在此，我们介绍一种快速且准确测量飞行性能的方法 果蝇，实现高通量筛选。
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本文内容
摘要
摘要
Drosophila 已被证明是研究行为（包括飞行行为）的有用模式系统。最初的飞行测试方法是将果蝇投入涂油的带刻度圆柱管中；通过测量果蝇下落多高后产生足够推力并接触到管壁，来评估其飞行能力。本文描述了一种经过改进的飞行测试装置，具有四项主要改进。第一，我们增加了一个"下落管"，以确保在不同实验中所有果蝇以相似的速度进入飞行圆柱管，从而消除操作者之间的差异。第二，我们用可拆卸的塑料片替代了油涂层，塑料片表面涂有Tangle-Trap胶——一种专为捕捉活体昆虫设计的粘性物质。第三，我们采用更长的圆柱管，以更精确地区分果蝇的飞行能力。第四，我们使用数码相机和图像分析软件，实现飞行表现评分的自动化。这些改进使得果蝇飞行行为能够被快速、定量地评估，适用于大规模数据集和大规模遗传筛选研究。
引言
Drosophila 长期以来被用于研究行为的遗传基础1，研究人员已设计出多种方法来分析不同类型的行为2-6。果蝇在提供神经肌肉疾病的有效模型方面尤其具有价值7。用于研究运动行为的一种常见检测方法是飞行能力检测。原始的飞行检测装置可用于鉴定飞行缺陷型突变体并对飞行能力进行定量评估1，但它存在若干局限性，限制了其在高通量筛选中的应用：使用涂油的圆筒操作繁琐且不整洁；某些设计特征，例如圆筒长度以及将果蝇以不一致的力度引入管中，会降低定量准确性；此外，从检测装置中回收活体果蝇也较为困难。为了克服这些局限性，我们对飞行检测装置进行了多项改进。我们增加了一个"下落管"来引入果蝇，以消除不同实验之间及操作者之间的变异。我们采用可拆卸的丙烯酸板，并在其表面涂覆粘性材料，以便更方便地清洁并单独回收果蝇。我们延长了飞行管的长度，以提高定量的准确性和可靠性。最后，我们使用数码相机和成像软件来计算果蝇的着落高度。我们认为，这些改进将对任何希望开展大规模遗传筛选以研究飞行能力缺陷的实验室具有重要帮助。
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方案
1. 组装飞行测试仪
- 使用链条夹具将飞行圆筒固定在1号铁架台上。（圆筒下方需预留约3 cm空间用于放置称量皿。）
（注：我们使用的飞行圆筒长90 cm，直径为13.5 cm。） - 在飞行圆筒下方插入带有薄层矿物油的称量皿。
- 使用环形夹具和爪形夹具将漏斗固定在2号铁架台上。调节漏斗高度，使其底部与飞行圆筒顶部齐平。（注：漏斗尖端直径必须小于放入落管中的小瓶外径，以防止小瓶掉落。）
- 将落管插入漏斗顶部，并用爪形夹具固定。
（注：我们使用的落管长25 cm。从该高度释放含果蝇的小瓶，可使所有果蝇以一致且均匀的力度弹出。落管内径应略大于小瓶外径，以确保小瓶能自由下落。） - 将聚丙烯酰胺板裁剪至合适尺寸。（注：为便于插入和取出，板的宽度应略小于飞行圆筒的内周长。）
- 在板上涂抹一层薄薄的Tangle-Trap粘虫剂，使用前静置1小时。（注：板的顶部和底部需留出足够未涂覆区域（约 3 cm），以便抓握并进行插入或取出操作。）
- 将聚丙烯酰胺板插入飞行圆筒中。
- 使用松木支撑支架组装相机轨道。（注：确保轨道底部能够支撑相机且不遮挡镜头。参见图1B。）
- 安装止动器并旋紧固定。（注：止动器的位置应使相机在全景模式下能够完整拍摄到整个塑料板。）
2. 运行实验
- 收集待测果蝇样品管。为获得最佳结果，每管使用不超过 20 只果蝇。
- 轻轻敲击样品管，使果蝇沉至管底，拔去管塞，然后将样品管插入落管装置并释放样品管。
（注意：样品管沿落管下落，直至接触下方狭窄的漏斗开口。当样品管撞击漏斗时，果蝇被弹射进入飞行筒内。） - 提起落管装置，取出空样品管。
（注意：同一聚丙烯酰胺凝胶板上可检测同一实验组的多个样品管。我们发现，单块凝胶板上可轻松检测并成像最多 200 只果蝇（即 10 个样品管，每管 20 只）。） - 取下塑料板，并将其放置在平坦的白色表面上。
（注意：若实验台表面颜色较深，可使用白色海报纸作为替代。） - 在塑料板上方组装相机导轨。相机应足够高，以确保视野中同时包含塑料板的顶部和底部。
- 沿导轨滑动相机，同时按住 "capture" 按钮，以获取全景图像。
- 每次实验重复时，可手动统计落入油区的果蝇数量。
- 对某一实验中的所有条件重复步骤 2.2–2.7。每次重复后可将果蝇从塑料板上清除。或者，也可使用多块塑料板，每次重复使用新的塑料板。
3. 数据收集
- 使用 ImageJ 软件打开图像文件。
- 如有必要，裁剪图像，仅保留着陆表面区域。（即涂有 Tangle-Trap 的区域）
- 将图像转换为 8 位灰度图像。
- 创建 "阈值" 以滤除白色背景。
（图像 → 调整 → 阈值） - 使用 "分析颗粒" 菜单设置参数，以识别每只果蝇。
（分析 → 分析颗粒）定义用于识别颗粒的参数。在我们的实验条件下，采用面积为 5–90 像素2、圆度为 0.4–1.0 的参数可准确识别所有样本。 - 利用每个颗粒生成的坐标列表，测量每只果蝇的位置。将像素的 x 坐标转换为厘米，以计算着陆高度。
- 将表格导入电子表格软件（如 Microsoft Excel）。
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结果
