一种适用于cGMP的扩增方法，用于由多能干细胞或胎儿脑组织衍生的人类神经干细胞与前体细胞聚集体

摘要

本方案描述了一种新型的机械切碎方法，该方法可在无需解离为单细胞悬液的情况下实现球形神经干细胞及祖细胞聚集体的扩增。 维持细胞间的接触可实现超过40代的快速且稳定的生长。

摘要

一种能够从单个样本中大量扩增细胞以用于科研实验和临床试验的细胞扩增技术，将极大地造福干细胞研究领域。目前许多扩增方法繁琐且成本高昂，而涉及完全解离的方法可能导致多种干细胞和前体细胞发生分化或过早衰老。为克服这些问题，我们开发了一种自动化机械传代方法，称为“切碎法”（chopping），该方法操作简单且成本低廉。该技术避免使用化学或酶解方法将组织解离为单个细胞，而是支持在保持细胞间持续接触的前提下，实现悬浮球状培养物的大规模扩增。该切碎法最初主要用于胎儿脑源性神经前体细胞或神经球，最近已发表用于胚胎干细胞和诱导性多能干细胞来源的神经干细胞。该操作过程包括将神经球接种于组织培养培养皿中，随后用锋利且无菌的刀片穿过细胞团，从而实现对每个神经球的手动机械解离过程的自动化。细胞在悬浮培养中具有有利的表面积与体积比；例如，直径小于0.5 mm的单个神经球内可培养超过50万个细胞。在一只T175培养瓶中，悬浮培养可生长超过5000万细胞，而贴壁培养仅能生长约1500万细胞。尤为重要的是，该切碎法已在现行药品生产质量管理规范（cGMP）条件下应用，可用于生产临床级细胞产品的大量制备。

引言

长期以来，啮齿类动物的神经干细胞在体外培养中被扩增为单层细胞^1-3或聚集体形式的神经球^4-7。此外，从发育中的中枢神经系统不同区域分离得到的人类神经前体细胞（hNPCs）^8-17也已在体外成功扩增。in vitro。这些细胞具有双潜能性，能够分化为星形胶质细胞和神经元，在研究神经发育^18,19及疾病机制^20,21方面发挥了重要作用。hNPCs还被移植到多种中枢神经系统疾病的动物模型中，在不同模型中表现出程度不一的整合能力、存活率及功能效应^22-24。

传统上，啮齿类或人源胎儿神经前体细胞（NPCs）需暴露于生长因子——通常是表皮生长因子（EGF）和/或成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）^25-28——并且贴壁²⁹以及三维球状体系统通常通过酶消化法解离为单细胞悬液进行传代^30-34。由于操作简便，用于科研或临床用途的细胞扩增标准方法是采用贴壁单层培养。然而，我们已证明，使用酶或化学溶液对单层培养及神经球形式的人神经前体细胞（hNPCs）进行传代会导致早期衰老³⁵。此外，根据胚胎干细胞的研究数据，酶消化法可能导致分化水平升高以及核型异常^36-38。尽管标准的hNPCs传代方法已生产出符合现行药品生产质量管理规范（cGMP）要求的产品，并已进入I期临床试验（Stem Cells Inc.， Neuralstem Inc.），但该方法仅允许有限次数的细胞扩增，限制了细胞库的建立潜力。

显然，大规模科研实验及未来的临床试验将受益于能够大规模扩增细胞并延缓细胞衰老的技术，从而实现细胞的大量培养与储存。为满足这一需求，我们开发了一种新颖且自动化的机械传代方法，通过将完整的神经球“切碎”成小细胞簇，以维持细胞间的相互接触。该方法显著延长了神经球的生命周期³⁹ 悬浮培养相比单层培养能更高效地利用培养箱空间，这一点在另一种三维生物反应器培养方法中已得到证实⁴⁰所提供的切碎传代方法能够从一份胎体样本中大规模建立超过第10代的细胞库，而使用标准传代方法几乎无法实现这一目标。尽管这种人源神经前体细胞（hNPCs）传代方法较为非常规，但其应用正日益普及，并已近期与其他细胞类型共同发表，例如源自人胚胎干细胞和诱导性多能干细胞的神经干细胞，从而实现了大规模扩增，适用于多种应用领域 体外 疾病建模^41-46重要的是，已采用切碎法成功制备了符合cGMP标准的人神经前体细胞（hNPC）细胞库，表明该技术可应用于未来的临床实践。

