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方法文章

药物诱导的腺苷酸环化酶敏感化：小分子与siRNA筛选应用中的检测方法优化与微型化

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DOI：

10.3791/51218

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2014年1月27日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

本文内容

摘要

抑制性G蛋白偶联受体的持续激活会导致腺苷酸环化酶信号通路的敏化。为了鉴定关键的分子通路，必须采用无偏倚的研究方法；然而，该策略需要建立一种可扩展的基于细胞的cAMP敏化检测方法。本文中，我们描述了一种用于小分子和siRNA筛选的敏化检测方法。

摘要

腺苷酸环化酶（AC）信号通路的敏化作用已发现与多种神经精神疾病及神经系统疾病相关，包括物质滥用和帕金森病。Gαi/o偶联受体的急性激活可抑制AC活性，而其持续激活则导致AC的异源性敏化及细胞内cAMP水平升高。先前研究表明，这种AC反应性的增强在两方面均可观察到 体外 和 体内 在多种Gαi/o偶联受体（包括D）持续激活之后2 多巴胺和μ阿片受体。尽管AC的异源性敏化现象最早在四十年前已有报道，但介导该现象的机制仍 largely 未知。机制数据的缺乏可能反映了这种适应性反应所涉及的复杂性，提示采用无偏倚的方法可能有助于鉴定参与AC异源性敏化的分子通路。先前的研究已表明，激酶和Gβγ信号通路是调控AC异源性敏化的重叠组分。为了鉴定与AC敏化相关的独特及额外的重叠靶点，需要建立并验证一种可扩展的cAMP敏化检测方法，以实现更高的通量。以往研究敏化作用的方法通常较为繁琐，需要持续的细胞培养维持，以及涉及多个洗涤步骤的复杂cAMP累积检测技术。因此，开发一种稳健的基于细胞的检测方法，可用于384孔板中的高通量筛选（HTS），是必要的 良好的格式将有助于未来的相关研究。使用两种 D2 多巴胺受体细胞模型（即. CHO-D2L 和 HEK-AC6/D2L），我们已将48孔致敏试验（>20个步骤、4-5天）缩短为384孔板格式下的五步、单日检测。该新方法适用于小分子筛选，我们还证明，此检测设计可轻松用于siRNA的反向转染，为后续开展靶向siRNA文库筛选提供了便利。

引言

一种被称为异源性或超敏化的适应性腺苷酸环化酶（AC）信号响应最初由诺贝尔奖得主马歇尔·尼伦伯格博士的实验室发现。尼伦伯格博士提出，慢性δ阿片受体激活后观察到的AC反应性增强是阿片类耐受性和依赖性的相关机制1除了慢性δ阿片受体激活外，腺苷酸环化酶（AC）信号通路的这种神经适应性反应还在持续激活其他多种Gαi/o偶联受体后发生2值得注意的是，这些受体中的许多与疼痛、神经精神和神经系统疾病相关，包括μ/κ阿片受体、D2/4 多巴胺，5HT1A，以及 M2/4 毒蕈碱受体2除了Nirenberg博士的研究发现外，大量证据表明，腺苷酸环化酶（AC）信号通路的敏化与阿片受体的慢性激活之间存在关联 体外 和 体内3-7AC的致敏化也与多种涉及D的疾病相关2-样多巴胺受体，包括精神分裂症和帕金森病（综述详见参考文献）2尽管致敏作用可能具有重要意义，但与持续性Gαi/o偶联受体激活导致腺苷酸环化酶（AC）反应性增强相关的精确机制仍 largely 未知。

