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方法文章

ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观

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DOI：

10.3791/51220

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2014年4月11日

 , 
1Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology

本文内容

摘要

通过结合天然染色质免疫沉淀与交联染色质免疫沉淀，并联合高分辨率质谱技术，ChroP 方法能够解析在功能各异的染色质区域中组蛋白修饰、组蛋白变体以及非组蛋白协同作用的复合蛋白质组结构。

摘要

染色质是一种高度动态的核蛋白复合物，由DNA和蛋白质组成，可调控多种依赖DNA的生命过程。特定区域的染色质结构与功能受到局部组蛋白翻译后修饰（hPTMs）和组蛋白变体、染色质结合蛋白（包括转录因子）以及DNA甲基化的调控。迄今为止，由于缺乏高效的实验方案来富集足够纯度和数量的特定功能区域染色质，从而限制了通过质谱法（MS）对其进行深入的蛋白质组学表征。本文介绍了一种新设计的染色质蛋白质组学策略，命名为ChroP（Chromatin Proteomics），该方法利用制备型染色质免疫沉淀技术分离特定的染色质区域，并通过质谱分析这些区域在组蛋白翻译后修饰、组蛋白变体及共结合的非组蛋白成分等方面的特征。本文以富含组蛋白H3第9位赖氨酸三甲基化标记的转录沉默异染色质区域为例，详细阐述了ChroP技术的建立及其在富集与分析中的应用。实验结果表明，ChroP 能够全面表征异染色质的蛋白质组，是一种强大的分析策略，有助于揭示染色质中不同蛋白质决定因子如何相互作用并协同作用，从而建立位点特异性的结构与功能构型。

引言

染色质是一种高度动态的核蛋白复合物，作为所有DNA介导过程的主要模板。核小体是染色质的基本重复单位，由包含两种分子的典型组蛋白H2A、H2B、H3和H4组成的蛋白质八聚体核心构成，其周围缠绕着147 bp的DNA1,2所有核心组蛋白均具有球状结构域和柔性末端 N-末端“尾部”向外突出于核小体之外。调控染色质结构与动态的主要机制之一是基于共价翻译后修饰（PTMs），这些修饰主要发生在组蛋白的N末端尾部 N组蛋白的末端3,4组蛋白修饰可通过改变染色质的高级结构，或改变组蛋白-DNA之间以及核小体之间的相互作用，从而调控DNA结合蛋白对DNA的可及性顺式 机制），或作为调控蛋白的停泊位点，无论是以单体形式存在，还是嵌入多聚复合物中。这些调控蛋白可通过多种方式发挥其功能：通过直接调节基因表达（即 TAF蛋白），或通过改变核小体定位（即 染色质重塑复合物）或通过修饰其他组蛋白残基（即 具有甲基转移酶或乙酰转移酶活性的蛋白质）（转 机制5观察到不同的翻译后修饰模式在特定染色质位点上聚集，由此提出了一个假说：不同位点上的修饰可能协同作用，形成一种分子编码，从而介导其下方DNA的功能状态。 "组蛋白密码假说" 多年来已获得广泛共识，但其实验验证因技术限制而进展缓慢6,7.

基于质谱（MS）的蛋白质组学已成为绘制组蛋白修饰模式和表征染色质结合蛋白的有力工具8。质谱通过检测肽段的实验质量与理论质量之间的特定质量差（Δmass）来识别修饰。在单个组蛋白水平上，质谱提供了一种无偏倚且全面的翻译后修饰（PTM）定位方法，能够检测新的修饰类型，并揭示修饰之间的相互作用9-14。

