我们介绍了一种利用Y型迷宫实验揭示气味物质对Drosophila行为影响的选择实验。
本文内容
摘要
摘要
感知环境中的信号对于动物的生存至关重要。为此，动物会利用多种环境线索，例如视觉、机械感受、听觉，以及通过直接接触或味觉进行的化学感知，或通过嗅觉感知远距离作用的挥发性分子。挥发性化学分子对大多数动物而言是极为重要的信号，可用于探测危险、寻找食物来源，或实现个体间的交流。Drosophila melanogaster 是科学家研究嗅觉细胞与分子基础时最常用的生物模型之一。为了突出这种小型昆虫的嗅觉能力，本文介绍了一种基于经典小鼠Y型迷宫实验改进的选择性行为检测方法。利用Y型迷宫所获得的数据，能够为理解动物如何应对持续变化的环境提供重要信息。本文将逐步介绍使用该Y型迷宫实验研究气味物质对果蝇探索行为影响的实验方案。
引言
通过味觉或嗅觉进行的化学感受是动物生存的关键感觉方式。它为动物探测危险或食物来源以及进行社会交往提供了必要的关键线索，同时也帮助动物寻找繁殖所需的配偶。二十多年来，科研人员开展了大量研究，包括理查德·阿克塞尔（Richard Axel）和琳达·巴克（Linda Buck）在2004年因“发现气味受体和嗅觉系统的组织方式”而获得诺贝尔奖的工作"for their discoveries of odorant receptors and the organization of the olfactory system"，以揭示嗅觉的分子与细胞基础1,2。
科学家研究嗅觉感知时最常用的动物模型之一是黑腹果蝇（D. melanogaster）。这种昆虫在气味编码的细胞和分子机制方面与哺乳动物具有相似性。科学界采用多种行为范式来研究气味物质在该果蝇中的作用，其中包括多模态检测方法，例如求偶试验，在该试验中包括嗅觉在内的多种感觉模态对诱发雄性求偶行为至关重要3。此外，还开发了其他一些更特异性地探究气味物质作用的检测方法，包括T型迷宫、Y型迷宫、陷阱试验、四区实验 arena 及风洞装置4,5,6,7,8。
本文介绍了一种简单的改良Y型迷宫实验方法，该方法可利用可靠的嗅觉反应 D. melanogaster我们的装置采用末端尖端，与之前描述的方法相反。9因此，我们的Y型迷宫具有两个优点。首先，果蝇一旦做出选择，系统可避免其折返。其次，它限制了Y型迷宫各区域之间气味分子的交换。最后这一优点至关重要，因为 果蝇 对气流非常敏感，而气流常被用于避免气味分子饱和。若调整实验装置以引入气流，将耗费较多时间和成本。因此，我们的Y型迷宫实验提供了一种高效且快速检测嗅觉功能的方法 果蝇.
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方案
1. 开始前准备
- 使用具有稳定且显著行为表型的同源化参考品系。由于所有潜在的对照品系可能携带异质的背景等位基因，因此选择该品系并无通用规则。
- 使用此对照品系对后续步骤所需的每一个品系进行回交。该回交步骤通常包括至少连续5代，将单只处女雌蝇（以允许同源染色体之间可能发生交换）与2–3只同源参考雄蝇进行交配5。此步骤对于使不同果蝇品系之间的遗传背景均一化至关重要。
- 将Drosophila品系饲养于标准培养基中，培养基成分为玉米粉（9%）、酵母（10%）和琼脂（1.5%），并添加抗生素（0.4%对羟基苯甲酸甲酯），在25 °C、12小时光照/12小时黑暗循环条件下培养。
- 在温度可控的房间（25 °C）内、远红光条件下进行化学感受实验（以消除视觉线索的干扰，专注于化学感受信号）。每次实验之间应定期更换室内空气，以确保实验区域通风。
2. 使用Y型迷宫实验检测嗅觉反应
- 在测试前，将果蝇置于含有湿润纸巾的玻璃管中，在25 °C下饥饿处理16–18小时。
- 将Y形连接器连接至两个玻璃小瓶和一个较小的塑料小瓶（上样瓶）。使用1 ml移液枪吸头穿过泡沫塞，将连接器与三个小瓶相连，形成密封良好的Y形迷宫。剪下两个移液枪吸头的细端（约2 mm直径，以防止果蝇做出选择后返回），制成两个“陷阱”小瓶；再剪下一个移液枪吸头的粗端，制成“上样”管图1A).
- 连接“trap”瓶之前图1B），在每个小瓶中放入一片直径约6 mm的滤纸。在一片滤纸上加入40 μl气味物质溶液，在另一片滤纸上加入40 μl相应的溶剂。
- 将10只4至9日龄的果蝇引入“装载”小瓶中。不要使用CO2 转移过程中的麻醉，因为它对行为有显著影响10。建议采用短暂冷却处理 冰。正确操作麻醉后的果蝇对于尽可能减少实验对象的应激至关重要。
- 在25 °C下，使用远红光（采用LED灯泡以避免可能的热源干扰）进行一系列Y迷宫实验，尽可能减少视觉刺激。注意交替Y迷宫的方向（气味物质所在的管道置于左侧或右侧，进样管道置于前方或后方）； 图1C).
