一种用于探究术后免疫抑制机制及评估新型围手术期免疫疗法的外科应激小鼠肿瘤模型

摘要

采用小鼠肿瘤手术应激模型，研究术后免疫抑制如何促进转移性疾病，并评估围手术期免疫刺激疗法的效果。

摘要

外科手术切除是大多数癌症患者的重要治疗手段，但手术会引发免疫系统功能障碍，这一现象已在动物模型和癌症患者中被证实与转移性疾病的进展相关。我们课题组及其他团队的临床前研究表明，术后固有免疫功能受到显著抑制，尤其是自然杀伤细胞（NK细胞）的功能受到明显抑制，这在术后转移灶加速形成过程中起着关键作用。目前仅有较少的动物研究和临床试验专注于描述并逆转癌症手术带来的不利影响。通过采用一种可自发转移肿瘤并结合手术应激的严格动物模型，我们证实了癌症手术可促进肺转移灶的形成。在该模型中，将4T1乳腺癌细胞植入小鼠乳腺脂肪垫。在肿瘤植入后第14天，对所有动物实施原发乳腺肿瘤的完全切除术。其中一部分动物额外接受腹部肾切除术以模拟手术应激。在第28天时，定量分析肺部肿瘤结节数量。当在术前立即给予免疫治疗时，可观察到免疫细胞被显著激活，从而有效阻止了术后转移灶的形成。尽管4T1乳腺肿瘤手术模型可用于模拟腹部手术应激对肿瘤转移的影响，但其在其他类型肿瘤中的适用性仍有待验证。当前的研究挑战在于，如何在临床前小鼠模型中识别出安全且具有前景的免疫疗法，并将其转化为可行的围手术期治疗方案，用于癌症手术患者，以预防转移性疾病的复发。

引言

手术是实体瘤根治性癌症治疗的关键组成部分，但即使进行了完全切除，许多患者仍会出现转移性复发，并最终死于该疾病。越来越多的研究认识到，术后时期由于手术引起的生理应激反应（包括血液凝固、生长因子释放和免疫抑制），是转移形成的关键时期。我们团队^1,2及其他研究者^3-5已证实，术后即刻阶段是转移形成的特殊易感期。

手术促进转移的关键机制之一是术后自然杀伤（NK）细胞功能障碍^1-3。NK细胞是先天免疫系统的细胞毒性淋巴细胞，参与对肿瘤生长和转移的控制⁶。术后NK细胞功能障碍已在人类患者^1,7-9和动物模型^1,10,11中均有报道。在自发性转移和移植性转移的动物模型中，术后NK细胞受抑与转移增加相关^1,11-14；而在人类研究中，围手术期NK细胞活性降低与癌症复发率和死亡率升高相关^15,16。

尽管如此，目前尚无专门针对癌症手术后即刻发生的促转移性变化的癌症治疗方法。围手术期是干预转移过程的一个治疗窗口期。虽然传统的癌症治疗方法（如细胞毒性化疗）被认为毒性过大，不适合用于接受重大手术后正在恢复的患者¹⁷，免疫疗法是围手术期给药的理想候选方案。重组IL-2和IFN-的围手术期应用γ 已在早期临床试验中进行了探索，表明其具有预防术后自然杀伤细胞抑制和改善无进展生存期的潜力^18-21不幸的是，这种非特异性细胞因子治疗与大型手术联合应用时的耐受性问题，阻碍了其进一步发展¹⁷病毒也是自然杀伤细胞（NK细胞）的强效非特异性激活剂。我们先前的研究表明，术前给予复制型病毒（如新型抗肿瘤溶瘤病毒（OV））或非复制型病毒疫苗（如流感疫苗），可抑制手术诱导的NK细胞功能障碍，并减轻转移性疾病。^1,22.