方案

1. 伦理声明与安全

1. 本实验操作涉及使用来源于人类或动物的细胞培养产品。所有来源组织在使用前必须获得相应的机构审查委员会和/或机构动物护理与使用委员会的批准。
2. 所有生物危害性废弃物必须根据各机构制定的安全规定进行处理。在本实验全过程当中，须了解并严格遵守所有相关的安全操作与废弃物处置指南。

2. 仪器、耗材、试剂的准备及观察

1. 准备
   1. 准备一个玻璃培养皿、直径为8.5 cm的滤纸圆片以及双刃切片刀片。
   2. 将一张滤纸放入培养皿中，并将多个未包被的刀片转移至培养皿内的滤纸上。
   3. 重复叠加滤纸和刀片，直至培养皿约填充至75%，盖上培养皿盖后进行高压灭菌。储存于无菌或密闭环境中以保持无菌状态。
   4. 将18 cm的镊子和一个可高压灭菌的螺母驱动器放入灭菌袋中进行高压灭菌。对于cGMP生产，还需将多个不锈钢垫片圆盘放入灭菌袋中进行高压灭菌。有关垫片圆盘的更多信息，请参见步骤3.5。
   5. 使用70%异丙醇（IPA）对生物安全柜（BSC）进行消毒。
   6. 所有操作必须在生物安全柜（BSC）中进行，以维持无菌环境。将以下物品无菌转移至BSC中：
      1. McIlwain组织切碎机（切碎机）。使用70% IPA擦拭所有表面，特别是切碎机臂（图1B）。如有必要，整个切碎机可通过环氧乙烷进行去污染处理。
      2. 一个已灭菌的螺母驱动器或螺母扳手（随切碎机提供，图1I）、一把18 cm镊子、一套标准规格的移液器（20 µl–1,000 µl）、一个移液助吸器及试管架。
      3. 无菌一次性移液管、带滤芯的移液器吸头、15 ml锥形管、60 mm培养皿、双刃切片刀片以及适当尺寸的T型培养瓶。注意：仅可使用镊子操作锋利刀片。
2. 试剂
   1. 在维持培养基（MM）中扩增人神经前体细胞（hNPCs），该培养基由神经干细胞扩增培养基、100 ng/ml EGF和10 ng/ml白血病抑制因子（LIF）组成。将配制培养基所需的试剂和过滤装置转移至BSC中。
   2. 使用神经干细胞扩增培养基重新溶解冻干的EGF，并分装为100 µg/ml的 aliquots，于-80 °C保存，最长可保存1年。LIF按购买时状态在4 °C保存，最长可保存6个月或至厂家标注的过期日期。
   3. 将MM试剂转移至BSC中。将所有试剂加入适当尺寸的过滤装置中，使用真空装置过滤。于4 °C保存，最长可保存3周。
3. hNPCs观察
   1. 在进行切碎操作前，需重点关注的两个最重要因素是细胞球直径和培养基条件（或颜色）。条件培养基（CM）是指在培养条件下（37 °C、5% CO₂、95%湿度）被人神经前体细胞代谢后的培养基。随着细胞对培养基的代谢，酚红组分会由粉红色变为黄色，表明环境酸性增强（图5D）。
   2. 将装有hNPCs的培养瓶置于光源前观察培养基颜色（详见讨论部分）。
   3. 使用显微镜扫描培养瓶以观察细胞。使用目镜测微尺检测细胞球大小。若多数细胞球直径达到300 µm或更大，即可进行切碎操作。每7–10天进行一次细胞切碎。
   4. 若暂无需切碎，则根据细胞代谢培养基的速度，每隔3–4天更换25–75%的条件培养基。持续更换培养基，直至细胞球生长至足够大以进行传代。
   5. hNPCs通常以1:2的比例进行切碎传代，从小培养瓶传至大培养瓶。可参考表1中的培养瓶尺寸与推荐体积作为指导。