近年来，已开发出多种策略用于解析染色质的蛋白质组组成，包括对完整有丝分裂染色体的表征15可溶性hPTM结合蛋白的鉴定16-18 以及特异性染色质区域的分离与分析（即 端粒19,20然而，针对组蛋白PTMs、变体与染色质相关蛋白之间在特定基因座上的协同作用的研究仍不完善。本文介绍了一种名为ChroP的新方法（Chro早晨 P蛋白质组学)21我们已开发出一种高效表征功能各异染色质区域的方法。该方法基于染色质免疫沉淀（ChIP）技术——一种表观遗传学研究中广泛应用的成熟实验流程——并将其优化用于富集样本的质谱（MS）蛋白质组学分析。根据输入染色质的类型及质谱分析所针对的科学问题，我们建立了两种不同的实验流程：1）对未交联的天然染色质进行MNase消化后开展ChIP，用于纯化单核小体并解析其共定位的组蛋白翻译后修饰（N-ChroP）；2）对交联后经超声破碎的染色质进行ChIP，并结合基于SILAC的互作蛋白质组学策略，以全面鉴定共富集的染色质结合蛋白（X-ChroP）。本文以H3K9me3作为免疫沉淀的靶标，示范了N-ChroP与X-ChroP联合用于异染色质的富集与研究。ChroP技术可进一步拓展应用于染色质上不同区域的研究，或用于分析同一区域在功能状态转变过程中染色质组成的变化，从而为表观遗传学的多种研究提供新途径。

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方案

1. 细胞培养

  1. 天然染色质免疫沉淀（ChIP）的标准培养基
    1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素和10 mM HEPES（pH 7.5）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HeLa细胞。
  2. 交联ChIP的SILAC标记
    1. 在缺乏赖氨酸和精氨酸的SILAC DMEM培养基中培养HeLa细胞，补充10%透析胎牛血清（FBS）、1%谷氨酰胺、1%青霉素/链霉素、10 mM HEPES（pH 7.5），以及轻链L-赖氨酸（Lys 0）和L-精氨酸（Arg 0）或其重链对应物L-赖氨酸（Lys 8）和L-精氨酸（Arg 10）（材料 表），终浓度分别为73 mg/L和42 mg/L。
    2. 将细胞在SILAC培养基中培养至多八代，以确保同位素编码氨基酸完全掺入。每两天传代一次，当细胞密度达到1.0–1.5 × 106 个细胞/mL时，以3 × 105 个细胞/mL的浓度接种。
    3. 评估细胞在SILAC培养基中的生长情况和活力，以识别因SILAC培养基成分较差可能导致的任何生理变化；具体操作如下：
      1. 在标记期间每天在显微镜下观察细胞形态。
      2. 计数细胞，并绘制SILAC培养基与标准培养基中细胞生长曲线进行比较。

