本文描述了黑腹果蝇（Drosophila）触角的整体免疫染色过程，该方法有助于我们更深入理解嗅觉受体神经元（ORN）多样化所涉及的分子机制。
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本文内容
摘要
摘要
气味分子以精确且协调的方式与其靶受体结合。每个受体识别特定信号，并将该信息传递至大脑。因此，探究嗅觉信息如何传递至大脑并进而影响感知与行为，具有重要的研究意义。有趣的是，近年来的证据表明，细胞转导过程及转录因子参与了嗅觉感受神经元的多样化。本文中，我们提供了一种可靠的完整组织免疫标记方法，用于在体内检测嗅觉感受神经元的组织结构。利用该方法，我们通过抗-ELAV抗体（一种已知的泛神经标记物）以及Or49a-mCD8::GFP标记（在Nba神经元中特异性表达的嗅觉感受神经元标记物）联合抗-GFP抗体，鉴定出了全部的嗅觉感受神经元。
引言
嗅觉系统用于区分种类繁多的气味分子，并将由此产生的信息传递至高级脑区。该输入信号可精确调控动物的基本行为，例如摄食和交配1-6。由于每种嗅觉神经元类型均与特定的一组气味相关联，因此嗅觉受体神经元（ORN）的多样化对于嗅觉系统的正常功能至关重要7。
Drosophila 遗传学使我们能够在单细胞水平上研究与嗅觉受体神经元（ORN）发育及生理功能相关的分子机制8-16。通过对 Drosophila 触角进行整体免疫染色，我们得以更深入地理解参与嗅觉受体神经元（ORN）多样化的分子机制7。本文中，我们提供了一种实现该方法的简单且全面的操作流程描述。
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方案
1. 准备苹果平板
- 将12.5 g琼脂、125 ml市售100%苹果汁、12.5 g葡萄糖和375 ml H2O混合，微波加热1至2分钟，倒入3 cm细胞培养皿中，4 °C保存。
2. 遗传杂交
- 使用以下代表性遗传杂交：
Or49a-mCD8::GFP/CyO × w1118
3. 解剖与染色方案
- 用镊子夹住果蝇，将其麻醉后垂直切下果蝇头部。
- 小心地将带有触角的部分放置在苹果培养基上。
- 使用精细解剖剪刀剪下触角的第三节。
- 在玻璃底培养皿中央加入 90 µl 固定液（含 0.1% Triton X-100 的 0.1% PBS 中配制的 4% 多聚甲醛）。
- 用细针将解剖好的触角轻轻转移至固定液中。如有必要，可用细针将触角完全浸入溶液中。
- 室温（RT）孵育 40 分钟。用 0.4% PBST（含 0.4% Triton X-100 的 PBS）清洗触角，每次 10 分钟，共洗 3 次，保持样本在同一培养皿中。使用黄色枪头移除和添加 PBST 溶液，每次使用 90 µl 洗涤液。
注意：免疫组织化学过程中切勿将培养皿置于摇床上。在添加或移除溶液前，先用细针将所有触角移至培养皿中央，并从培养皿边缘小心地添加或吸出溶液。 - 用 90 µl 含 5% 正常马血清的 0.1% PBST 在室温下封闭触角 20 分钟。
- 去除封闭液后，在湿润容器中加入 90 µl 含 5% 马血清的 0.1% PBST 稀释的一抗溶液，4 °C 孵育 48 小时，操作方法如前所述8。
- 用 0.4% PBST 清洗触角，每次 10 分钟，共洗 6 次。
- 加入 90 µl 含 5% 马血清的 0.1% PBST 稀释的二抗溶液，4 °C 孵育 48 小时。随后用 0.4% PBST 清洗 6 次，每次 10 分钟。
- 封片时，尽可能吸除培养皿中的 PBST，并逐步向触角中引入两种不同浓度的甘油。先加入 40% 甘油处理 1 至 2 分钟，然后吸除并更换为 80% 甘油。
- 用黄色枪头小心地将触角（连同 80% 甘油）从培养皿中取出，转移至载玻片上。轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封盖玻片边缘。此时触角样本已准备好进行荧光显微镜成像。
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结果
确保解剖和固定操作迅速完成是本实验方案成功的关键因素。使用精细的剪刀和镊子也至关重要。免疫染色后，通过共聚焦显微镜观察荧光标记的触角。我们通常使用20倍物镜采集厚度为1 µm的光学切片。我们利用Or49a-mCD8::GFP标记Nba7类嗅觉神经元（ORNs），并统计野生型触角中Nba类ORNs的数量。mCD8-GFP报告基因定位于细胞膜，因此图2中所见的信号反映了表达GFP的Or49a嗅觉神经元的细胞膜。图2展示了使用抗GFP抗体标记的Nba类ORNs表达情况，同时使用抗ELAV抗体作为全神经元标记。每根触角中Nba类ORNs的平均数量为20个（n=8）。
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讨论
Drosophila 触角的解剖操作简单，易于在实验室中进行。为确保解剖成功，必须使用刃口精细的剪刀。在对解剖后的触角进行免疫染色时，应将其置于充满湿气的容器中孵育，以防止抗体溶液蒸发。解剖后的触角容易在溶液中漂浮。在固定和封闭步骤中使用含0.1% Triton的PBS，有助于使触角完全浸入溶液，并确保染色效果更佳。使用“玻璃底培养皿”可减少免疫染色过程中触角的丢失，并确保每次实验仅需使用少量抗体溶液（90 µl）。
神经元类别多样化是神经发生的核心特征。这一生理过程在嗅觉系统中尤为典型，该系统利用多种嗅觉受体神经元（ORN）类别。产生具有气味受体表达和轴突投向特性的多种ORN，对于构建将气味分子信息传递至高级脑区所必需的神经元多样性至关重要。我们的完整附肢触角免疫染色方案有助于进一步理解ORN多样化的分子机制。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由私立大学战略研究基础强化计划（MEXT支持）以及日本学术振兴会（JSPS）青年科学家B类资助项目（H.T.）资助。我们感谢大竹纪仁对视频片段进行剪辑。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Stemi DV4 解剖显微镜 | Zeiss | Stemi DV4 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek 公司 | P35G-0-10-C | |
| 解剖剪刀 | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| 大鼠抗 ELAV 抗体 | 发育研究杂交瘤库 | 7E8A10 | 稀释比例 1:200 |
| 小鼠抗 GFP 抗体 | Invitrogen | A11122 | 稀释比例 1:400 |
| 驴抗兔 IgG 抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-225-152 | 稀释比例 1:200 |
| 驴抗大鼠 IgG 抗体 | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-165-150 | 稀释比例 1:200 |
参考文献
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重印与许可
