循环肿瘤细胞（CTC）半自动化检测技术在临床与临床前研究中的应用转化

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）在多种转移性癌症中具有预后价值。本文描述了作为金标准的CellSearch系统（CSS）CTC计数平台，并强调了常见的分类错误。此外，还介绍了两种 经过改进的实验方案，可用于利用该技术对CTC进行用户自定义标志物表征，以及在转移性小鼠模型中进行CTC计数。

摘要

绝大多数癌症相关死亡发生在转移性疾病出现之后。这一致死性极高的疾病阶段与循环肿瘤细胞（CTCs）的存在密切相关。这些稀有细胞已被证实对转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌具有重要的临床意义。目前临床检测和计数CTCs的金标准是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的CellSearch系统（CSS）。本文概述了该平台所采用的标准操作流程以及两种 用于患者循环肿瘤细胞蛋白质表征的用户自定义标记物优化详细流程的额外适配方案，以及采用标准CSS试剂在极少量血液样本中捕获循环肿瘤细胞的可比方案，用于研究 体内 转移的临床前小鼠模型。此外，还强调了健康供体血液中添加组织培养细胞与患者血液样本之间在CTC质量上的差异。最后，概述了若干常导致CTC分类错误的不一致项目。综上所述，这些实验方案将为关注转移及CTC相关临床前与临床研究的平台使用者提供有价值的参考资源。

引言

据估计，仅在2013年，美国将有580,350人死于癌症，同时将有1,660,290例新发癌症病例被确诊¹。其中大多数死亡发生在肿瘤转移之后²。目前尚缺乏有效治疗转移灶的手段，且对转移级联过程的理解仍有限，这使得疾病进展到这一阶段具有极高的致死性。已有研究表明，血液中存在循环肿瘤细胞（CTCs）与转移性疾病相关³。这些细胞极为稀少，其检出已被证实可提示转移性乳腺癌⁴、前列腺癌⁵和结直肠癌⁶患者的总体生存率。在这些患者中，每7.5 ml血液中检测到≥5个（乳腺癌和前列腺癌）或≥3个（结直肠癌）CTCs，提示预后较差，相比之下，相同血量中CTCs数量较少或未检出的患者预后较好。此外，在治疗过程中或治疗后CTCs数量的变化已被证明可作为治疗反应的预测指标，且通常比当前常用的技术更早提供信息^7-10。

据估计，在转移性癌症患者中，循环肿瘤细胞（CTC）的出现频率约为每10⁵-10⁷个外周血单个核细胞中1个CTC，而在局部病灶患者中，该频率可能更低（约每10⁸个细胞中1个）。由于这些细胞极为稀少，准确且可靠地检测和分析CTC具有较大挑战性¹¹。已有多种方法（此前已有综述^12-14）被用于富集和检测这些细胞，其原理主要基于CTC....

方案

本文所述所有人类研究均在获得西安大略大学人类研究伦理委员会批准的方案下进行。所有动物研究均遵循加拿大动物护理委员会的建议，并在获得西安大略大学动物使用小组委员会批准的方案下开展。

1. 使用 CSS 从患者血液样本中进行标准 CTC 计数

1. 人类血液样本的采集及在制备仪器上的处理前准备

1. 采用标准的无菌静脉采血技术，将至少8.0 ml的人类血液采集至10 ml CellSave管（以下简称CTC保存管）中，该管含有乙二胺四乙酸（EDTA）及一种专有的细胞保存剂。采集后轻轻倒置管体5次，以防止血液凝固。样本可立即处理，或在室温下保存最多96小时。
2. 从冰箱中取出CSS试剂，在使用前使其恢复至室温。
3. 使用一次性10 ml移液管和自动移液器，从CTC保存管中吸取7.5 ml血液，并缓慢将血液加入已正确标记的制备仪器处理管中。
4. 向每个样品中加入 6.5 ml 稀释缓冲液。通过倒置样品 5 次进行混匀。以 800 × g 离心 10 分钟，离心时使用刹车 "关闭" 样本处理必须在制备后1小时内完成。按照样本制备仪上的屏幕提示，将所有患者样本加载到系统中进行处理。

2. 处理前在制备仪上进行对照制备

1. 轻轻涡旋震荡对照管，并倒置5次以混匀。
....