2. 天然染色质免疫沉淀（N-ChIP）

  1. 培养细胞的细胞核制备
    1. 使用 1-2 × 108 每次实验使用未标记的 HeLaS3 细胞。收集细胞，分装成每份 50 x 106 50 ml 中的细胞 离心管置于4℃、340 × g条件下离心10分钟 °C，用预冷的PBS洗涤。
    2. 将每个细胞沉淀重悬于 8 ml 裂解缓冲液中（表1）并在 4 ℃ 下孵育 10 分钟 °C 在旋转轮上。小心地将每种细胞裂解液加到蔗糖垫上（表1) 并在4℃下以3,270 × g离心20分钟，使用水平转子离心机 °C，以分离细胞核与细胞质。
    3. 弃去上清液，保留核沉淀，用预冷的PBS洗涤两次，每次洗涤后离心并弃去上清液。
  2. 微球菌核酸酶（MNase）消化（小规模）及消化后染色质的质量控制
    1. 将洗涤后的细胞核沉淀重悬于1 ml 消化缓冲液（表1）；分成两份，每份500 μl 并置于冰上。
    2. 取一份样品，用0.2%十二烷基硫酸钠（SDS）稀释200倍，于260 nm处测定其光密度（OD）。 注意：OD = 1 对应于约 50 μg/ml 的染色质 DNA。通常，从 2 x 10 开始8 细胞的OD值在40-60范围内。
    3. 取1%的细胞核，加入MNase酶，使其终浓度为0.005 U酶/μl 的细胞核，37℃孵育 °在不同时间间隔（0、10、20、40、60 分钟）于 C 条件下处理。
    4. 每个时间点收集4个 μ消化后的细胞核中加入1 mM EDTA以终止MNase反应，冰上保存。
    5. 使用PCR纯化试剂盒提取DNA样本，并用50 μL洗脱液洗脱 μl TE缓冲液（表1).
    6. 取 20 μ每份DNA样本中加入10 μL μ上样缓冲液（l Loading Buffer）表1) 将样品加入含溴化乙锭的1%（w/v）琼脂糖凝胶中电泳，以PCR Marker作为大小对照。
    7. 通过评估MNase孵育产生的染色质核小体梯状条带，检查消化效果。
    8. 根据样品中单核小体的丰度选择最佳消化时间。通常每0.005 U酶μl 的细胞核，MNase 消化的最佳时间为 60 分钟（图1B，左图). 注意：最佳的MNase消化浓度和时间可根据目标细胞类型及核小体片段的大小进行调整。
  3. 大规模/制备型MNase消化及可溶性染色质组分的回收
    1. 向每份等分试样（见2.2.1）中加入5 μ0.005 U 酶/的终浓度对应的 l MNaseμl 的细胞核；轻轻混匀并在 37℃ 孵育 °在60分钟内（或根据小规模测试结果确定的最佳时间间隔）进行C处理。
    2. 加入 1 mM EDTA 以终止反应，并置于冰上。在 4 °C 条件下，以 7,800 x g 离心力离心收集消化后的细胞核。 °C 离心 10 分钟。将上清液（S1 组分）转移至新管中，于 4 ℃ 保存 °C. 注意： S1 含有染色质的第一个可溶性组分，包含单核小体。加入蛋白酶抑制剂（表1).
    3. 小心地将沉淀重悬于 1 ml 透析缓冲液中（表1）并在4℃下透析过夜 °C（透析管截留分子量为3.5 kDa），置于3 L透析缓冲液中，持续轻柔搅拌。收集透析后的样品，在4℃下以7,800 × g离心10分钟 °C. 将上清液（S2 组分）转移至新的离心管中，4 ℃ 保存 °C. 注意： S2 组分包含二到七核小体，具体取决于 MNase 消化的程度。
