利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达 关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术

摘要

本研究介绍了一种利用BioRad基因枪检测的植物亚细胞器选择性靶向新方法。

摘要

为了将单一蛋白质靶向多个亚细胞器，植物通常会复制相关基因，并利用包括不同启动子和/或信号序列在内的复杂调控策略分别表达每个基因。对于希望将酶靶向特定细胞器的代谢工程和合成生物学研究人员而言，面临一个挑战：若一种蛋白质需要定位到多个细胞器，研究人员必须多次克隆同一基因。本研究提出了一种解决方案：利用mRNA的可变剪接技术。该技术借助已知的叶绿体和过氧化物酶体靶向序列，将其整合到一条可发生可变剪接的mRNA中。部分剪接变体被运送至叶绿体，部分至过氧化物酶体，另一部分则留在细胞质中。本文设计了基于可变剪接的多细胞器靶向系统。在此研究中，通过一系列合理设计的5’端mRNA标签，预期实现GFP在叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中的表达。这些标签有望在异源基因需要在多个亚细胞器中表达时，减少所需的克隆工作量。这些载体在前期研究中已设计完成¹¹，并采用吉布森组装（Gibson assembly）方法进行克隆，该方法是一种无需限制性内切酶的连接无关克隆技术。所得质粒通过改良的基因枪法导入本氏烟草（Nicotiana benthamiana）表皮叶片细胞中。最后，利用共聚焦显微镜观察转化后的叶片。

引言

本研究是一项代谢工程/合成生物学项目，通过单个DNA构建体，使植物细胞在多个细胞器中表达报告蛋白。

将蛋白质靶向多个位置的一种方法是克隆多个基因拷贝，每个拷贝包含不同的定位肽。每个拷贝必须通过连续的重复转化引入，或者 alternatively，通过单个转化子的回交实现¹。这种方法需要额外的克隆步骤，并且每个末端只能连接一个定位标签，因而存在局限性。

另一种使蛋白质定位于多个位置的方法是通过选择性剪接^2–5。RNA从单个基因转录而来，但转录本的不同拷贝在细胞内可能以多种方式被差异性加工。这可能导致细胞中由同一基因产生多种信使RNA。这些不同的信使RNA可编码同一蛋白质的不同亚型，或在发生阅读框移位的情况下，编码完全不同的蛋白质。尽管选择性剪接已在文献中被描述多年，但其作用机制以及保守的供体和受体剪接位点直到最近才逐渐被阐明⁶。随着这些剪接位点的特征被更清晰地解析，也为相关工程化操作带来了新的机遇。

植物代谢工程领域在将蛋白表达于多个细胞器时面临一项挑战。当需要将一种蛋白靶向定位至多个细胞器时，研究人员必须对同一基因进行多次克隆，每次均需连接不同的信号序列，以引导其进入目标细胞器。对于一个需靶向三个细胞器的单个基因，这相当于需要构建三个基因；而对于一个包含六个基因的代谢通路，则需要构建多达18个基因，克隆工作量显著增加。将多个定位序列整合到一个可选择性剪接的单一基因中，可显著减少这一工作量。例如，对光呼吸^7,8和类异戊二烯合成^9,10途径的重新设计均涉及叶绿体和过氧化物酶体。在本研究中，我们利用了先前报道的天然Arabidopsis thaliana系统中存在的剪接位点⁶。我们基于理性设计改造了mRNA序列，在保留天然剪接位点不变的前提下，将编码叶绿体或过氧化物酶体靶向标签的序列插入到可变剪接的内含子中（图1）。最终表达的蛋白是否带有标签，取决于编码该蛋白的前体mRNA是否将相应内含子切除（图1g和图1h）。有关本研究中所用构建体设计的更多细节，请参见配套文章¹¹。

由于这仍然是一个重要的克隆工作，因此在构建过程中采用了吉布森组装（Gibson assembly）这一新型DNA构建克隆方法。吉布森方法可用于任意序列的克隆，不受限制性酶切位点的限制（图2）^12–14。该方法利用特定的酶混合物，实现一步法、等温条件下的DNA片段组装。在此方法中，设计多个双链线性DNA片段，使其具有约50 bp的重叠序列。吉布森组装酶混合物对线性DNA片段进行部分消化，暴露出同源的单链区域。这些部分单链序列在反应体系中重新退火，从而实现快速、一步完成、无需连接酶、且不受序列限制的亚克隆反应。