培养瓶	总培养基体积	传代前	→	传代后
1 个 T12.5 培养瓶	5 ml	1 个 T12.5 培养瓶	→	1 个 T25 培养瓶
1 个 T25 培养瓶	10 ml	1 个 T25 培养瓶	→	1 个 T75 培养瓶
1 个 T75 培养瓶	20 ml	1 个 T75 培养瓶	→	1 个 T175 培养瓶
1 个 T175 培养瓶	40 ml	1 个 T175 培养瓶	→	2 个 T175 培养瓶
2 个 T175 培养瓶	80 ml	2 个 T175 培养瓶 *	→	4 个 T175 培养瓶
* 一次最多可消化 2 个 T175 培养瓶。请以每 2 个 T175 培养瓶为一组进行操作，并参考步骤 7。

表1. hNPC扩增方案。hNPC典型扩增流程的描述。通常每7-10天进行一倍体积的扩增。

3. 切片机设置

图1. McIlwain 组织切片机。A) 切片厚度调节微调螺杆，B) 切片臂基座及连接臂，C) 培养皿支架上的挂钩，D) 平台释放旋钮和托盘，E) 刀片压力控制旋钮，F) 复位开关，G) 刀片支架，H) 刀片固定螺栓、卡扣及螺母，I) 随切片机附带的螺母扳手，J) 刀片/卡扣螺母，K) 刀片卡扣，L) 自动切片速度控制旋钮，M) 手动切片臂操作旋钮，N) 电源开关。

1. 将切碎机插入生物安全柜内的电源插座，并打开电源开关（图1N）。将切碎距离设置为 200 µm（图1A）。将刀片力度调节至 270°，或如果旋钮像时钟一样，则调至 9:00 位置（图1E）。确认自动速度旋钮已逆时针旋转至最末端（图1L）。
2. 将台面释放装置完全向右移动，确认载片架稳定（图1D）。
3. 顺时针旋转手动臂操作器，将机械臂升至最高位置（图1M）。手动臂操作器仅可顺时针旋转。
4. 使用镊子将无菌双刃切碎刀片无菌转移至切碎机臂的螺栓上（图1H）。
5. 此步骤仅适用于cGMP级传代；对于科研级操作，仅使用培养皿即可。如步骤2.1.4所述，cGMP级操作需在培养皿底部放置垫片（shim disc）。垫片可防止切碎过程中塑料碎屑混入类球体中。每次计划进行切碎操作时，向每个培养皿底部放入一个垫片并盖上皿盖。
6. 使用镊子将卡扣（图1K）无菌地放置在刀片上。卡扣的弯曲部分必须位于机械臂的上边缘之上。在螺母未牢固安装前，卡扣无法固定在机械臂上。使用镊子将卡扣固定在机械臂上，并用无菌螺母扳手将螺母（图1J）拧紧至螺栓上，但保留约1/4圈松动。

4. 预切片步骤

1. 根据表2，C列，将建议体积的MM转移至新的培养瓶中。
2. 将细胞从培养箱中无菌转移至生物安全柜内。将培养瓶斜靠在试管架上（图2A），静置使类球体在瓶内沉降。
3. 待沉降后，使用5 ml或10 ml移液管吸除最多12 ml上清液，并冲洗培养瓶表面所有松散附着的类球体。根据需要重复操作，每次冲洗之间均需重新沉降类球体。
4. 根据表2，D列，将建议体积的CM加入新的培养瓶中。若传代两个或更多T175培养瓶，请参见步骤7.1。
5. 将所有剩余的CM和类球体转移至一个新的15 ml锥形离心管中。静置使类球体沉降，随后弃去使用过的培养瓶。
6. 关键步骤：将类球体从15 ml锥形离心管中缓慢转移至60 mm培养皿或垫片圆盘上，使用尽可能小的液体体积（推荐0.1–0.5 ml）（图2B）。保留剩余的CM液体，后续将用于切碎后冲洗培养皿中的细胞。尽量减少类球体和培养基在培养皿上覆盖的表面积（图2C）。