  4. 免疫沉淀前染色质的质量控制
    1. 取相当于5的等分试样 μS1 和 S2 染色质组分各 g（通过 NanoDrop 系统测定 260 nm 处的 OD 值进行定量）。使用 PCR 纯化试剂盒提取 DNA，并用 50 μL 洗脱液洗脱 μl TE缓冲液（表1).
    2. 取20 μS1 和 S2 DNA 各 l，与 10 混合 μ上样缓冲液（l Loading Buffer）表1) 并上样至1% (w/v) 琼脂糖凝胶。通过观察核小体梯状条带的形态，评估MNase消化的质量和效率。 注意： 组分S1中单核小体高度富集，而组分S2主要含有多核小体（图1B，右侧面板).
  5. 染色质与抗体的孵育
    1. -20℃保存 °C 50 μ用于后续质谱分析的S1组分的量。
    2. 加入1体积的ChIP稀释缓冲液（表1) 加入到组分 S1 中。
    3. 加入针对目标 hPTM（或蛋白质）的抗体；在 4℃ 旋转摇床上孵育过夜 °C. 注意： 通常，使用 10 μ克至20 μ克抗体用于 2 x 108 细胞。抗体用量与起始细胞数量之间的最佳比例必须根据样本中作为诱饵的蛋白质翻译后修饰（hPTM）或蛋白质的丰度以及抗体的效率，逐案仔细设定。该优化需通过以下实验进行：
      1. 通过Western Blot或质谱法比较输入样本与流穿组分（FT，见2.7.2）中目标hPTM/蛋白质的量，以验证免疫沉淀是否显著富集了特定染色质区域。 注意： 当流穿液（FT）中至少有 50% 的 hPTM/目的蛋白被捕获时，通常即可达到该标准。图1C).
      2. 检查目标免疫沉淀蛋白在SDS-PAGE凝胶上是否可被检测到，以确保有足够量的样品可用于质谱分析。 注意： 凝胶上出现对应于四种核心组蛋白且具有正确化学计量比的条带，表明完整的核小体已被N-ChroP免疫沉淀图1D正确的化学计量比缺失实际上表明核小体发生了部分解体或去折叠。
    4. 同时，制备与蛋白G偶联的磁珠（参见2.6）。
  6. 蛋白G偶联磁珠的平衡与封闭
    1. 平衡100 μ含于封闭液中的蛋白G偶联磁珠悬液表1），洗涤三次，并在4℃下孵育过夜 °在旋转轮上。 注意： 根据磁珠的结合能力，使用 100 μ2-20 的浆液量 μ克抗体
    2. 用封闭液洗涤封闭后的磁珠一次，随后用ChIP稀释缓冲液洗涤两次（表1).
  7. 使用磁珠分离染色质
    1. 加入100 μ将阻断的珠子加入S1染色质样品中，在4℃下于旋转仪上孵育 °340 × g 离心 1 分钟，使样品从枪头盖内壁沉降至管底。置于磁力架上，使磁珠形成沉淀。
    2. 将上清液转移至新的Eppendorf管中。此为流穿液（FT），即未与抗体结合的染色质组分。
    3. 用洗涤缓冲液洗涤珠子四次（表1）在每次洗涤时逐步增加盐浓度（75、125 和 175 mM NaCl）。
    4. 为了洗脱免疫沉淀的染色质，将磁珠在30 μL洗脱液中孵育。 μl 的 LDS 上样缓冲液，补充 50 mM 二硫苏糖醇（DTT），在 70℃ 下孵育 5 分钟 °C. 将洗脱的蛋白质在4-12% Bis-Tris丙烯酰胺SDS-PAGE预制梯度凝胶上进行分离，并使用胶体考马斯亮蓝染色试剂盒对凝胶染色（图1D).

