本研究介绍了一种利用BioRad基因枪检测的植物亚细胞器选择性靶向新方法。
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方法文章
利用Gibson组装和基因枪在烟草中进行瞬时基因表达 关键词：瞬时表达，烟草，Gibson组装，基因枪，植物转化，分子克隆，重组DNA技术
本文内容
摘要
摘要
为了将单一蛋白质靶向多个亚细胞器，植物通常会复制相关基因，并利用包括不同启动子和/或信号序列在内的复杂调控策略分别表达每个基因。对于希望将酶靶向特定细胞器的代谢工程和合成生物学研究人员而言，面临一个挑战：若一种蛋白质需要定位到多个细胞器，研究人员必须多次克隆同一基因。本研究提出了一种解决方案：利用mRNA的可变剪接技术。该技术借助已知的叶绿体和过氧化物酶体靶向序列，将其整合到一条可发生可变剪接的mRNA中。部分剪接变体被运送至叶绿体，部分至过氧化物酶体，另一部分则留在细胞质中。本文设计了基于可变剪接的多细胞器靶向系统。在此研究中，通过一系列合理设计的5’端mRNA标签，预期实现GFP在叶绿体、细胞质和过氧化物酶体中的表达。这些标签有望在异源基因需要在多个亚细胞器中表达时，减少所需的克隆工作量。这些载体在前期研究中已设计完成11，并采用吉布森组装（Gibson assembly）方法进行克隆，该方法是一种无需限制性内切酶的连接无关克隆技术。所得质粒通过改良的基因枪法导入本氏烟草（Nicotiana benthamiana）表皮叶片细胞中。最后，利用共聚焦显微镜观察转化后的叶片。
引言
本研究是一项代谢工程/合成生物学项目，通过单个DNA构建体，使植物细胞在多个细胞器中表达报告蛋白。
将蛋白质靶向多个位置的一种方法是克隆多个基因拷贝，每个拷贝包含不同的定位肽。每个拷贝必须通过连续的重复转化引入，或者 alternatively，通过单个转化子的回交实现1。这种方法需要额外的克隆步骤，并且每个末端只能连接一个定位标签，因而存在局限性。
另一种使蛋白质定位于多个位置的方法是通过选择性剪接2–5。RNA从单个基因转录而来，但转录本的不同拷贝在细胞内可能以多种方式被差异性加工。这可能导致细胞中由同一基因产生多种信使RNA。这些不同的信使RNA可编码同一蛋白质的不同亚型，或在发生阅读框移位的情况下，编码完全不同的蛋白质。尽管选择性剪接已在文献中被描述多年，但其作用机制以及保守的供体和受体剪接位点直到最近才逐渐被阐明6。随着这些剪接位点的特征被更清晰地解析，也为相关工程化操作带来了新的机遇。
植物代谢工程领域在将蛋白表达于多个细胞器时面临一项挑战。当需要将一种蛋白靶向定位至多个细胞器时，研究人员必须对同一基因进行多次克隆，每次均需连接不同的信号序列，以引导其进入目标细胞器。对于一个需靶向三个细胞器的单个基因，这相当于需要构建三个基因；而对于一个包含六个基因的代谢通路，则需要构建多达18个基因，克....
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方案
1. 用于多个细胞器靶向的可变剪接序列的设计
- 确定目标蛋白的最终表达位点。本研究旨在将蛋白靶向至叶绿体、过氧化物酶体和细胞质。
- 查阅文献，筛选已知可将蛋白靶向至目标细胞器的蛋白和DNA序列。本研究中选用的序列包括：来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）L-异天冬氨酸甲基转移酶的叶绿体靶向序列6,15，以及来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）转甲状腺素蛋白样S-尿囊素合酶的过氧化物酶体靶向序列16,17。
- 设计一种可变剪接策略，以确保目标蛋白被正确靶向至相应细胞器。本研究采用在天然拟南芥（Arabidopsis）系统中观察到的剪接位点6，对mRNA序列进行重新设计，在保留天然剪接位点的基础上，将编码叶绿体或过氧化物酶体靶向标签的序列插入到可变剪接的内含子中（图1）。
2. DNA片段的Gibson组装
另见图2。
Gibson 组装法依赖于预混液中的多种酶发挥作用，其作用包括：1）部分消化双链 DNA....