- 让果蝇在含有气味物质或溶剂的诱捕小瓶中停留数小时。24小时后计数果蝇，以使参与率提高至80%以上，并获得最大的嗅觉指数值（Simonnet，个人通讯）。
- 使用以下公式计算所得的嗅觉指数：（气味管中的果蝇数量 - 溶剂管中的果蝇数量）/ 加载的果蝇总数。
- Y迷宫装置清洗步骤如下：将拆卸后的装置在RBS 35 MD中浸泡过夜，用自来水彻底冲洗，最后用去离子水冲洗并晾干。
3. 数据的统计分析
- 根据数据和变量类型，进行 t 检验、单因素方差分析或双因素方差分析。
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结果
图1D展示了使用该Y型迷宫实验的两个代表性反应。Canton-S品系雄性果蝇对用蒸馏水稀释的10%乙酸表现出强烈回避，而对10%苯乙酸则无明显回避行为。这些实验每组重复使用10只雄性果蝇，共同置于加样小瓶中。该方案有时会导致平均值的标准误较大。如有需要，可通过将每组重复的果蝇数量从10只增加至20只来减少这一缺陷。从数学角度而言，个体选择在较大样本量下对指数值的影响权重更低。
图1. 利用Y型迷宫装...
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讨论
我们的Y型迷宫实验方案基于先前描述的方案9，但引入了两个主要改进。首先，我们使用细口移液吸头，以防止果蝇在进入装有溶剂或溶剂加气味物质的试剂瓶后折返。这些细口吸头还有助于限制气味物质在Y型迷宫中的扩散。其次，我们采用较小的装载试剂瓶，迫使果蝇进入Y型迷宫。确保这些果蝇的高参与率至关重要（24小时后达到80%至100%；Simonnet，个人通讯）。
这种Y迷宫实验是一种评估果蝇化学感受反应的有效方法。Drosophila在测试过程中所处的环境因素（例如气流对果蝇造成的应激、加样步骤中对果蝇的操作等）可能会影响其嗅觉反应。这些环境因素至关重要，至少在一定程度上可以解释为何不同研究会得到不同的行为结果。例如，乙酸在某些条件下表现为驱避性 4,11，而在其他条件下则表现为吸引性12。因此，尽可能严格控制这些参数十分关键。
该Y型迷宫实验的一个可能局限性在于其实验环境对果蝇而言较为人为化，因为果蝇被限制在固定的装置中。此外，果蝇必须进入狭窄的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢4位匿名审稿人对本文稿的改进所做出的贡献。感谢法国国家科学研究中心（CNRS）为MBG和YG提供的经费支持，感谢勃艮第大学和法国研究部对MMS的支持。YG实验室的研究工作由欧洲研究委员会（ERC启动基金，GliSFCo-311403）、法国国家科研署（ANR-JCJC，GGCB-2010）、勃艮第大区议会（Faber）以及法国国家科学研究中心（CNRS）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 果蝇聚苯乙烯管 | VWR europe | 734-2255 | 30 x 25 mm Y型迷宫 |
| 果蝇硼硅酸盐玻璃管 | Dijon verre | 95 X 25 mm Y型迷宫 | |
| 泡沫塞 | Dutscher | 999038 | Y型迷宫 |
| Y型连接器 | Europrix | 11020605 | Y型迷宫 |
| 100-1,000 µl 移液器吸头 | Corning | 4868 | 将以下移液器吸头连接至Y型连接器。从宽端起截取2个移液器吸头，长度为65 mm，并将窄端（开口约∼2 mm）连接至2个测试小瓶。这些开口可限制果蝇进入含气味物质的管道后发生U型转弯。另取1个移液器吸头，从宽端起截取35 mm，并将其连接至加样小瓶。 Y型迷宫 |
| 远红光LED灯泡 | Rubin-Lacaque | 0RB180238 | 625-630 nm |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | 45725 | |
| 苯乙酸 | Sigma-Aldrich | P16621 | |
| 酵母 | Sensient Flavors Strasbourg | 1018880464 | |
| 玉米粉 | eurogerm | Farine de maïs | |
| 琼脂 | Kalys | HP-697-25 | |
| 对羟基苯甲酸甲酯 | VWR international | 25605293 |
参考文献
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
- Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
- Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. The smell of love in Drosophila. Front. Physiol. 4, (2013).
- Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
- Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478, 236-240 (2011).
- Woodard, C., Huang, T., Sun, H., Helfand, S. L., Carlson, J. Genetic analysis of olfactory behavior in Drosophila: a new screen yields the ota mutants. Genetics. 123, 315-326 (1989).
- Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459, 218-223 (2009).
- Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
- Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
- Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
- Ai, M., et al. Acid sensing by the Drosophila olfactory system. Nature. 468, 691-695 (2010).
- Becher, P. G., Bengtsson, M., Hansson, B. S., Witzgall, P. Flying the fly: long-range flight behavior of Drosophila melanogaster to attractive odors. J. Chem. Ecol. 36, 599-607 (2010).
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