3. 交联染色质免疫沉淀（X-ChIP）

  1. 甲醛交联细胞
    1. 向SILAC标记的细胞中加入0.75%甲醛，短暂混匀，室温孵育10分钟。加入125 mM甘氨酸淬灭甲醛，室温孵育5分钟。
    2. 将细胞分为 5 x 107 分装；用预冷的PBS在4℃下以430 × g离心5分钟，洗涤3次 °C，并在每次洗涤后弃去上清液。最后一次洗涤后，弃去上清液，保留沉淀。注意：细胞交联后可在 -80℃ 保存 °C，若非立即使用。
  2. 细胞核制备
    1. 将每份细胞沉淀重悬于 10 ml 裂解缓冲液中（表1）。4 ℃孵育10分钟 °4℃下以430 × g离心5分钟，同时旋转。 °C. 弃去上清液；保留核沉淀。
    2. 将每个细胞核沉淀重悬于10 ml洗涤缓冲液中（表1在室温下于旋转仪上孵育10分钟。
    3. 在 4°C 下以 430 × g 离心 5 分钟 °C. 弃去上清液，收集沉淀。
    4. 将每个核沉淀重悬于 3 ml ChIP 孵育缓冲液中（表1）。保持在冰上。
  3. 染色质超声处理及质量控制
    1. 在冷却的Bioruptor中以200 W超声处理染色质（工作30秒，间歇1分钟），以片段化染色质。 注意：循环次数和超声处理时间间隔取决于细胞类型以及所需核小体片段的平均长度。通常需要30分钟的超声处理，以产生长度为300–500 bp的DNA片段，对应于二核小体和三核小体。片段大小的选择取决于所研究的染色质区域类型。
    2. 取总输入量的2%，于65℃孵育以逆转交联 °在 ChIP 孵育缓冲液中于 C 条件下孵育至少 1 小时。使用 PCR 纯化试剂盒提取 DNA，并用 50 μL 洗脱 μl TE缓冲液中重悬DNA，并上样至琼脂糖凝胶以检测染色质片段化。
  4. 染色质与抗体的孵育
    1. 加入1/10体积的10% Triton X-100至超声处理的染色质中，4℃下以12,000 × g离心10分钟 °C 以沉淀残渣。
    2. 节省 50 μ用于检测重细胞中标记氨基酸在细胞中的掺入水平及蛋白质谱分析的染色质输入量。
    3. 将所选抗体加入剩余的重链和轻链标记的超声处理染色质中，4℃孵育过夜 °C 在旋转轮上。在光通道中，还需加入过量倍数的可溶性肽。4℃下孵育过夜 °在旋转轮上。 注意事项： 最佳条件介于两者之间 μ抗体的用量及起始细胞材料需根据具体情况选择，如2.5.3节所述。可溶性肽相对于抗体的最优摩尔过量倍数必须根据具体情况仔细滴定。
  5. 使用磁珠分离染色质
    1. 按照2.6中所述步骤，使用ChIP孵育缓冲液对蛋白G偶联磁珠进行平衡和封闭。
    2. 加入100 μ将阻断的珠子加入染色质样品中，在4℃下于旋转仪上孵育3小时 °C. 以 340 × g 离心 1 分钟，使样品从枪头盖内壁沉降至管底。置于磁力架上使磁珠形成沉淀。上清液为流穿液（FT），含有未结合的核小体。用洗涤缓冲液将磁珠洗涤四次（表1随着盐浓度的增加进行洗涤（分别用150 mM和300 mM NaCl各洗涤两次）。
    3. 将珠子在 30 μl SDS-PAGE 上样缓冲液（表1）并在 95 ℃ 下持续 25 分钟 °C 以洗脱并解除免疫沉淀蛋白的交联。使用 4-12% Bis-Tris 聚丙烯酰胺 SDS-PAGE 预制胶分离蛋白质（图3D).