本文所述的手术模型有助于我们理解术后肿瘤细胞扩散和生长的机制，并使我们能够探索可在围手术期应用的新型靶向治疗策略。为实现这一目标，我们建立了一种模拟手术应激和自发转移的动物模型。该模型采用可自发从原发乳腺部位转移至多个远端器官（尤其是肺部）的小鼠乳腺癌细胞（BALB/c - 4T1）。在第0天，将乳腺癌细胞植入小鼠乳腺脂肪垫中。在肿瘤植入后第14天，对所有动物实施原发性乳腺肿瘤的完全切除术。部分动物 дополнительно接受腹部肾切除术以模拟额外的手术应激。在第28天，分别分离并定量分析经历手术应激的小鼠与未接受手术的对照组小鼠的肺部肿瘤结节。在此癌症与手术的动物模型中，研究人员正在研究手术对癌转移的影响，并首次测试包括复制型与非复制型病毒载体免疫刺激剂在内的创新免疫疗法在围手术期应用的有效性。

方案

1. 4T1 肿瘤细胞的培养维持 体外

1. 在10 cm组织培养皿中，使用完全DMEM培养基（DMEM，10% FBS，1×青霉素/链霉素）培养未修饰的4T1肿瘤细胞。于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育。₂ 组织培养箱
2. 每2-3天传代培养一次。为保持最佳存活率，细胞汇合度不应超过80%。不可使用此类细胞进行建系 体内 原代肿瘤，如果培养物已传代 体外 用于 >1个月，因为与早期传代的细胞相比，这会降低其恶性程度和转移潜能。

2. 收集用于注射的4T1肿瘤细胞

1. 使用巴斯德吸管从组织培养板中吸除培养基。
2. 加入含有 2 ml EDTA 的 10 ml 1× 无菌 PBS。将 PBS 溶液置于 37 °C、5% CO₂ 的组织培养孵箱中孵育 5–7 分钟。
3. 从培养板中收集 PBS 溶液，用该溶液冲洗培养板 2–3 次，转移至 15 ml 锥形管中。
4. 在台式离心机中以 500 × g 离心 5 分钟 ，温度为 4 °C。
5. 吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于无血清 DMEM 中。
6. 使用细胞计数仪测定细胞浓度。
7. 用无血清培养基将细胞稀释至 1×10⁶ 个细胞/500 μl（或 1×10⁵ 个细胞/50 μl，用于注射），并将细胞置于冰上。

3. 向小鼠注射4T1肿瘤细胞

所有动物实验均遵循渥太华大学动物护理兽医服务部门的机构指南进行 所有接受原位注射或肿瘤移植的动物的护理建议。

1. 在手术前1小时，对小鼠皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）以进行术前镇痛管理。
2. 在注射过程中，使用2.5%异氟烷诱导并维持小鼠麻醉状态。通过夹捏小鼠足垫以检测其反射反应。若无反射反应，则表明已达到有效麻醉深度。 随后涂抹无菌眼用润滑剂，以防止角膜干燥。
3. 使用30 G ½ in "Ultra-fine" 注射器精确吸取50 μl细胞悬液。通过轻弹注射器侧面去除注射器柱内的所有气泡，确保无残留气泡。
4. 将麻醉状态下的小鼠仰卧位放置。
5. 使用酒精棉片清洁注射部位，将针头水平直接插入第4对乳腺脂肪垫内，缓慢推注注射器中的液体。
6. 使用棉签清除任何可能的渗漏液体。
7. 让小鼠从麻醉状态中自然恢复。
8. 术后每8小时皮下注射一次布托啡诺（0.05 mg/kg），持续2天，以维持镇痛效果。