这些研究为探讨腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase）致敏的机制作为重要的神经生物学靶点提供了理论依据。同样，也应认识到AC信号传导8的生理相关性，以及各个AC亚型在此适应性反应中所发挥的重要作用2,9,10。在我们的研究背景下，重组AC亚型的异源致敏所表现出的一般特征，与内源性AC亚型研究中所描述的特征相似。具体而言，先前的研究发现，Gαi/o蛋白的激活以及随后βγ亚基的释放/重排，是受体诱导所有AC亚型致敏的重要前提条件。此外，多项研究表明，蛋白激酶和Gβγ亚基的信号传导也参与了致敏过程2,11-13。不同的AC亚型还表现出独特且各异的致敏模式12。例如，D2受体持续暴露于激动剂时，会导致AC1和AC8对Ca2+/钙调蛋白刺激的敏感性增强14,15，而与其密切相关的AC3则不会发生致敏2。AC2、AC4和AC7彼此关系密切，然而只有在D2受体长期暴露于激动剂后，蛋白激酶C（PKC）刺激的AC2活性才会显著增强7,14,16,17。此外，AC5和AC6在D2受体激活后，对Gαs和forskolin刺激的cAMP累积表现出明显的异源致敏性14,18-20，但在对Gβγ亚基与AC相互作用的需求方面似乎存在差异21。尽管大多数AC致敏研究使用的是模型细胞系（例如表达单个AC亚型的HEK293细胞），但这些发现似乎可推广至原代神经元细胞模型4,22。最近的研究还发现，在表达AC亚型的HEK293细胞中鉴定出的AC亚型选择性小分子抑制剂的作用，也可延伸至体内行为学研究23。

目前尚未明确异源致敏的分子机制，这可能反映了适应性反应的复杂性以及各个AC亚型独特的调控特性12。此外，由于研究中使用的方法较为繁琐，限制了学术研究人员采用无偏倚的研究策略，进一步增加了揭示这种复杂性的难度。例如，我们先前的机制研究采用了持续培养的细胞模型，使用24孔和48孔组织培养板格式15。通常将培养细胞生长48小时，随后进行激动剂药物处理（2–18小时），再经历一系列的细胞洗涤和孵育步骤（图1）。接着采用针对特定AC亚型的cAMP累积检测方案，并通过耗时且劳动密集的[3H]cAMP结合方法测定cAMP的累积量15,24。每项实验从开始到结束通常需要四至五天，涵盖从细胞接种到数据分析的全过程（图1）。新技术的应用和自动化手段的引入已在工业界和高通量筛选中心显著提升了致敏研究的效率。例如，国家化学生物学中心的一个研究团队报道了一种在1,536孔板中用于筛选μ阿片受体介导的致敏过程小分子抑制剂的两天高通量筛选检测流程25。

本文介绍了我们利用大多数高校科研机构普遍具备的技术手段，开发一种用于研究异源致敏的高通量筛选（HTS）检测方法的努力。该策略通过采用冷冻保存的细胞模型，这些细胞异源表达 D2 多巴胺受体，并同时表达内源性或单独的重组腺苷酸环化酶亚型（CHO-D2L 或 HEK-AC6/D2L），从而实现目标。为了提高通量，我们将原有的48孔板致敏检测法（约 >20个步骤，耗时4–5天）重新设计为一种仅需五个步骤、在384孔板中单日完成的“混合即检测”式检测方法。新方法采用 commercially available 的均相时间分辨荧光（HTRF）检测技术，结合多功能酶标仪，测定完整细胞中cAMP的累积。该检测方法稳定可靠，适用于小分子化合物筛选，可有效用于筛选异源致敏的抑制剂。此外，我们还提供了相关数据，表明仅需对常规方法进行轻微修改，即可将该检测体系与siRNA反向转染技术结合，用于靶向或全基因组范围的siRNA文库筛选。

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方案

1. 检测就绪细胞的扩增与冷冻保存

  1. 培养CHO-K1-DRD细胞2L (CHO-D2L) 细胞置于15 cm2 含1.0 μM L-谷氨酰胺、800 μg/μL G418、300 μg/μL潮霉素、100 U/μL青霉素、100 μg/μL链霉素和10%胎牛血清（FBS）的Ham's F12培养基中的细胞培养皿
  2. 在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育细胞2 待细胞融合度达到90-95%时，用10 μl磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，随后加入3 μl细胞解离缓冲液，37 °C孵育5 min以收集细胞。用12 μl培养基重悬细胞，并使用台盼蓝排斥法进行细胞计数。
  3. 将细胞悬液在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 5 μl 冷冻保存液（10% 二甲基亚砜，90% FBS）中。稀释细胞悬液以达到所需的细胞浓度（例如 1-20 × 106 细胞/μl
  4. 取1.0 μl细胞悬液加入每个冻存管中。将冻存管置于细胞冻存盒中，于-80 °C孵育过夜。将冻存管转移至液氮中长期保存。2 用于长期储存的容器。

