Bpa）³。用长波长紫外光（UV）（约365 nm）照射细胞，可促使Bpa与距离约3-8 Å范围内的蛋白质之间形成共价键^4,5。在某些实验条件下，活化的Bpa也可与细胞中的非蛋白质组分（如脂质和核酸）形成交联⁶。在琥珀密码子处终止的分子通常可在SDS-PAGE上与全长蛋白明显区分，并且不能与其他蛋白质交联。通过在交联前对细胞进行脉冲-追踪放射性标记，然后对交联产物进行免疫沉淀或亲和纯化，可确定蛋白质-蛋白质相互作用的顺序和持续时间。获取分子间相互作用的时间信息，对于研究目标蛋白在有序的多步骤组装、转运或信号通路中的动态过程，以及鉴定通路中间体具有特别重要的价值。与化学交联类似，位点特异性交联可在生理条件下检测蛋白质-蛋白质相互作用，但由于交联剂仅引入单一位置，因此更有利于分析蛋白质各个片段与其他因子之间的相互作用。这一位点特异性交联的独特优势在目标蛋白含有多个可能与不同结合伴侣相互作用的结构域或区段时尤为突出。此外，位点特异性交联还可与质谱等方法结合使用，以精确绘制介导蛋白质-蛋白质相互作用的关键残基。尽管该方法在E. coli中进行了优化，但已有报道表明，通过琥珀密码子抑制将光活化氨基酸类似物插入蛋白质的过程也已在分枝杆菌（Mycobacterium）、酵母和哺乳动物细胞中实现^7-11。因此，原则上本方法也可应用于其他系统。

我们已广泛使用该方法来鉴定促进EspP生物合成的分子间相互作用，一种 E. coli O157:H7 毒力因子。EspP 属于一类被称为 "自转运蛋白" 含有一个大的N端胞外结构域（"乘客结构域"）和一个C端结构域（"b结构域"）折叠成圆柱形的β桶结构，并将该蛋白质锚定于外膜（OM）¹²乘客区室穿过外膜的转运机制长期以来一直是个未解之谜。与其他所有细菌细胞表面蛋白一样，EspP必须依次穿过内膜，经由周质空间（内膜与外膜之间的区域）转运，并被靶向定位至外膜，这一过程包含一系列有序的事件。在穿过外膜之后，EspP的乘客区室还会通过蛋白水解切割与β区室分离，并从细胞表面释放。通过将位点特异性交联技术与脉冲-追踪放射性标记相结合，我们发现该蛋白的两个区室最初均在周质中与分子伴侣Skp发生相互作用。⁶随后，β结构域的各个片段以立体特异性方式与一种称为Bam复合物的异源寡聚体组分相互作用，该复合物通过一种尚未明确的机制催化β桶状蛋白整合到细菌外膜中。尤为引人注意的是，我们发现当乘客结构域穿过外膜时，其与Bam复合物的一个亚基（BamA）存在接触。¹³我们的研究结果使我们能够构建出一个关于自转运蛋白组装的详细模型¹⁴ 并暗示Bam复合物在乘客结构域跨外膜转运过程中的作用。

方案

1. 质粒构建

1. 将编码目标蛋白的基因克隆至合适的表达载体后，使用定点突变试剂盒在所需位置引入琥珀突变。
   注意：结构信息和表面暴露预测可作为确定突变位点的有用参考。由于琥珀抑制和交联的效率可能差异较大，应于多个位点引入琥珀突变。此外，由于Bpa是酪氨酸和苯丙氨酸的类似物，建议在通常编码大疏水性氨基酸的位置引入琥珀突变，以最小程度干扰蛋白的结构与功能。最后，在选择表达载体时需注意，目标蛋白的过度表达可能限制Bpa的掺入效率。

2. 培养物制备

1. 使用电穿孔法将含有琥珀抑制系统（pDULE-pBpa；参见参考文献⁴）的质粒转化至合适的 E. coli 菌株中，并共转化一个编码目标蛋白且带有琥珀突变的相容性质粒。
2. 将细胞涂布于含有适当抗生素的 LB 琼脂平板上（使用 5 µg/ml 四环素筛选 pDULE-pBpa）。在 37 °C 下过夜培养。
3. 次日，从单菌落接种 3–5 ml 含有 0.2% 甘油、除甲硫氨酸和半胱氨酸外的所有 L-氨基酸（40 µg/ml）以及抗生素的 M9 培养基中，进行过夜培养¹⁴。在 37 °C 下培养。
4. 第二天，将过夜培养物在室温下以 2,500 × g 离心 5 分钟，收集菌体。用 5 ml 新鲜 M9 培养基重悬菌体，重复离心一次。
   注意：此洗涤步骤至关重要，可维持编码氨苄青霉素抗性基因的质粒稳定性，因为过夜培养物中残留的少量 β-内酰胺酶会降解新加入的氨苄青霉素，从而在细胞大量生长前导致其失活。
5. 将菌体重悬于 2 ml 新鲜培养基中，并使用分光光度计测定细胞浓度（OD₅₅₀）。
6. 将细胞接种至含有 50 ml M9 培养基和抗生素的 250 ml 锥形瓶中，使 OD₅₅₀ 达到 0.03。在 37 °C 摇动水浴中培养。