质谱分析前的样品制备

  1. 来自 N-ChIP 富集组蛋白的凝胶内消化
    注意：在蛋白质消化和肽段提取步骤中，需尽量减少角蛋白污染，以免干扰 LC-MS/MS 分析，具体方法如前所述22,23。
    1. 切取对应于核心组蛋白条带的凝胶片（图 1D）。用含 50% 乙腈（ACN）的 ddH2O 脱色凝胶块，并交替使用 100% ACN 使凝胶收缩。重复操作直至凝胶块完全脱色，并在真空离心浓缩仪中干燥。
    2. 加入 D6-乙酸酐与 1 M 碳酸氢铵（NH4HCO3）的 1:9（v/v）混合液（通常终体积为 60–100 μl）以及 3 μl 醋酸钠（CH3COONa）作为催化剂。37 °C 强烈振荡孵育 3 小时。注意：反应体系组装后的最初几分钟内样品可能产生气泡：操作时应谨慎，定期打开管盖释放产生的气体。
    3. 用 NH4HCO3 多次冲洗凝胶块，并交替使用浓度递增的 ACN（从 50% 至 100%），以彻底去除 D6-乙酸酐残留物。
    4. 用 100% ACN 收缩凝胶块，并在真空离心浓缩仪中干燥以确保完全脱水。用冰上预冷的含 100 ng/μl 胰蛋白酶的 50 mM NH4HCO3 溶液重悬凝胶块，37 °C 过夜孵育。注意：利用氘代乙酸酐对赖氨酸进行化学修饰并结合胰蛋白酶消化，可在凝胶内产生类似“Arg-C”的组蛋白消化模式21,24。
    5. 弃去多余溶液，加入适量 50 mM NH4HCO3 溶液完全覆盖凝胶块，37 °C 过夜孵育。
    6. 将可溶性消化肽段收集至新的离心管中。冻干肽段，重悬于 0.5% 乙酸/0.1% 三氟乙酸（TFA）溶液中。使用自制反相 C18/碳“夹心”和阳离子交换色谱（SCX）微柱（StageTip）对肽段进行脱盐和浓缩25。
    7. 通过将含有固定化 C18/碳“夹心”和 SCX 微珠的聚四氟乙烯（Teflon）网盘装入 200 μl 吸头中制备 StageTip 微柱。通过将 C18 微柱加载在装有碳滤膜的第二支吸头上获得“夹心”结构。注意：极短的肽段无法被 C18 滤膜保留，会进入穿流液，可直接加载至碳 Tip，通常可被其捕获。SCX StageTips 可富集某些反相色谱保留效率低的特定肽段，例如 H3(3-8) 肽段。
    8. 将 50% 肽段加载至 C18/碳“夹心 StageTip”，另 50% 加载至 SCX StageTips。使用 80% ACN/0.5% 乙酸从 C18/碳 Tip 洗脱肽段，使用 5% 氢氧化铵（NH4OH）/30% 甲醇从 SCX Tip 洗脱肽段。冻干后，将肽段重悬于 0.1% 甲酸（FA）中，进行 LC-MS/MS 分析。
  2. 免疫纯化蛋白的凝胶内消化
    蛋白的凝胶内消化按先前所述方法进行22，略有修改。
    1. 将每条泳道切成十个片段（图 3D），并将每个片段切成约 1 mm3 的小块。用 50 mM NH4HCO3/50% 乙醇溶液对凝胶块进行脱色，并加入无水乙醇使凝胶收缩。重复操作直至凝胶完全脱色。
    2. 向凝胶块中加入还原缓冲液（表 1），56 °C 孵育 1 小时，随后加入烷基化缓冲液（表 1），室温避光孵育 45 分钟。用真空离心浓缩仪清洗并干燥凝胶块。
    3. 用冰上预冷的含 12.5 ng/μl 胰蛋白酶的 50 mM NH4HCO3 溶液重悬凝胶块，冰上孵育至凝胶完全重水化。去除多余的胰蛋白酶。
    4. 加入 50 mM NH4HCO3 溶液完全覆盖凝胶块，37 °C 过夜孵育。
    5. 收集液体部分。向凝胶块中加入提取缓冲液（表 1），室温剧烈振荡孵育 10 分钟。重复两次。
    6. 将凝胶块在 ACN 中剧烈振荡孵育 10 分钟。重复两次，并合并所有上清液。
    7. 冻干肽段，将干燥后的肽段重悬于 0.5% 乙酸/0.1% TFA 溶液中。
    8. 如文献所述26,27，使用反相 C18 StageTip 对肽段进行脱盐和浓缩。
    9. 使用 80% ACN/0.5% 乙酸从 C18 StageTip 洗脱肽段。通过真空离心浓缩仪蒸发去除有机溶剂，并在准备进行质谱分析时将肽段重悬于 0.1% FA 溶液中（通常为 5–10 µl）。

5. 液相色谱-质谱分析

  1. 液相色谱分析
    1. 使用反相C18、3 μm树脂在甲醇中，通过炸弹式装柱装置在15 cm长的熔融石英喷嘴（内径75 μm，外径350 μm）中装填分析柱，采用恒定氦气压力（50 bar），方法如前所述28。
    2. 将装填好的喷嘴（C18反相柱）直接连接至HPLC六通阀的出口，使用一段20 cm长（内径25 μm）的熔融石英管连接，不使用预柱或分流装置。
    3. 以500 nl/min的流速将消化后的肽段加载至C18反相柱，流动相A为ddH2O中含0.1%甲酸和5%乙腈。
    4. 样品加载后，采用以下梯度分离肽段：
      1. 以250 nl/min流速在90分钟内从0–40%流动相B（ddH2O中含0.1%甲酸和99%乙腈）进行梯度洗脱，随后在10分钟内从40–60%，再在5分钟内从60–80%，用于洗脱组蛋白来源的肽段（见2）。
      2. 以250 nl/min流速在120分钟内从0–36%流动相B进行梯度洗脱，随后在10分钟内从36–60%，再在5分钟内从60–80%，用于洗脱免疫纯化蛋白来源的肽段（见3）。
  2. 使用LTQ-FT-ICR-Ultra质谱仪进行质谱分析
    1. 采用数据依赖采集（DDA）模式，自动在MS和MS/MS采集之间切换。全扫描MS谱图通常在m/z 200–1,650范围内采集，分辨率R = 100,000（在400 m/z处）。选择信号强度最高的前五个离子（Top5），在线性离子阱中通过碰撞诱导解离（CID）进行碎裂，目标值设为5,000。
    2. 使用表2中列出的参数设置“调谐”采集文件。
    3. 按照表2中列出的标准设置进行采集参数设定。