图 2. 用于切割的细胞球制备。A) 将培养瓶靠在试管架或其他类似物体上，使细胞球沉降到培养瓶的角落。 B) 尽可能密集地将细胞球从锥形管转移至培养皿中。 C) 将来自锥形管的细胞球集中于培养皿中央。 D) 尽可能多地从聚集的细胞球顶部去除上清液。 E) 使用塑料移液器吸头的侧面将细胞球铺展开。 F) 轻轻地将细胞球移至聚集区域的一侧。 G) 细胞球被移至一侧以便去除培养基的示例。 H) 在培养皿上铺展开的浓缩细胞球，已准备好进行切割。 点击此处查看大图

7. 接下来，需要通过去除第 4.6 步中转移的上清液来浓缩球体。使用带气溶胶屏障吸头的微量移液器将上清液重新转移回 15 ml 锥形管（图 2D），注意避免移走球体。首先从培养基/细胞悬液的顶部尽可能多地移除培养基。当无法在不带走球体的情况下继续移除培养基时，进入下一步操作。

列 A		列 B	列 C	列 D	列 E	列 F
消化前培养瓶规格	→	消化后培养瓶规格	建议在消化前转移至新培养瓶的 MM 体积	建议在消化前转移至新培养瓶的 CM 体积	建议在消化后转移至新培养瓶的类球体/培养基体积	每瓶接种的最终体积
T12.5	→	T25	5 ml	0 ml	5 ml	10 ml
T25	→	T75	10 ml	0 ml	10 ml	20 ml
T75	→	T175	20 ml	10 ml	10 ml	40 ml
1 个 T175	→	2 个 T175	每瓶 20 ml	每瓶 15 ml	每瓶 5 ml	40 ml
2 个 T75	→	4 个 T175	每瓶 20 ml	每瓶 17.5 ml	每瓶 2.5 ml	40 ml

表2. 切碎前后培养基转移指南。切碎过程中建议使用的体积。

8. 使用移液枪头侧面将细胞悬液铺开，以增大表面积（图 2E）。
9. 关键步骤：将培养皿略微向自己方向倾斜，用移液枪头侧面轻柔地将所有类球体滑动至液滴的一侧（图 2F,G）。
10. 关键步骤：当所有细胞均已移至一侧后，缓慢将培养皿向相反方向倾斜。在此过程中，培养基将单独流离类球体。将流出的培养基转移回15 ml锥形管中。允许极少量类球体被带走。
11. 使用移液枪头侧面将所有类球体轻轻滑回培养皿中央，使液滴直径维持在0.5–2.4 cm（图 2H）。保持类球体液滴的深度较浅至关重要。若液滴过深，切块时类球体将被直接推至一旁。注意：类球体液滴直径不得超过2.5 cm，否则刀片会触碰到培养皿边缘，导致无法切到细胞。

5. 切碎步骤

1. 将培养皿转移至载物台（图1G），并确保培养皿固定在载物台的卡钩下方（图1C）。
2. 台面释放旋钮具有可嵌入齿轮的凹槽。使用台面释放旋钮将载物台向左滑动，使刀片完全脱离小球区域并锁定在齿轮中（图1D）。
3. 关键步骤：顺时针旋转手动操纵旋钮（图1M），降低切片臂，直至刀片迅速下落并平整地压在培养皿上。用一只手按住臂支架（图1B），同时用螺母扳手拧紧螺母。
4. 按下复位按钮一次（图1F）。一只手稳定培养皿，同时顺时针旋转自动臂操纵旋钮（图1L）至90°位置，或相当于时钟12:00的位置。注意：操作过程中始终将手指远离移动的刀片。
5. 使刀片完全穿过小球液面。将载物台旋转90°。
6. 松开螺栓，并重复步骤5.3–5.5。
7. 在生物安全柜内，无菌操作将培养皿从载物台转移至工作区域。