2. 铺板准备就绪的细胞（及反向转染选项）

  1. 迅速将冻存的细胞冻存管在37 °C水浴中解冻。细胞解冻后，转移至含有9 μl Opti-MEM的15 μl锥形管中，通过倒置管子3–5次混匀。
  2. 在室温下以 500 x g 离心 5 分钟。吸除上清液，并将细胞重悬于 1 μl Opti-MEM 中。
  3. 使用台盼蓝排斥法计数细胞以确定细胞活力，并根据需要稀释活细胞（例如. 3 × 105 细胞/μl 浓度）置于 Opti-MEM 培养基中。使用多通道移液器将 10 μl/孔的细胞悬液接种至经组织培养处理的 384 孔板中。
  4. 在Opti-MEM中对cAMP进行系列稀释，以生成标准曲线用于估算细胞产生的cAMP水平（按照试剂盒生产商的建议——见第7节）。每孔加入10 μl的cAMP标准品。 注意： 可在其中一个检测板的空白孔中或在单独的板上制备一条标准曲线。
  5. 将培养板在室温下以 100 × g 离心 15 秒，随后在含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中于 37 °C 培养2 1 小时。

3. 反向 siRNA 转染方案*

本部分为可选内容，与图3相关。

  1. 在无RNase的ddH₂O中配制siRNA溶液2O (例如 0.4 pmol/μl）。取 5 μl 加入 384 孔板的各个孔中，于室温下以 100 × g 离心 15 秒。
  2. 将 Lipofectamine 2000 用 Opti-MEM 稀释至 0.006 倍浓度（例如 将6 μl Lipofectamine 2000加入1,000 μl Opti-MEM中，用移液器吹打混匀。
  3. 将 Lipofectamine 2000/Opti-MEM 溶液在室温下孵育 5 分钟。向已含有 siRNA 的 384 孔板各孔中加入 5 μl 稀释后的 Lipofectamine 2000/Opti-MEM 溶液。在室温下以 100 × g 离心 15 秒。
  4. 将培养板在室温下孵育30分钟。
  5. 按上述方法（第2节）将细胞接种于平板中。室温下以100 × g离心15秒。
  6. 将检测板放回37 °C（5% CO₂）的加湿培养箱中2) 48–96 小时，具体时间根据靶基因敲低效果确定（见讨论部分）。

4. 小分子筛选

  1. 将目标药物（例如 小分子抑制剂）用 Opti-MEM 稀释至所需终浓度的 6 倍。可使用手动移液器或液体处理工作站完成系列稀释。
  2. 使用多通道移液器，将 2.5 μl/孔的待测化合物或含载体（例如 DMSO）的缓冲液沿孔壁加入。
  3. 在室温下以 100 × g 离心 15 秒（孵育为可选步骤）。

5. 持续性激动剂处理

  1. 制备600 nM（即所需终浓度（100 nM）6倍的喹吡罗Opti-MEM溶液
  2. 使用多通道移液器，将2.5 μl/孔的600 nM喹吡罗溶液沿孔壁加入各孔中。
  3. 将培养板在室温下以 100 × g 离心 15 秒，随后在含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中于 37 °C 培养2 2小时。

6. cAMP 累积的刺激

  1. 在2小时孵育期间，用Opti-MEM配制刺激溶液。刺激溶液包含40 μM forskolin、2 μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）和4 μM spiperone（第6步中的所有浓度均为目标终浓度的4倍）。
  2. 使用多通道移液器将5 μl/孔的刺激溶液加入孔板孔壁侧边。
  3. 将板在室温下以100 × g离心15秒，并在室温下孵育1小时。

7. cAMP 累积的淬灭与测定

  1. 根据制造商说明书，使用cAMP dynamic 2试剂盒测定细胞中cAMP的生成。简而言之，用蒸馏水重悬抗-cAMP-cryptate和cAMP-d2。分装后于-20 °C冷冻保存，用于短期储存。
  2. 根据制造商说明书，分别用裂解缓冲液稀释一份抗-cAMP-cryptate和一份cAMP-d2，配制成工作液。
  3. 使用多通道移液器向384孔板中每孔加入10 μl抗-cAMP-cryptate工作液和10 μl cAMP-d2工作液。
  4. 在室温下以100 × g离心板片15秒，并在室温下孵育1小时。
  5. 使用荧光酶标仪（灵敏度设为自动量程），在激发波长337 nm下读板，按照制造商说明检测620 nm和665 nm处的发射光。
  6. 按照制造商说明对cAMP标准曲线进行比率分析。利用所得数值，通过数据分析软件推算出检测孔中cAMP的累积量。