本研究描述了：1）针对植物叶绿体、过氧化物酶体和细胞质中表达的可变剪接结构的合理设计；2）利用无需连接的吉布森组装新方法进行克隆；3）通过基因枪将构建体递送至烟草叶片细胞；以及 4）通过绿色荧光蛋白（GFP）和共聚焦显微镜观察到的细胞器靶向结果。

方案

1. 用于多个细胞器靶向的可变剪接序列的设计

1. 确定目标蛋白的最终表达位点。本研究旨在将蛋白靶向至叶绿体、过氧化物酶体和细胞质。
2. 查阅文献，筛选已知可将蛋白靶向至目标细胞器的蛋白和DNA序列。本研究中选用的序列包括：来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）L-异天冬氨酸甲基转移酶的叶绿体靶向序列^6,15，以及来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）转甲状腺素蛋白样S-尿囊素合酶的过氧化物酶体靶向序列^16,17。
3. 设计一种可变剪接策略，以确保目标蛋白被正确靶向至相应细胞器。本研究采用在天然拟南芥（Arabidopsis）系统中观察到的剪接位点⁶，对mRNA序列进行重新设计，在保留天然剪接位点的基础上，将编码叶绿体或过氧化物酶体靶向标签的序列插入到可变剪接的内含子中（图1）。

2. DNA片段的Gibson组装

另见图2。

Gibson 组装法依赖于预混液中的多种酶发挥作用，其作用包括：1）部分消化双链 DNA 的末端以产生单链，以及 2）使相邻 DNA 片段的互补碱基配对并退火。该方法可实现 DNA 片段的克隆，且不受限制性酶切位点的限制。

1. 选择DNA质粒构建体中各元件的排列顺序。以TriTag-1为例，其包含以下元件：a) 质粒载体（pORE，含有在植物中已知可表达的GFP构建体、卡那霉素抗性标记以及用于大肠杆菌和农杆菌的复制起点） E. coli 和 根癌农杆菌 宿主）、b）启动子序列（P_ENTCUP2，已在植物中被证明为组成型表达），c）叶绿体靶向序列（CTS），c）过氧化物酶体靶向序列（PTS），以及d）如前所述的一系列剪接位点⁶.
2. 逐碱基设计构建体 计算机模拟 设计软件。ApE 是一款适用于此项工作的开源免费软件包。
   注意：TriTag-1 的顺序为：质粒载体、启动子、ATG、剪接供体位点、叶绿体靶向序列、剪接供体位点、中性位点、剪接受体位点、过氧化物酶体靶向序列、剪接受体位点、GFP，以上均包含于质粒载体中。
   1. 设计 计算机模拟 DNA 重组构建时，设计 PCR 引物使每段片段之间具有 50 bp 的重叠区域。可直接将 50 bp 的重叠序列用作引物，正向和反向各 25 bp。
      1. 务必记录每段序列片段的来源：它是需要培养并进行质粒小提的质粒；可用作PCR模板的线性序列；还是需要通过商业途径合成的序列？多家公司提供低成本的DNA片段合成服务 <500 bp。在这种情况下，TriTag 本身为 437 bp，因此直接商业订购更为有利。
      2. 若将所有片段通过PCR扩增并从其模板DNA中纯化出来，将获得最佳结果。将抗性标记作为切割位点，可将这段较大的DNA分为两个较小的模板，更易于进行PCR扩增。
      3. 限制性内切酶 DpnI 可切割甲基化的 DNA。  如果PCR模板来自质粒小量抽提产物 大肠杆菌， DpnI 处理将去除污染的模板 DNA。
3. 将所有DNA序列分别纯化，并洗脱于水、TE或Buffer EB中。
   1. pORE 载体部分 1，约 3,000 bp（绿色箭头）。经 PCR 扩增并用 DpnI 处理。
   2. pORE 载体第二部分，约 3,000 bp（黑色箭头）。经 PCR 扩增并用 DpnI 处理。
   3. TriTag 插入片段，437 bp（蓝色箭头）。商业订购。用 ddH₂O 重悬。₂O.
   4. P_ENTCUP 启动子，约750 bp（橙色箭头）。经PCR扩增并用DpnI处理。
4. 测定每种DNA片段的浓度，载体片段的浓度应达到150 ng/μl。
5. 从冷冻保存的吉布森组装混合物中取出一份 aliquot，在冰上解冻。该混合物可商业购买，也可在实验室中简单制备。^12–14.
   1. 该配方包含两个步骤：制备黏稠的5倍浓缩母液，以及分装成每份15 μl、浓度为1.33倍的反应液。5倍浓缩母液的组成为：3 ml 1 M Tris-HCl（pH 7.5）、300 μl 1 M MgCl₂₂，600 μl 10 mM 的每种 dNTP，300 μl 1 M DTT，1.5 g PEG-8000，20 mg NAD，以及 ddH₂O₂0 到 6 ml。分装成每份 320 μl (18)，除一份外其余均于 -20 °C 冻存。该溶液将非常黏稠。标记为“5X 等温缓冲液”
   2. 向剩余的320 μl体系中加入1.2 μl T5 Exonuclease、20 μl Phusion High-Fidelity DNA Polymerase、160 μl Taq DNA Ligase和700 μl ddH₂O₂O. 在 PCR 管中冰上分装 15 μl 等份样本（约 80 份），并于 -20 °C 保存。
6. 确定各片段等摩尔数所需的体积。可使用一些在线计算器，如 Gibthon.org。所有DNA片段总体积应为5 μl。将它们加入15 μl的Gibson反应混合物分装液中。如果所需体积过小难以移液，可稀释DNA片段和/或使用多份分装液。
   1. 不要忘记单独准备载体DNA的对照（例如 含有抗生素抗性标记的DNA片段，并用水补足体积。
7. 将试管置于热循环仪中，在 50–55 °C 下孵育 30–60 分钟。孵育后放回冰上冷却，随后进行转化 E. coli 通过热激化学感受态细胞进行转化。请勿使用电转感受态细胞，因为高盐浓度和相对较低的DNA浓度可能导致细胞在电击时产生电弧。
   1. 将全部20 μl加入200 μl市售氯化钙感受态细胞中 E. coli.
      冰上孵育30分钟，42 °C热激60秒
   2. 冰浴2分钟，加入750 μl SOC或LB培养基，于37 °C在微型离心管中振荡复苏30分钟。将混合物及适当稀释液涂布于含卡那霉素的LB平板（或其它适当抗生素）。与传统的基于连接的克隆方法相比，此方法可能导致较高的背景菌落数（以及更多的非靶向重组事件），但值得筛选约10个菌落进行分析。
8. 通过测序确认克隆，并将一份等份试样于 -80 °C 保存

