药物诱导的腺苷酸环化酶敏感化：小分子与siRNA筛选应用中的检测方法优化与微型化

摘要

抑制性G蛋白偶联受体的持续激活会导致腺苷酸环化酶信号通路的敏化。为了鉴定关键的分子通路，必须采用无偏倚的研究方法；然而，该策略需要建立一种可扩展的基于细胞的cAMP敏化检测方法。本文中，我们描述了一种用于小分子和siRNA筛选的敏化检测方法。

摘要

腺苷酸环化酶（AC）信号通路的敏化作用已发现与多种神经精神疾病及神经系统疾病相关，包括物质滥用和帕金森病。Gαi/o偶联受体的急性激活可抑制AC活性，而其持续激活则导致AC的异源性敏化及细胞内cAMP水平升高。先前研究表明，这种AC反应性的增强在两方面均可观察到 体外 和 体内 在多种Gαi/o偶联受体（包括D）持续激活之后₂ 多巴胺和μ阿片受体。尽管AC的异源性敏化现象最早在四十年前已有报道，但介导该现象的机制仍 largely 未知。机制数据的缺乏可能反映了这种适应性反应所涉及的复杂性，提示采用无偏倚的方法可能有助于鉴定参与AC异源性敏化的分子通路。先前的研究已表明，激酶和Gβγ信号通路是调控AC异源性敏化的重叠组分。为了鉴定与AC敏化相关的独特及额外的重叠靶点，需要建立并验证一种可扩展的cAMP敏化检测方法，以实现更高的通量。以往研究敏化作用的方法通常较为繁琐，需要持续的细胞培养维持，以及涉及多个洗涤步骤的复杂cAMP累积检测技术。因此，开发一种稳健的基于细胞的检测方法，可用于384孔板中的高通量筛选（HTS），是必要的 良好的格式将有助于未来的相关研究。使用两种 D₂ 多巴胺受体细胞模型（即. CHO-D_2L 和 HEK-AC6/D_2L），我们已将48孔致敏试验（>20个步骤、4-5天）缩短为384孔板格式下的五步、单日检测。该新方法适用于小分子筛选，我们还证明，此检测设计可轻松用于siRNA的反向转染，为后续开展靶向siRNA文库筛选提供了便利。

引言

一种被称为异源性或超敏化的适应性腺苷酸环化酶（AC）信号响应最初由诺贝尔奖得主马歇尔·尼伦伯格博士的实验室发现。尼伦伯格博士提出，慢性δ阿片受体激活后观察到的AC反应性增强是阿片类耐受性和依赖性的相关机制¹除了慢性δ阿片受体激活外，腺苷酸环化酶（AC）信号通路的这种神经适应性反应还在持续激活其他多种Gαi/o偶联受体后发生²值得注意的是，这些受体中的许多与疼痛、神经精神和神经系统疾病相关，包括μ/κ阿片受体、D_2/4 多巴胺，5HT_1A，以及 M_2/4 毒蕈碱受体²除了Nirenberg博士的研究发现外，大量证据表明，腺苷酸环化酶（AC）信号通路的敏化与阿片受体的慢性激活之间存在关联 体外 和 体内^3-7AC的致敏化也与多种涉及D的疾病相关₂-样多巴胺受体，包括精神分裂症和帕金森病（综述详见参考文献）²尽管致敏作用可能具有重要意义，但与持续性Gαi/o偶联受体激活导致腺苷酸环化酶（AC）反应性增强相关的精确机制仍 largely 未知。

这些研究为探讨腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase）致敏的机制作为重要的神经生物学靶点提供了理论依据。同样，也应认识到AC信号传导⁸的生理相关性，以及各个AC亚型在此适应性反应中所....

方案

1. 检测就绪细胞的扩增与冷冻保存

1. 培养CHO-K1-DRD细胞_2L (CHO-D_2L) 细胞置于15 cm² 含1.0 μM L-谷氨酰胺、800 μg/μL G418、300 μg/μL潮霉素、100 U/μL青霉素、100 μg/μL链霉素和10%胎牛血清（FBS）的Ham's F12培养基中的细胞培养皿
2. 在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育细胞₂ 待细胞融合度达到90-95%时，用10 μl磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后加入3 μl细胞解离缓冲液，37 °C孵育5 min以收集细胞。用12 μl培养基重悬细胞，并使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。
3. 将细胞悬液在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 μl 冷冻保存液（10% 二甲基亚砜，90% FBS）中。稀释细胞悬液以达到所需的细胞浓度（例如 1-20 × 10⁶ 细胞/μl
4. 取1.0 μl细胞悬液加入每个冻存管中。将冻存管置于细胞冻存盒中，于-80 °C孵育过夜。将冻存管转移至液氮中长期保存。₂ 用于长期储存的容器。

2. 铺板准备就绪的细胞（及反向转染选项）

1. 迅速将冻存的细胞冻存管在37 °C水浴中解....