6. 切割后处理步骤

1. 使用步骤 4.6 中锥形管内的 CM 预润 10 ml 血清移液管，然后将 1 ml CM 转移至切碎的类球体上。轻轻重悬后转移至新的 15 ml 锥形管中。避免产生气泡，并根据需要重复操作以收集全部切碎的类球体。
   提示：尽量减少刮取培养皿的动作，以免塑料碎片脱落。若使用不锈钢垫片圆盘则无需担心此问题。注意细胞可能附着在塑料血清移液管内壁，若发生此情况，可通过间歇性地吸入气泡穿过移液管中的培养基以使细胞脱落。
2. 测量 CM 和切碎类球体的总体积。加入适量 MM，使总体积达到 表 2，E 列 所列数值。
3. 吹打重悬类球体 2–3 次，以分散任何松散融合的类球体。
4. 关键步骤：将类球体悬液分装至各个新培养瓶中。每次仅将悬液转移至一个培养瓶，并在每次转移之间重新混匀类球体。若同时分装多个培养瓶，会导致各瓶中类球体数量不均。每个培养瓶中的终体积应等于 表 2，F 列 所列体积。当接种超过两个 T175 培养瓶时，请参见步骤 7.2。
5. 使用螺母起子取下螺母，再用无菌镊子取下卡扣。使用 70% 异丙醇或等效消毒剂进行适当去污。注意：必须仅使用镊子取下已使用的切碎刀片，并将其丢弃至生物危害锐器容器中。
6. 使用 70% 异丙醇对切碎器所有表面进行去污处理。

7. 流程变体——多个烧瓶

当传代超过两个T175培养瓶时，存在若干差异。以下步骤是对参考步骤的修改。

1. 参考步骤 4.4：
   1. 传代两个 T175 培养瓶时，将所有培养基和类球体合并至一个 T175 培养瓶中。让类球体沉降后，按照 表 2，D 列 中所述，将适量体积的 CM 分装至每个新培养瓶中。继续进行步骤 4.5。
   2. 传代超过两个 T175 培养瓶时，取一个新的 T175 培养瓶并标记为 CM 瓶。完成步骤 7.1.1，但将 CM 转移至 CM 瓶 中。将该瓶置于生物安全柜侧面，用于收集所有培养瓶的 CM，直至所有培养瓶均完成切割。随后将 CM 均匀分装至每个新培养瓶中。
2. 参考步骤 6.4 —— 当多次切割同一种细胞系时，将切割后的类球体悬液转移至一个新标记的 T75 培养瓶中，标记为 切割后类球体，并记录转移的体积。每次切割后均继续将细胞合并至该培养瓶中，并将培养瓶置于 37 °C、5% CO₂、95% 湿度的培养箱中保存。待所有切割操作完成后，按体积将类球体悬液分装至各个新培养瓶中。继续进行步骤 6.5。

8. 冷冻保存

以下方案用于在低温条件下保存人神经前体细胞（hNPCs）。

1. 在37 °C的洁净水浴中解冻细胞冻存液，然后置于冰上保存。细胞冻存液可分装后于-80 °C保存长达6个月。
2. 将玻璃巴斯德移液管的管口在火焰中旋转灼烧以进行火焰抛光。准备至少两根大口径和两根小口径的火焰抛光移液管（图3）。球状体将通过从大口径移液管转移至小口径移液管进行解离。
3. 将TrypLE Select置于37 °C水浴中5分钟。取出后室温放置，待用。

图3. 火焰抛光玻璃巴斯德移液管。A) 将移液管置于火焰上部并旋转，以均匀地将玻璃移液管口边缘圆滑处理。B) 大孔径火焰抛光玻璃移液管示例。C) 小孔径火焰抛光玻璃移液管示例。

4. 在无菌条件下将神经球转移至生物安全柜中。将培养瓶倾斜靠在试管架上，使神经球自然沉降，并冲洗瓶底以去除松散附着的神经球。让神经球重新沉降。
5. 将除5–10 ml完全培养基（CM）以外的其余部分转移至无菌瓶中，并测量总体积。将剩余的神经球和培养基转移至一个锥形管中。
6. 待所有细胞沉降后，将除少量弯月面液体外的CM转移至瓶中，并累加总体积。
7. 在无菌条件下向锥形管中加入5–10 ml预热的TrypLE Select，重悬细胞沉淀。将锥形管置于37 °C水浴中孵育15–20分钟。在孵育7.5–10分钟后，轻轻振荡锥形管以混匀内容物。
8. 根据步骤8.5测得的CM体积，配制等体积的维持培养基（MM）。将50% CM与50% MM混合后过滤，得到CM/MM混合液。
9. 在无菌条件下将一个40 µm细胞筛转移至50 ml锥形管中。
10. 当孵育完成后，以100 × g离心15秒。
11. 小心吸除并弃去TrypLE Select及任何丝状基质，保留少量弯月面液体。轻柔加入2–4 ml CM/MM以稀释残留的TrypLE Select，同时避免扰动细胞沉淀。在弃去洗涤液前，让脱落的细胞重新沉降。
12. 向含有神经球的管中加入2–5 ml CM/MM溶液。使用5 ml移液器最多吹打10次以解离神经球。让未解离的神经球静置1–2分钟。将解离后的细胞悬液转移至40 µm细胞筛上，以去除完全未解离的细胞团块。
13. 使用火焰抛光的大口径玻璃移液器重复步骤8.12，随后再使用小口径玻璃移液器重复一次。
14. 用2–5 ml CM/MM溶液冲洗细胞筛。
15. 混匀细胞悬液，并取样进行活力分析。
16. 用台盼蓝按适当稀释倍数稀释样品后进行计数。使用下方标准公式计算每毫升样本中的平均活细胞浓度，并计算总活细胞数。
    