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结果
该设计工作源于周密的规划。本项目的新颖之处在于利用可变剪接产生一种前体mRNA，该mRNA可翻译出差异表达的蛋白质。这些蛋白质在不同的细胞器中表达，具体包括叶绿体、过氧化物酶体和/或细胞质。我们改造了一种天然可变剪接的Arabidopsis基因6，并将已知的叶绿体6和过氧化物酶体17靶向序列分别置于不同的外显子中（TriTag-1 和 TriTag-2）。TriTag-3 则由嵌入叶绿体序列低复杂度区域内的过氧化物酶体信号构成。这些序列均与GFP保持正确的阅读框连接（图1）。
本研究中使用的质粒包含多个元件：PIMT2 基因的天然选择性剪接调控序列6、叶绿体和过氧化物酶体靶向序列、GFP 以及质粒骨架。由于每个元件均具有非常特定的必需序列，因此需要采用序列无关的克隆方法。吉布森组装（Gibson assembly）方案12,13可用于任意序列的拼接，前提是各组分部分设计为彼此之间具有序列同源性，且不含重复.......
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讨论
本研究描述了在植物中将单个转基因蛋白定位到多个细胞区室的简单策略。目标是设计一种能在Nicotiana benthamiana中多个细胞器内表达同一基因的载体。所采用的策略包括基于GFP的DNA载体的合理设计、吉布森组装（Gibson assembly）、利用基因枪将质粒递送至叶片细胞，以及通过共聚焦显微镜观察实验结果。
设计了三种不同的短N端标签，用于同时靶向叶绿体、过氧化物酶体和细胞质11这些“TriTags”是通过组合自然界中存在的编码选择性剪接mRNA的DNA设计而成，这些mRNA可引导其编码的蛋白质靶向叶绿体及细胞质6 或过氧化物酶体加细胞质17TriTag-3 不依赖于选择性剪接，其包含一个叶绿体靶向序列，该序列中天然无结构区域已被过氧化物酶体靶向序列取代15,17. TriTags 的功能 体内 靶向GFP Nicotiana benthamiana 叶表皮细胞（图5).
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢马萨诸塞州总医院的Jen Sheen慷慨捐赠了Nicotiana benthamiana幼苗。Jen Bush在植物培养及生长室区域设置方面为我们提供了极大的建议与帮助。Wyss研究所的Tom Ferrante在共聚焦显微镜使用方面提供了关键支持。作者尤其要感谢波士顿儿童医院及Wyss研究所的Don Ingber慷慨捐赠了基因枪及相关耗材。本项目经费由美国能源部高级研究计划署（ARPA-E Award # DE-000079）通过合作协定为PAS、JCW和MdM提供，以及由Chimerion Biotechnology, Inc.为MJV提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 寡核苷酸引物 | IDT | (custom) | 为特定载体构建设计 |
| GeneBlocks | IDT | (custom) | 500 bp 的寡核苷酸 |
| ApE 软件 | 犹他大学 | (download) | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/ |
| MinElute 试剂盒 | Qiagen | 28004 | 用于纯化 PCR 产物 |
| QIAprep spin miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27104 | 用于制备适合克隆的质粒 DNA 量 |
| 含 GC Buffer 的 Phusion Master Mix | NEB | M0532S | 用于 PCR 扩增目标基因 |
| Gibson 组装反应混合液 | NEB | E2611L | 包含以下 9 种组分的预混液 |
| 1 M Tris-HCl pH 7.5 | Teknova | T1075 | Gibson 组装混合液组分 |
| 1 M MgCl₂ | G Biosciences | 82023-086 | Gibson 组装混合液组分 |
| dNTP 混合液 | Fermentas | R0192 | Gibson 组装混合液组分 |
| 1 M DTT | Fermentas | R0861 | Gibson 组装混合液组分 |
| PEG-8000 | Affymetrix | 19966 | Gibson 组装混合液组分 |
| NAD | Applichem | A1124,0005 | Gibson 组装混合液组分 |
| T5 核酸外切酶 | Epicentre | T5E4111K | Gibson 组装混合液组分 |
| Phusion 聚合酶 | NEB | F530S | Gibson 组装混合液组分 |
| Taq DNA 连接酶 | NEB | M0208L | Gibson 组装混合液组分 |
| Gibthon.org | 用于简化计算的网站 | ||
| Plasmid PLUS Maxi 试剂盒 | Qiagen | 12963 | 用于制备基因枪弹粒所需的 DNA |
| 基因枪系统 | BioRad | 165-2451 | 包含所有必要组件 |
| Nicotiana benthamiana | (n/a) | (n/a) | 由 MGH 的 Jen Sheen 惠赠 |
| 共聚焦显微镜 | Leica | SP5 X MP | 用于观察最终细胞成像 |
| 深孔载玻片 | Electron Microscopy Sciences | 71561-01 | 用于共聚焦成像 |
| A Plasmid Editor (ApE) | University of Utah | http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape | |
| Gibthon：连接计算器 | http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/ |
参考文献
- Que, Q., et al. Trait stacking in transgenic crops: challenges and opportunities. GM crops. 1 (4), 220-229 (2010).
- Reddy, A. S. N., Rogers, M. F., Richardson, D. N., Hamilton, M., Ben-Hur, A.
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重印与许可