4. 在携带4T1肿瘤的BALB/c小鼠中实施围手术期治疗

           流感疫苗的给药方案和给药途径与溶瘤病毒术前治疗相同。

1. 在肿瘤细胞注射后第13天，使用外置卡尺测量原位肿瘤。用卡尺测量最大纵向直径（长度）和最大横向直径（宽度）。采用改良的椭球公式计算肿瘤体积（肿瘤体积 = 1/2（长度 × 宽度²））。
2. 在肿瘤细胞注射后第13天，原位肿瘤体积应约为1 cm³。达到该肿瘤体积后，准备围手术期治疗试剂。
3. 溶瘤病毒是一种可在围手术期给予的创新性治疗手段。将溶瘤病毒（1×10⁹ PFU/1 ml）用1×无菌PBS配制，并在注射前置于冰上保存。
4. 将小鼠固定并放入固定器中，以进行尾静脉注射。
5. 将小鼠尾巴轻轻浸入温水中加热，以使侧尾静脉清晰可见。
6. 用精确的100 μl溶瘤病毒治疗液装填27 G ½ in "Insulin Syringe"。确保注射器内无任何气泡。
7. 向小鼠的一侧尾静脉注射1×10⁸ PFU/100 μl/只。若针头正确插入侧静脉，则推动注射器时不应感到阻力。

5. 原发肿瘤的完整切除与腹部左侧肾切除术

1. 在肿瘤细胞注射后第14天，按照渥太华大学动物护理与兽医服务中心批准的方案开始常规围手术期护理。在手术前1小时，对小鼠皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg） 术前进行镇痛处理。术中使用2.5%异氟烷诱导并维持麻醉。 在无菌条件下使用无菌外科器械，剃除并清洁手术部位。术前给予动物皮下补液和眼用润滑剂。
2. 在乳腺脂肪垫处做一个1-2 cm长的小切口，轻柔且完整地切除原位4T1肿瘤。
3. 用2-3个9毫米钉合器钉合关闭切口。
4. 沿小鼠腹侧中线切开皮肤和皮下层以暴露腹部。
5. 在腹白线上做一切口（3-4 cm），以暴露小鼠腹膜。
6. 将覆盖在腹部左侧内侧的肠管移至一侧，以暴露该区域。确保使用浸有生理盐水的无菌纱布保持肠管湿润。
7. 使用钝头手术镊轻轻夹住左肾。
8. 使用3-0号蜡涂层编织丝线打成环状结扎线，结扎左肾肾门，并以3个外科结固定。用手术剪切除左肾。
9. 仔细检查缝合结，以确保实现充分的止血。
10. 用5-0编织可吸收缝线连续锁扣缝合皮下层，然后使用9 mm钉夹缝合皮肤层。步骤5.2至5.10每只动物约需10分钟。
11. 皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）用于镇痛，每8小时一次，持续2天。

6. 小鼠安乐死及肺部肿瘤负荷的处理与定量

1. 在4T1肿瘤接种后第28天，根据渥太华大学动物护理与兽医服务部门的规程对小鼠实施安乐死。
2. 用70%乙醇喷洒小鼠体表。
3. 使用剪刀在小鼠肋骨下方稍作初始切口。
4. 沿小鼠胸腔腹侧中线剪开皮肤及皮下组织，暴露胸腔。
5. 在小鼠身体两侧沿侧面向上至颈部方向，穿过皮肤和组织做横向切口。
6. 轻轻夹住肺组织，同时剪除肺上下方的结缔组织，将肺分离取出。
7. 将取出的肺预先浸泡于冷PBS中以去除残留血液，随后置于10%缓冲福尔马林溶液中固定。
8. 对每只肺进行拍照以评估肿瘤转移情况，并称重以定量肿瘤负荷。

结果

已建立一种可重复的小鼠手术应激模型，该模型可导致肺转移显著增加。在4T1肿瘤接种后第28天（以及肿瘤切除±腹部肾切除术后14天），取肺组织并观察转移情况。与未治疗小鼠相比，手术明显增加了肺转移的数量，这通过肺组织照片（图1A）、肺结节数量统计（图1B）和肺重量测定（图1C）得以证实。术前给予复制型溶瘤病毒和灭活流感疫苗可显著逆转癌症手术所促进的转移效应（图1A-C）。