17. 根据所需终浓度5.0 × 10⁶ 个细胞/ml，计算所需细胞冻存液的总体积。每支冻存管中加入1 ml细胞悬液。将冻存管转移至生物安全柜中。
18. 将细胞悬液在4 °C条件下，以200 × g离心5分钟（使用15 ml锥形管），以获得最佳回收率。若大规模冻存时使用50 ml锥形管，则离心速度和时间应提高至400 × g离心10分钟。
19. 用冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞密度为5.0 × 10⁶ 个细胞/ml。每支冻存管分装1 ml细胞悬液。为实现均匀分配，可先吸取6 ml悬液，分装5支冻存管（每管1 ml），将剩余1 ml悬液重新加回原细胞池中。重复此操作直至所有冻存管均被填满。
20. 在无菌条件下密封所有接种好的冻存管，并将其置于冰上5–10分钟。
21. 采用以下任一方法进行hNPCs的冷冻保存：异丙醇冻存盒
    1. 在所需数量的冻存盒中加入室温下的100%异丙醇（IPA）。
    2. 将从冰上取出的冻存管立即放入冻存盒中，并将冻存盒转移至-80 °C超低温冰箱中过夜。细胞在-80 °C下可稳定保存长达一周，但建议次日即将冻存管转移至液氮中进行长期保存。
       程序降温仪
    3. 将合适的冷冻程序上传至程序降温仪的软件系统中。示例程序见表3。图4展示了一条典型的hNPCs冷冻曲线。然而，具体程序会因不同型号的设备而异。标准降温速率应接近-1 °C/min，持续降温至-40 °C；此后可显著加快降温速率，至少降至-80 °C。

步骤	速率 (°C)	终止温度 (°C)	保持时间 (分 秒)	触发方式
1	--	--	5 分 0 秒	腔室
2	- 1.3	- 5	--	样品
3	--	--	1 分 0 秒	腔室
4	- 45	- 58	--	腔室
5	+ 10	- 26	--	腔室
6	+ 3	- 23	--	腔室
7	- 0.8	- 40	--	样品
8	- 10	- 100	--	腔室
9	- 35	- 160	--	腔室

表3. 在程序降温仪中冻存人神经前体细胞的步骤。建议在程序降温仪上进行人神经前体细胞冷冻保存的程序设置。

图4. 样品冷冻曲线。人神经前体细胞（hNPCs）在程序控速冷冻仪中的典型冷冻曲线。

4. 将冻存管从冰上转移至程序降温仪对应的提篮中。确保放入一支仅含细胞冻存液的冻存管，用于放置样品温度探针。将提篮放入冷冻室，并将探针插入该冻存管中。启动程序。
5. 当程序结束后，将冻存管转移至长期液氮储存环境中。