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结果

第一部分：利用商业化的细胞模型开发384孔异源致敏检测法，用于鉴定小分子抑制剂。

为了在细胞模型中研究异源致敏现象，我们进行了多项改进，使实验流程简化为“混合即检测”（mix and read）的格式。以下重点介绍了其中几项关键修改，更多细节见讨论部分。第一步关键改进是将细胞培养方式从持续传代培养的细胞改为使用冻存细胞26。我们现在常规培养细胞，并将其冻存于浓度为1–20 × 106 个细胞/μl的条件下。每次实验时，直接将冻存细胞解冻、稀释、计数后接种至384孔板中，从而省去了常规培养步骤，显著提高了实验的便捷性。此前的致敏实验采用48孔组织培养板，涉及多次洗涤、倾倒、转移操作，以及基于过滤法的[3H]cAMP结合检测（图1）。因此，该方法难以适用于高通量筛选。为此，我们投入大量努力，将实验体系逐步优化至96孔板，最终实现适用于高通量筛选的384孔板格式。优化过程包括去除洗涤步骤，评估多种类型的培养/检测板、不同细胞密度及孵育时间。我们还尝试了多种...

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讨论

为了促进异源致敏研究，我们对先前的方法进行了大量改进，实现了简化的“混合即检测”模式，适用于高通量筛选和作用机制分析。本方案的主要改进可总结如下：1）使用冻存细胞作为“即用型”检测试剂；2）将检测体系微型化至384孔板格式；3）采用HTRF法检测cAMP水平。

在基于细胞的检测中采用冷冻保存技术，显著提高了我们日常实验和筛选工作的效率与可重复性。该方法是行业标准，可轻松应用于学术研究环境26。为提高细胞培养效率，细胞冻存管被作为“即用型试剂”使用，即直接将冻存的细胞库解冻、稀释后接种至384孔板中进行各项检测。我们此前已在旨在鉴定无脊椎动物G蛋白偶联受体拮抗剂的研究中应用了冷冻保存的细胞32,33。然而，该方法存在不足之处：前期工作并非在本实验室完成，需跨校区转运培养中的细胞，这带来了操作上的挑战，并可能引入实验变异性。采用我们的新方法后，冻存细胞可在实验开始前于实验现场立即解冻并稀释。除提高实验可重复性外，冷冻保存还消除了从细胞接种到检测执行之间所需的48小时等待期（图1）。我们已成功将该冷冻保存方法应...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Richard Zink 先生和 Todd Wiernicki 提供的方法学培训与实验指导。同时感谢 John Paul Spence 的仔细审阅及编辑建议。本研究工作由美国国立卫生研究院（MH 060397）、脑与行为研究基金会以及通过礼来研究奖计划（LRAP）由礼来公司资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CHO-K1-DRD2L 细胞DiscoveRx930579C2
Ham’s F12 培养基VWRSH30026fs
胎牛血清VWRSH3007003
G418SigmaA1720
潮霉素Fisher50-230-5556
青霉素/链霉素Life Technologies15070063
15 cm 培养皿BD Falcon353025
DMSOSigmaD2650
细胞解离缓冲液Life Technologies13150016
磷酸盐缓冲液Life Technologies10010-049
冻存管Fisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC 处理的 384 孔板Perkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 试剂盒Cisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad SoftwareNA
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤SigmaI5879
(±) 奎诺哌隆SigmaQ111
螺哌隆SigmaS7395
氯氮平SigmaC6305
氟哌啶醇SigmaH1512
S-(-) 舒必利SigmaS112
Lipofectamine 2000 转染试剂Invitrogen11668019
台盼蓝Life TechnologiesT10282
无 DNase 和 RNase 的水MP Biomedicals821739
Gas siRNADharmaconcustom siRNA
非靶向 siRNA 对照DharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02

参考文献

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