3. Bpa 掺入及光交联前准备

注意：以下所述方案适用于包含三个时间点（0、1 和 5 分钟）的样品时间序列实验。若需设置不同数量的时间点，请相应调整体积。该实验流程的示意图见图 1。

1. 在培养过程中，用 1 M NaOH 配制新鲜的 1 M（1,000 倍）Bpa 溶液（将 27 mg Bpa 溶于 100 μl 1 M NaOH 中）。使用避光管保存溶液，避免光照。
2. 当培养物达到对数早期至中期（OD₅₅₀=0.2）时，向每份培养物中加入 50 μl 1 M Bpa。逐滴加入 Bpa，同时轻轻旋转烧瓶以避免沉淀。随后，加入所需的诱导剂以启动琥珀突变体的表达。继续在 37 °C 下孵育培养物额外 30 分钟。
3. 在 30 分钟诱导期间，标记六个一次性 15 ml 离心管，标注时间点（0 分钟、1 分钟、5 分钟）以及 "+ UV" 或 "- UV"。将离心管置于冰上。
4. 另准备一个装满冰的冰桶，并将 6 孔细胞培养板放置于冰上。
5. 解冻高比活性（1,000 mCi/mmol） ³⁵S-甲硫氨酸和 ³⁵S-半胱氨酸（或两者的预混制剂）用于脉冲标记，并配制（或解冻）非放射性 L-半胱氨酸和 L-甲硫氨酸溶液（各 100 mM）用于追踪。
6. 在放射性标记前 5 分钟 打开紫外灯。
   注意：紫外灯应可调节，以便将其置于多孔板样品上方约 3–4 cm 处。
7. 向标记为 "- UV" 的每个离心管以及多孔板中的两个孔中加入冰（约 2 ml）。
   注意：应在 5 分钟 时间点前立即向第三个孔中加入冰。必须将冰直接加入离心管和孔中，以便在每个时间点立即终止细胞内反应，从而准确获得特定生化通路的 "快照"。
8. 在 30 分钟 诱导期结束时，将 25 ml 培养物转移至预热的 125 ml 一次性锥形瓶中。将锥形瓶放入 37 °C 摇动水浴中。

4. 脉冲-追踪标记与紫外照射

注意：脉冲-追踪标记和紫外照射实验步骤繁多，需及时操作，并要求有充分的组织和预先准备。所有试剂和试管应便于取用。以下提供了一个包含 0、1 和 5 分钟 时间点的实验方案。

1. 在0:00（分:秒）时，将25 ml培养物转移至125 ml锥形瓶中。
2. 在 0:30 时加入 30 µCi/ml 放射性氨基酸；迅速轻轻摇动以混匀。将烧瓶放入 37 °C 摇床水浴
3. 在1:00时加入250 µl的100 mM甲硫氨酸-半胱氨酸溶液；迅速涡旋混匀。
   1. 立即将4 ml培养物移液至含有冰块的预冷多孔板的其中一个孔中。再将第二个4 ml等分试样移液至标记的15 ml离心管中 "0 分钟 - 紫外线"将烧瓶放回水浴中。
4. 在2:00时，将4 ml培养物用移液器转移至含有冰的预冷多孔板的第二个孔中。另取4 ml等分试样，用移液器转移至标记的15 ml离心管中 "1 分钟 - 紫外线". 将烧瓶放回水浴中。
5. 在6:00时，将4 ml培养液移入预冷多孔板中含冰的第三个孔内。另取4 ml等分试样移入标记的15 ml离心管中 "5 分钟 - 紫外线".
6. 将装有培养板的冰桶置于预热的紫外灯下，每个样品单独照射4分钟。
   注意：在时间点间隔至少为 4 min 的实验中 每个样本在移液至多孔板后应立即进行辐照。
7. 将细胞转移至已标记的预冷15 ml离心管中 "0 分钟 +UV"，1 分钟 +UV", 等等.
8. 以 2,500 x g 离心 10 分钟 4 ℃时 °C.
9. 将每个样品重悬于 300 µl M9 培养基或 PBS 中，并加入 33 µl 100% 冷三氯乙酸（TCA）以沉淀蛋白质。在微量离心机中以最高速度离心 TCA 沉淀物 10 分钟。 并移除上清液。此时样品可在 -20℃ 保存 °C.