9. 解冻步骤

以下方案用于解冻低温保存的人神经前体细胞（hNPCs）。

1. 立即将冻存管从液氮储存中转移至干冰上。注意：冻存管可能存在裂纹或管盖松动，导致液氮渗入管内。当从深低温环境中取出时，管内液氮可能沸腾并立即引起冻存管爆炸。取出冻存管时务必穿戴适当的个人防护装备（PPE）。
2. 提前准备好以下所有试剂和耗材。一旦开始解冻过程，必须高效地完成后续操作。
   1. 将神经干细胞扩增培养基、MM、一个15 ml离心管、每个冻存管所需的1支2 ml和1支10 ml移液管，转移至生物安全柜（BSC）中。
   2. 每个冻存管至少需要9 ml神经干细胞扩增培养基和5 ml MM。如有需要，可准备更多培养基。
3. 每次仅解冻一支人源神经前体细胞（hNPCs）冻存管。将冻存的细胞从干冰上取出，立即放入洁净的37 °C水浴中，并持续轻轻搅动冻存管。密切观察管内冰块融化情况。当管内剩余约0.5 cm冰块时，用70%异丙醇喷洒并擦拭表面，然后转移至生物安全柜（BSC）中。
4. 用2 ml移液管将冻存管中的内容物转移至15 ml离心管中。向空冻存管中加入1 ml神经干细胞扩增培养基，冲洗后收集；再将8 ml神经干细胞扩增培养基缓慢逐滴加入已解冻的细胞悬液中，同时轻轻摇动离心管。此操作旨在降低渗透压休克的风险。
5. 将冻存管的冲洗液加入到9 ml细胞悬液中。将离心管置于冰上，并对所有剩余冻存管重复步骤9.4–9.5。
6. 将离心管在4 °C下以200 × g离心5分钟。离心期间，根据表4准备相应数量的培养瓶用于细胞接种。

小瓶数量	总接种体积 (ml)	培养瓶
1	5	T12.5
2	10	T25
3	15	T75
4	20	T75
5	25	T75
6	30	T175
7	35	T175
8	40	T175
8 +	--	培养瓶组合

表4. 根据冻存管数量选择的培养瓶规格。解冻后接种人神经前体细胞（hNPCs）时建议使用的培养液体积和培养瓶规格。

7. 根据表4，用适当体积的MM重悬并合并所有管中的细胞。充分混匀后取样进行活率计数。计数细节参见步骤8.15-8.16。标准接种密度范围为160,000–320,000个细胞/cm²。
8. 充分混匀细胞后，将细胞分装至培养瓶中。将培养瓶置于5% CO₂/37 °C/95%湿度的培养箱中。轻轻前后摇晃培养瓶，使细胞均匀分布。
9. 细胞将在24–48小时内形成球体。偶尔细胞会贴附于塑料表面，形成类似蜂窝状的集落分布。若出现此情况，应在培养3天后再冲洗使细胞脱落，以促进球体形成。每1–3天冲洗一次，直至无贴壁细胞残留。必要时可将细胞转移至新的培养瓶中。
10. 每3–4天更换25–75%的培养基（MM），直至细胞适合切割，通常为冻存复苏后7–14天。

结果

图5. 典型实验数据。A) 将第19代（p19）冻存的人神经前体细胞（hNPCs）解冻后，采用酶消化法进行贴壁单层扩增，其细胞数量随时间的变化情况，与通过切碎法传代的神经球进行比较。第0天表示细胞在第20代（p20）解冻的时间点。B) 切碎前神经球的代表性图像（10倍放大）。C) 切碎后神经球的代表性图像（10倍放大）。D) 在符合cGMP类似标准的操作流程中，用于描述培养基条件化程度的颜色样卡。E) ...