图1A展示了更新后的飞行测试仪组件的示意图。图1B展示了轨道设计，可使相机在不遮挡视野的情况下拍摄全景图像。代表性结果见图2，其中将已知存在飞行缺陷的slowpoke突变果蝇与野生型Canton-S果蝇的飞行表现进行了比较8-10。对照组果蝇 consistently 落在圆柱体顶部附近，个体间分布非常集中，平均着陆高度为73±2.0 cm。相比之下，slowpoke果蝇的着陆分布范围更广，且着陆位置显著更低，平均为44±4.1 cm。所有果蝇均为3日龄，于室温（23 °C）条件下培养。
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讨论
利用此处所述方法，我们能够快速评估大量黑腹果蝇（Drosophila）突变体的飞行能力，效率显著高于以往。在实验中，我们通常将雄性和雌性分开，并以低密度（每管少于20只果蝇）培养，以减少可能造成翅膀损伤的攻击行为。另一个重要考虑因素是需适当控制因遗传背景差异而导致的飞行能力差异。我们还发现，在飞行测试前，让果蝇至少经过24小时 的恢复期以从二氧化碳麻醉中恢复，有助于提高实验准确性。 alternatively，可通过低温（4 °C）暴露对果蝇进行麻醉，从而实现更快恢复，且不会对行为产生潜在影响。
本方案中的限速步骤是在两次试验之间将果蝇从塑料片上移除。提高效率的一种方法是同时使用大量塑料片，在使用后将其放置一旁，并在数据采集结束后统一清洗。掉到底部的果蝇需要手动计数，因为它们不会附着在塑料片上。尽管如此，这种方法仍比手动计算着陆高度更为简便。是否需要重新在每张塑料片上涂抹Tangle-Trap取决于涂层的厚度。根据我们的经验，单张塑料片在需要重新涂覆前可维持一个月。
与矿物油相比，使用Tangle-...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院基金F32 NS078958（DTB）和R01 AG033620（BG）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 刮刀 | Home Depot | 630147 | www.homedepot.com |
| 松木背板条（2个） | Home Depot | 156469 | www.homedepot.com |
| 衬条板 | Home Depot | 164704 | www.homedepot.com |
| 缠绕式昆虫捕获涂层 | BioControl Network | 268941 | www.biconet.com |
| 笔记本电脑 | Apple | www.apple.com/mac/ | |
| 矿物油 | Fisher Scientific | BP26291 | www.fishersci.com |
| 白色海报纸板 | Staples | 247403 | www.staples.com |
| 聚苯乙烯称量皿 | Fisher Scientific | S67091A | www.fishersci.com |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| 数码相机 | Sony | DSC-TX7 | www.store.sony.com |
| 精细镊子 | Fine Science Tools | www.finescience.com | |
| 聚碳酸酯圆筒（落管） | McMaster-Carr | 8585K62 | www.mcmaster.com |
| 飞行圆筒（丙烯酸材质） | McMaster-Carr | 8486K943 | www.mcmaster.com |
| 聚碳酸酯板材 | McMaster-Carr | 85585K25 | www.mcmaster.com |
| 铁架台（2个） | Fisher Scientific | S47808 | www.fishersci.com |
| 环形支架 | Fisher Scientific | S47791 | www.fishersci.com |
| 三爪万能夹（2个） | Fisher Scientific | 05-769-7Q | www.fishersci.com |
| 漏斗 | Fisher Scientific | 10-500-3 | www.fishersci.com |
| 链条夹（2个） | VWR | 21573-275 | www.vwr.com |
| 玻璃小瓶 | VWR | 66020-198 | www.vwr.com |
参考文献
- Benzer, S. Genetic dissection of behavior. Sci. Am. 229, 24-37 (1973).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J. Vis. Exp. , e2504(2011).
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- Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. Studying aggression in Drosophila (fruit flies). J. Vis. Exp. , e155(2007).
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