6. 数据分析

  1. 染色质结构域中共富集组蛋白修饰的无标记定量分析
    1. 使用 Raw2msm 软件（版本 1.10）将获取的原始文件转换为 mgf 文件29。
    2. 使用 Mascot Daemon（版本 2.2.2）搜索组蛋白修饰，并设置 表3 中描述的参数。
    3. 在 Mascot 输出的肽段列表中，剔除得分低于 15 或含有超过 5 个假定翻译后修饰（PTMs）的肽段29。注意： 对于每个唯一的肽段 ID，选择 Mascot 得分最高的肽段，并过滤掉所有其他具有相同 ID 的冗余肽段。
    4. 基于 m/z 值，使用 QualBrowser 为每种对应修饰肽段的前体离子构建提取离子色谱图（XIC），并计算每个峰的曲线下面积（AUC）（图2A）。
    5. 使用 QualBrowser 目视检查 MS/MS 谱图，验证每个鉴定到的含修饰肽段（图2B）。
    6. 计算每种修饰肽段的相对丰度，并计算各修饰在染色质免疫沉淀（ChIP）样品中的相对富集程度。注意： 相对丰度定义为特定修饰肽段的 AUC 与其所有修饰和未修饰形式肽段 AUC 总和的比值；而相对富集度则定义为该修饰在 ChIP 样品中的相对丰度与 Input 样品中相对丰度的比值（图2C）。
  2. 染色质结构域中共关联蛋白的定量蛋白质组学分析
    1. 使用 MaxQuant 软件包（http://www.maxquant.org/）进行蛋白的鉴定与定量30。通过 AndromedaConfig.exe31 配置内置搜索引擎“Andromeda”，并设置 表3 中列出的搜索参数。
  3. 掺入率检测
    1. 使用 MaxQuant 软件，按以下步骤估算重同位素标记染色质 Input 样品中重氨基酸在蛋白质中的掺入程度：
      1. 参数设置同 6.2 节，但关闭“重新定量”（re-quantify）选项。
      2. 对非冗余肽段的比值应用以下公式计算掺入百分比：掺入率 (%) = 比值 (H/L) / [比值 (H/L) + 1] × 100（图3B）。注意： 仅当掺入率 >95% 时方可接受。

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结果

染色质免疫沉淀是一种强大的技术，用于分析蛋白质或组蛋白修饰在基因组上的定位。在蛋白质组学的等效应用中，染色质免疫沉淀（ChIP）后接基于质谱（MS）的蛋白质组学分析，以定性和定量地鉴定与作为“诱饵”的目标修饰或蛋白质共同免疫沉淀的组蛋白翻译后修饰（hPTMs）、组蛋白变体以及染色质结合蛋白。在如图1A所示的N-ChroP方法中，采用天然染色质免疫沉淀（native ChIP）作为起始材料，其中染色质经MNase酶解（图1B），用于从总染色质中纯化出特定的功能结构域。将富含单核小体的酶解染色质与特异性抗体孵育，然后通过SDS-PAGE分离免疫纯化的蛋白质。在本示例中，选用沉默染色质的标志物H3K9me332,33来建立该方法。这一选择基于以下事实：H3K9me3的功能角色及其部分相互作用蛋白已有充分描述。此外，已有针对ChIP优化的高特异性且高效的抗体可供使用34，这一点也通过考马斯亮蓝凝胶的目视检查得到证实，在凝胶中完整核小体的核心组蛋白以正确的化学计量比被富集，并达到适合质谱分析的适量水平（图1D