5. 免疫沉淀与交联产物检测

1. 向每个样品中加入 50 µl 溶解缓冲液（15% 甘油、200 mM Tris 碱、15 mM EDTA、4% SDS、2 mM PMSF），在 95 °C 振荡加热 5 分钟 ，以溶解沉淀的蛋白质。
2. 加入 1 ml 放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（50 mM Tris pH 8.0、150 mM NaCl、1.0% Igepal CA-630、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% SDS），并使用每份样品的五分之一至二分之一进行标准免疫沉淀¹⁵。
   注意：Igepal CA-630（辛基苯基-聚乙二醇）用于替代已不再商业供应的 NP-40。这两种化合物在化学上无法区分。
3. 通过 SDS-PAGE 分离免疫沉淀的蛋白质。染色、脱色 并干燥凝胶。
4. 将凝胶置于磷屏上过夜曝光，并使用磷光成像仪检测放射性蛋白质（包括交联产物）。

结果

我们采用位点特异性光交联技术，鉴定在 EspP 转运至外膜（OM）过程中与其相互作用的蛋白质。本实验中，将 EspP 第 1113 和 1214 位残基的苯丙氨酸密码子替换为琥珀终止密码子。这两个位点均位于 β 结构域中，该结构域可整合入外膜并作为膜锚定部分。EspP β 结构域的晶体结构¹⁶显示，这两个残基位于 β 桶的周质侧，彼此间隔约 ~120°（见图 2和图 3）。将 E. coli AD202 菌株¹⁷转化 pDULE-pBpa 质粒以及携带两种 EspP 琥珀突变体之一的质粒（pRI22）¹³。加入 IPTG 以诱导 EspP 表达后，进行脉冲-追踪标记，并在 0、1 和 5 分钟时间点收集样品。每份样品的一半接受紫外照射，另一半则作为未照射对照。随后使用针对 EspP C 末端肽段及其他蛋白的抗血清进行免疫沉淀，具体如后所述。免疫沉淀的蛋白通过 SDS-PAGE 分离。

讨论

本文介绍了一种将位点特异性光交联与脉冲-追踪标记相结合的方法，用于研究目标蛋白与活细胞中其他组分之间相互作用的动态过程。该方法特别适用于研究蛋白质依次与其他因子发生相互作用的多步骤过程。与传统的化学交联方法不同，位点特异性光交联能够提供有关目标蛋白各个片段甚至单个残基状态的详细信息。这些信息在分析具有多个独立结构域或模块的蛋白质时尤为有价值，或者如本文所示，在分析那些残基位置相对紧密但分别与寡聚复合物中不同亚基接触的蛋白质时也极为重要。该方法最大的优势或许在于，它能够提供多步骤通路中事件发生的顺序以及蛋白质-蛋白质相互作用动力学的信息。此外，在目标蛋白合成过程中即引入交联基团，可避免耗时的化学反应操作，也无需用可能以不可预测方式改变细胞天然环境的化学试剂处理细胞。原则上，使用长波长紫外光激活Bpa对细胞组分的损伤较小。

影响本方法成功的关键技术因素是琥珀密码子抑制效率和紫外光诱导交联的效率。可通过测定全长蛋白与在琥珀密码子处发生翻译终止所产生的截短蛋白的比值来评估琥珀密码子抑制效率。琥珀密码子抑制效率明显受突变位置（即 翻译上下文）的影响，但也可能受到整...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
QuikChange II 定点突变试剂盒	Agilent	200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)	Bachem	F-2800
TRAN35S-标记物，代谢标记试剂（35S-L-蛋氨酸和 35S-L-半胱氨酸，>1,000 Ci/mmol）	MP Biomedicals	51006
Spectroline SB-100P 超高强度紫外灯，365 nm	Spectronics Corporation	SB-110P
Spectroline 替换灯泡 100S	Spectronics Corporation	11-992-15
Falcon 组织培养板，6 孔	Becton Dickinson Labware	353046
一次性 125 ml 锥形瓶	Corning	430421
Innova 3100 摇动水浴箱	New Brunswick Scientific	n.a.