结果

标准CTC计数检测

CSS 的敏感性和特异性已在文献中得到充分记录。然而，为了验证 CTC 回收率的一致性，采用标准 CSSCTC 方案在 CSS 上处理了加标（1,000 个 LNCaP 人前列腺癌细胞）和未加标的人类健康志愿者血液样本。正如预期，未加标样本中未检测到 CTC，检出率为 0.00±0.00%；加标样本的 CTC 回收率为 86.9±4.71% （图1A）加标样本获得的CSS图像质量理想，循环肿瘤细胞（CTCs）易于与非CTCs区分。然而，在处理癌症患者样本时，CTCs的识别略具挑战性，许多细胞体积较小，且较难与非CTCs区分。 （图1B）此外，在审阅患者样本时，发现了6类事件，这些事件在评审者之间通常存在不一致。 （图1C）这6个类别包括， (1) 未达到的小事件 4 µm CTC分类的尺寸要求； (2) CK 和/或 DAPI 染色较弱的样本； (3) 由强CK-PE.......

讨论

尽管自2004年CellSearch系统（CSS）问世以来已开发出许多新型CTC技术，但该技术至今仍是市场上唯一获得临床批准的技术，因此被视为当前CTC检测与计数的金标准。本文表明，尽管CSS具有严格的质控标准，但仍可能受到主观判读偏差的影响，且在患者样本中识别CTC与在加标样本中识别CTC存在显著差异。研究识别出六类常见的分歧项，这些分歧项可能导致CTC分类错误。这些分歧项凸显了对每份经该仪器处理的患者样本需由多位评审人员共同判读的必要性。此外，加标样本与患者来源CTC之间的差异表明，任何新型CTC技术都必须在加标样本和患者样本中同时进行验证。同时，这些新技术必须通过加标样本和患者样本的分样本测试，与金标准CSS进行比较，因为仅在加标样本中实现高效的CTC捕获，并不一定反映其在患者样本中的实际捕获效率。

尽管CSS能够对捕获的CTC进行表征，但在高度可定制化的优化方面存在较大局限性。通常情况下，该仪器上可用于优化用户自定义标志物的唯一参数是抗体浓度以及荧光染料暴露于汞灯的时间。这种有限的优化能力在使用CSS处理用户自定义标志物时可能带来问题。本文提出了一种解决方案（此前已有详细描.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5 M EDTA
抗人 CD44-FITC	BD Pharmigen	555478
抗人 CD44-PE	BD Pharmigen	555479
抗人 HLA-Alexa Fluor 488	BioLegend	311415
抗小鼠 CD45-APC	eBioscience	17-0451-82
Bond 一抗稀释液	Leica	AR9352
CellSave 保存管	Veridex	952820 (20 支装) 79100005 (100 支装)
CellSearch CTC 对照试剂盒	Veridex	7900003
CellSearch CTC 试剂盒	Veridex	7900001
CellSearch CXC 对照试剂盒	Veridex	7900018RUO
CellSearch CXC 试剂盒	Veridex	7900017RUO
仪器缓冲液	Veridex	7901003
Streck 细胞保存剂（又称 CytoChex）	Streck	213350
1 ml 注射器
10 ml 血清移液管
1,000 µl 移液器
1,000 µl 移液器吸头
12 mm x 75 mm 流式管
200 µl 加样吸头
200 µl 移液器
22 G 针头
5 3/4 英寸一次性巴斯德移液管	VWR	14672-200
5 ml 血清移液管
自动移液器
毛细血管采血管（EDTA）	BD Microtainer	365974
CellSearch 分析仪 II	Veridex	9555	包含磁铁和验证卡盒
CellSearch AutoPrep 系统	Veridex	9541
离心机
MagCellect 磁力架	R&D Systems	MAG997
小型乳胶吸球	VWR	82024-550
涡旋振荡器