结果

第一部分：利用商业化的细胞模型开发384孔异源致敏检测法，用于鉴定小分子抑制剂。

为了在细胞模型中研究异源致敏现象，我们进行了多项改进，使实验流程简化为“混合即检测”（mix and read）的格式。以下重点介绍了其中几项关键修改，更多细节见讨论部分。第一步关键改进是将细胞培养方式从持续传代培养的细胞改为使用冻存细胞²⁶。我们现在常规培养细胞，并将其冻存于浓度为1–20 × 10⁶ 个细胞/μl的条件下。每次实验时，直接将冻存细胞解冻、稀释、计数后接种至384孔板中，从而省去了常规培养步骤，显著提高了实验的便捷性。此前的致敏实验采用48孔组织培养板，涉及多次洗涤、倾倒、转移操作，以及基于过滤法的[³H]cAMP结合检测（图1）。因此，该方法难以适用于高通量筛选。为此，我们投入大量努力，将实验体系逐步优化至96孔板，最终实现适用于高通量筛选的384孔板格式。优化过程包括去除洗涤步骤，评估多种类型的培养/检测板、不同细胞密度及孵育时间。我们还尝试了多种.......

讨论

为了促进异源致敏研究，我们对先前的方法进行了大量改进，实现了简化的“混合即检测”模式，适用于高通量筛选和作用机制分析。本方案的主要改进可总结如下：1）使用冻存细胞作为“即用型”检测试剂；2）将检测体系微型化至384孔板格式；3）采用HTRF法检测cAMP水平。

在基于细胞的检测中采用冷冻保存技术，显著提高了我们日常实验和筛选工作的效率与可重复性。该方法是行业标准，可轻松应用于学术研究环境²⁶。为提高细胞培养效率，细胞冻存管被作为“即用型试剂”使用，即直接将冻存的细胞库解冻、稀释后接种至384孔板中进行各项检测。我们此前已在旨在鉴定无脊椎动物G蛋白偶联受体拮抗剂的研究中应用了冷冻保存的细胞^32,33。然而，该方法存在不足之处：前期工作并非在本实验室完成，需跨校区转运培养中的细胞，这带来了操作上的挑战，并可能引入实验变异性。采用我们的新方法后，冻存细胞可在实验开始前于实验现场立即解冻并稀释。除提高实验可重复性外，冷冻保存还消除了从细胞接种到检测执行之间所需的48小时等待期（图1）。我们已成功将该冷冻保存方法应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CHO-K1-DRD2L 细胞	DiscoveRx	930579C2
Ham’s F12 培养基	VWR	SH30026fs
胎牛血清	VWR	SH3007003
G418	Sigma	A1720
潮霉素	Fisher	50-230-5556
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070063
15 cm 培养皿	BD Falcon	353025
DMSO	Sigma	D2650
细胞解离缓冲液	Life Technologies	13150016
磷酸盐缓冲液	Life Technologies	10010-049
冻存管	Fisher	976171
Opti-MEM	Life Technologies	31985070
TC 处理的 384 孔板	Perkin-Elmer	6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 试剂盒	Cisbio Bioassays	62AM4PEB	http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4	Biotek	H4MLFPTAD
Prism 6	GraphPad Software	NA
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	Sigma	I5879
(±) 奎诺哌隆	Sigma	Q111
螺哌隆	Sigma	S7395
氯氮平	Sigma	C6305
氟哌啶醇	Sigma	H1512
S-(-) 舒必利	Sigma	S112
Lipofectamine 2000 转染试剂	Invitrogen	11668019
台盼蓝	Life Technologies	T10282
无 DNase 和 RNase 的水	MP Biomedicals	821739
Gas siRNA	Dharmacon	custom siRNA
非靶向 siRNA 对照	Dharmacon	D-001206-14-20
siGlo Red	Dharmacon	D-001630-02