3. 利用基因枪对烟草进行基因枪轰击转染

该技术已在 JoVE 中建立^18,19。关键步骤和差异如下所述。

1. 培养 50–100 ml 大肠杆菌（E. coli）或 200 ml 农杆菌（Agrobacterium），进行大提纯化。继续实验所需的质粒浓度约为 1,500 ng/μl。
2. 按先前所述方法制备基因枪微弹，并将其装入基因枪中。
3. 为转染本氏烟草（Nicotiana benthamiana）叶片表皮组织，选择一株三个月大植株基部附近较大的叶片。小心剪下叶片，并将其背面朝上放置于直径 15 cm 培养皿内湿润的纸巾上。
4. 将基因枪的氦气压力设定为 200–250 psi。
5. 小心将基因枪对准叶片背面叶脉之间的区域，距离叶片约 3–5 cm。解除安全装置，将微弹轰击至叶片表面。每颗微弹可在同一叶片位置使用两次。若叶片破裂，应弃去并更换新叶片——叶片坚韧程度因生长条件（如植株年龄、湿度等）存在差异。对于直径 12 cm 的叶片，预计可进行约 6 次轰击。
6. 将轰击后的叶片盖上培养皿盖，在室温低光照条件下放置 2–3 天。
7. 在配备紫外荧光装置的解剖显微镜下观察叶片，寻找表达绿色荧光蛋白（GFP）的单个细胞，并切取 5–10 mm 的叶段。
8. 将叶段浸入深孔载玻片的 ~200 μl 0.1% Triton X-100 溶液中。该去垢剂有助于防止液体表面产生气泡，而深孔载玻片则可提供更大的组织成像区域。