讨论

图6. 切割示意图。通过机械切割法在培养中扩增球形干细胞/前体细胞。

关键步骤

图6展示了切碎扩增方法的概览。图6中人神经前体细胞（hNPC）神经球的大小是传代神经球前需要观察的重要标准之一。尽管神经球大小存在较大差异，但至少应有30%的神经球直径大于300 µm。若神经球过小而不适合传代，可仅更换部分培养基（CM）为新鲜的维持培养基（MM），换液比例为25%-50%，并在1-4天后重新评估。若在神经球直径过小时即进行传...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
50 ml 烧杯	Fisherbrand	FB-100-50	多个制造商/供应商
II 级生物安全柜	Baker	SG-603A	4 英尺或 6 英尺型号。  推荐使用 6 英尺型号；多个制造商/供应商
双刃切片刀，用于样本制备	Personna	74-0002	多个制造商/供应商。  警告：锋利
无细胞冻存培养基	Sigma-Aldrich	C6295-50ML	含 DMSO，无血清
离心机，带 15 ml 摇摆桶转子	Eppendorf	5810 R	多个制造商/供应商
15 ml 锥形离心管	Fisherbrand	S50712	多个制造商/供应商
50 ml 锥形离心管	BD Falcon	352074	多个制造商/供应商
程序降温仪	Planer	Kryo 750	多个制造商/供应商
2 ml 冻存管	Corning	430488	多个制造商/供应商
通气培养瓶，T12.5	BD Falcon	353107	多个制造商/供应商
通气培养瓶，T25	BD Falcon	353081	多个制造商/供应商
通气培养瓶，T175	BD Falcon	353045	多个制造商/供应商
通气培养瓶，T75	BD Falcon	353110	多个制造商/供应商
滤器，0.22 µm，带接液杯，1 L	Millipore	SCGPU11RE	多个制造商/供应商
滤器，0.22 µm，带接液杯，150 ml	Millipore	SCGVU01RE	多个制造商/供应商
滤器，0.22 µm，带接液杯，500 ml	Millipore	SCGPU05RE	多个制造商/供应商
滤器，0.22 µm，带接液杯，50 ml	Millipore	SCGP00525	多个制造商/供应商
滤纸，直径 8.5 cm 圆形	Whatman/GE	1001-085
标准齿纹弯头镊子，18 cm	Fine Science Tools	11001-18
异丙醇冷冻室	Nalgene	5100-0001	"Mr. Frosty"
培养箱，37 °C/5% CO2	Forma	370 系列	多个制造商/供应商
血细胞计数板（相差型）	Hausser Scientific	1475	多个制造商/供应商
McIlwain 组织切片机	Lafayette Instruments	TC752-PD	需配备培养皿改装装置。   警告：  含运动部件及锋利刀片。
移液器，1–10 μl	Gilson	F144562	多个制造商/供应商
移液器，100–1,000 μl（起始套装）	Gilson	F167700	多个制造商/供应商
移液器，2–20 μl（起始套装）	Gilson	F167700	多个制造商/供应商
移液器，20–200 μl（起始套装）	Gilson	F167700	多个制造商/供应商
六角扳手，可高压灭菌，5/16"	Steritool	10302
巴斯德移液管，带棉塞	Fisherbrand	13-678-8B	多个制造商/供应商
玻璃培养皿，可高压灭菌	Corning	3160-100
手动移液器（Pipet Aid）	Drummond	4-000-101	多个制造商/供应商
垫片	McMaster-Carr	VARIABLE	多个制造商/供应商
带滤芯移液器吸头，10 μl，无菌	AvantGuard	AV10R-H	多个制造商/供应商
带滤芯移液器吸头，1,000 μl，无菌	AvantGuard	AV1000	多个制造商/供应商
带滤芯移液器吸头，20 μl，无菌	AvantGuard	AV20-H	多个制造商/供应商
带滤芯移液器吸头，200 μl，无菌	AvantGuard	AV200-H	多个制造商/供应商
一次性无菌移液管，全塑料包装，10 ml	Fisherbrand	13-676-10J	多个制造商/供应商
一次性无菌移液管，全塑料包装，2 ml	Fisherbrand	13-675-3C	多个制造商/供应商
一次性无菌移液管，全塑料包装，25 ml	Fisherbrand	13-676-10K	多个制造商/供应商
一次性无菌移液管，全塑料包装，5 ml	Fisherbrand	13-676-10H	多个制造商/供应商
灭菌袋，19 × 33 cm	Crosstex	SCL	多个制造商/供应商
细胞筛，40 µm	BD Falcon	352340
组织培养皿，60 mm	BD Falcon	351007
可互锁式四向试管架	Fisherbrand	03-448-17
水浴锅	Fisherbrand	S52602Q	多个制造商/供应商
神经前体细胞特异性处理试剂
神经干细胞扩增培养基（Stemline）	Sigma-Aldrich	S3194-500ML	必须使用 Stemline 品牌
重组人表皮生长因子（EGF）	Millipore	GF316	多个制造商/供应商
重组人白血病抑制因子（LIF）	Millipore	LIF1010	多个制造商/供应商
台盼蓝（0.4%）	Sigma-Aldrich	T8154-100ML	多个制造商/供应商
TrypLE Select（1×）	Life Technologies	12563-011