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讨论

我们近期描述了一种名为ChroP的定量策略，用于大规模表征染色质的蛋白质组分。ChroP结合了表观遗传学领域中两种互补的方法——ChIP和质谱（MS），充分利用了二者的优势并克服了各自的局限性。与深度测序联用的ChIP（ChIP-Seq）能够在少数核小体分辨率下实现组蛋白修饰的全基因组定位35。尽管基于抗体的检测方法具有较高的灵敏度，但其在区分相似修饰以及解析组蛋白密码的组合特性方面存在局限性36。另一方面，质谱能够对组蛋白翻译后修饰（hPTMs）进行全面且无偏倚的分析，无论单个修饰还是组合修饰均可检测9，但迄今为止该技术主要用于整体染色质的分析，因而缺乏关于位点特异性翻译后修饰模式的信息。我们采用一种改良的ChIP方法来分离功能上不同的染色质区域，并结合质谱技术对组蛋白PTM模式以及特异性共富集的非组蛋白进行表征。

通过使用N-ChroP，对与H3K9me3共定位的组蛋白翻译后修饰（hPTMs）进行分析，结果显示与沉默染色质相关的标记物显著富集，而与活性染色质相关的修饰则显著减少。这些结果与先前研究37<...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

本研究最初发表于《分子与细胞蛋白质组学》。Soldi M. 和 Bonaldi T. 关于染色质功能结构域的蛋白质组学研究揭示了不同异染色质组分之间的新型协同作用，《MCP》。2013；12：64-80。© 美国生物化学与分子生物学学会。我们感谢Roberta Noberini（意大利理工学院和IEO，意大利）对本文稿的审阅。TB的研究工作得到了Giovanni Armenise-Harvard基金会职业发展项目、意大利癌症研究协会以及意大利卫生部资助项目的资助。MS的研究工作得到了FIRC博士后奖学金的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM LonzaBE12-614F
FBSInvitrogen10270-106
SILAC DMEMM-MedicalFA30E15086
透析FBSInvitrogen26400-044
赖氨酸0（12C6 14N2 L-赖氨酸）Sigma AldrichL8662
精氨酸0（12C6 14N4 L-精氨酸）Sigma AldrichA6969
赖氨酸8（13C6 15N2 L-赖氨酸）Sigma Aldrich68041
精氨酸10（13C6 15N4 L-精氨酸）Sigma Aldrich608033
微球菌核酸酶Roche10 107 921 001
完全型无EDTA蛋白酶抑制剂混合片剂Roche04 693 132 001
Spectra/Por 3透析管，3.5K分子量截留值，18 mm平展宽度，50英尺长度Spectrumlabs132720
QIAquick PCR纯化试剂盒QIAGEN28104
抗组蛋白H3三甲基化K9（ChIP级）Abcamab8898
组蛋白H3三甲基化K9肽段 Abcamab1773
Dynabeads Protein GInvitrogen100.04D
NuPAGE Novex 4-12%                            Bis-Tris凝胶 InvitrogenNP0335BOX
胶体蓝染色试剂盒InvitrogenLC6025
LDS上样缓冲液InvitrogenNP0007
甲醛Sigma AldrichF8775
乙酸酐-d6Sigma Aldrich175641-1G
[header]
甲酸Sigma Aldrich94318-50ML-F
碘乙酰胺 ≥99%（HPLC），结晶态Sigma AldrichI6125
DL-二硫苏糖醇Sigma Aldrich43815
测序级修饰胰蛋白酶，冷冻保存，100 μg（5 × 20 μg）PromegaV5113
Nanospray OD 360μm × ID 75μm，尖端ID 8 μm，未涂层 Pk 5Microcolumn SrlFS360-75-8-N-5-C15
ReproSil-Pur 120 C18-AQ，3 µm   15% CDr. Maisch GmbHr13.aq.
碳萃取盘，47 mmAgilent Technologies12145040
阳离子萃取盘Agilent Technologies66889-U

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染色质蛋白质组学染色质免疫沉淀质谱组蛋白修饰染色质免疫沉淀细胞核制备酶解消化SDS-PAGE分析液相色谱质谱分析稳定同位素标记
ChroP 方法结合染色质免疫沉淀与质谱技术解析染色质位点特异性蛋白质组景观
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