4. 转染组织的共聚焦显微镜观察

不同仪器的操作说明各不相同，因此接受正规培训至关重要。

1. 进行荧光检测实验时，将激发激光设置为 489 nm，并将光电倍增检测器设置为 500–569 nm 以检测 GFP 荧光，设置为 630–700 nm 以检测叶绿素自发荧光。使用 40 倍水浸物镜对细胞进行成像。

结果

该设计工作源于周密的规划。本项目的新颖之处在于利用可变剪接产生一种前体mRNA，该mRNA可翻译出差异表达的蛋白质。这些蛋白质在不同的细胞器中表达，具体包括叶绿体、过氧化物酶体和/或细胞质。我们改造了一种天然可变剪接的Arabidopsis基因⁶，并将已知的叶绿体⁶和过氧化物酶体¹⁷靶向序列分别置于不同的外显子中（TriTag-1 和 TriTag-2）。TriTag-3 则由嵌入叶绿体序列低复杂度区域内的过氧化物酶体信号构成。这些序列均与GFP保持正确的阅读框连接（图1）。

本研究中使用的质粒包含多个元件：PIMT2 基因的天然选择性剪接调控序列⁶、叶绿体和过氧化物酶体靶向序列、GFP 以及质粒骨架。由于每个元件均具有非常特定的必需序列，因此需要采用序列无关的克隆方法。吉布森组装（Gibson assembly）方案^12,13可用于任意序列的拼接，前提是各组分部分设计为彼此之间具有序列同源性，且不含重复...

讨论

本研究描述了在植物中将单个转基因蛋白定位到多个细胞区室的简单策略。目标是设计一种能在Nicotiana benthamiana中多个细胞器内表达同一基因的载体。所采用的策略包括基于GFP的DNA载体的合理设计、吉布森组装（Gibson assembly）、利用基因枪将质粒递送至叶片细胞，以及通过共聚焦显微镜观察实验结果。

设计了三种不同的短N端标签，用于同时靶向叶绿体、过氧化物酶体和细胞质¹¹这些“TriTags”是通过组合自然界中存在的编码选择性剪接mRNA的DNA设计而成，这些mRNA可引导其编码的蛋白质靶向叶绿体及细胞质⁶ 或过氧化物酶体加细胞质¹⁷TriTag-3 不依赖于选择性剪接，其包含一个叶绿体靶向序列，该序列中天然无结构区域已被过氧化物酶体靶向序列取代^15,17. TriTags 的功能 体内 靶向GFP Nicotiana benthamiana 叶表皮细胞（图5).

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
寡核苷酸引物	IDT	(custom)	为特定载体构建设计
GeneBlocks	IDT	(custom)	500 bp 的寡核苷酸
ApE 软件	犹他大学	(download)	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute 试剂盒	Qiagen	28004	用于纯化 PCR 产物
QIAprep spin miniprep 试剂盒	Qiagen	27104	用于制备适合克隆的质粒 DNA 量
含 GC Buffer 的 Phusion Master Mix	NEB	M0532S	用于 PCR 扩增目标基因
Gibson 组装反应混合液	NEB	E2611L	包含以下 9 种组分的预混液
1 M Tris-HCl pH 7.5	Teknova	T1075	Gibson 组装混合液组分
1 M MgCl₂	G Biosciences	82023-086	Gibson 组装混合液组分
dNTP 混合液	Fermentas	R0192	Gibson 组装混合液组分
1 M DTT	Fermentas	R0861	Gibson 组装混合液组分
PEG-8000	Affymetrix	19966	Gibson 组装混合液组分
NAD	Applichem	A1124,0005	Gibson 组装混合液组分
T5 核酸外切酶	Epicentre	T5E4111K	Gibson 组装混合液组分
Phusion 聚合酶	NEB	F530S	Gibson 组装混合液组分
Taq DNA 连接酶	NEB	M0208L	Gibson 组装混合液组分
Gibthon.org			用于简化计算的网站
Plasmid PLUS Maxi 试剂盒	Qiagen	12963	用于制备基因枪弹粒所需的 DNA
基因枪系统	BioRad	165-2451	包含所有必要组件
Nicotiana benthamiana	(n/a)	(n/a)	由 MGH 的 Jen Sheen 惠赠
共聚焦显微镜	Leica	SP5 X MP	用于观察最终细胞成像
深孔载玻片	Electron Microscopy Sciences	71561-01	用于共聚焦成像
A Plasmid Editor (ApE)	University of Utah		http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon：连接计算器			http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/