为了确定自然杀伤细胞（NK细胞）在疫苗治疗后预防转移过程中是否起中介作用，我们在肿瘤转移模型中使用抗去唾液酸基-神经节苷脂-1抗体（anti-asialo-GM-1）对NK细胞进行药物性耗竭。在缺乏NK细胞的情况下，我们观察到围手术期免疫治疗的治疗效果被完全消除（图2A 和 2B）。这些数据表明，在我们的手术应激模型中，肿瘤转移灶的清除主要通过溶瘤病毒和流感疫苗激活NK细胞，进而由NK细胞介导肿瘤细胞裂解来实现。为了进一步表征围手术期给予溶瘤病毒和流感疫苗后NK细胞的功能，我们评估了体外（ex vivo）NK细胞杀伤活性。简言之，从经历手术应激的小鼠和对照小鼠的脾细胞中合并并分选出DX5+ NK细胞，将其与铬标记的YAC-1靶细胞在不同效应细胞与靶细胞比例下共培养4小时，随后使用γ计数器测定上清液中铬的释放量。结果显示，与仅接受手术的小鼠相比，手术本身显著抑制了NK细胞的细胞毒性功能，而围手术期给予溶瘤病毒和流感疫苗则显著恢复了NK细胞的杀伤能力（图2C 和 2D）。综上所述，这些结果表明，围手术期NK细胞功能的抑制可通过新型免疫刺激疗法得到有效治疗，从而减少转移性疾病的发生。

图1. 新型抗癌溶瘤病毒与流感疫苗作为围手术期治疗抑制手术诱导的肺转移增强作用。 在治疗第28天对4T1肺肿瘤转移情况进行评估，包括（A）代表性肺组织照片、（B）肺部肿瘤结节数量计数以及（C）肺组织重量。数据来自三次相似实验，每组n=5–10（*，p = 0.01；**，p < 0.0001；n.s.，无显著差异）。请点击此处查看该图的高清版本。

图 2. 手术应激通过损害自然杀伤细胞（NK细胞）增加肺部肿瘤转移。(A,B) 接受新型围手术期治疗的手术应激小鼠肺部肿瘤转移灶的定量分析。(C,D) 从手术应激小鼠和未处理对照小鼠中分离的DX5+ NK细胞杀伤肿瘤细胞的能力。数据以三复孔中铬释放率的平均值（±标准差）表示，对应不同的效应细胞与靶细胞（E:T）比例。数据代表3次相似实验的结果，每组n=4-5（*, p =0.01；**, p <0.005；n.s.，无显著性差异）。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

手术切除是局部实体恶性肿瘤患者治疗的主要手段。即使进行了完全切除，许多患者仍会出现转移性复发，并最终死于该疾病。术后即刻阶段为肿瘤转移的形成提供了理想环境，这一过程在很大程度上受到术后自然杀伤（NK）细胞功能抑制的调控。尽管如此，这一时期仍是一个在很大程度上被忽视的治疗窗口期。 目前尚无旨在预防术后转移的标准围手术期抗肿瘤治疗方案。当前的挑战在于，识别出安全且具有前景的治疗方法，以在围手术期激活自然杀伤（NK）细胞，从而防止微转移性疾病的形成。这些疗法必须在临床前动物模型中对其安全性和有效性进行严格表征，然后转化为精心设计的临床试验。

建立小鼠手术应激肿瘤模型的主要目的是探索手术后免疫抑制和转移性扩散的机制，并评估具有潜在临床应用前景的新型免疫疗法，以用于接受原发肿瘤切除术的癌症患者。为实现这一目标，我们构建了结合手术应激的4T1小鼠乳腺癌模型。尽管4T1细胞系来源于小鼠"乳腺癌"，但选择该细胞系的原因在于其可重复地自发产生转移灶，使我们能够在贴近实际的癌症模型中评估手术应激的影响。在此背景下，肿瘤的实际来源远不如其转移潜能和肿瘤生物学特性重要。本模型的第二个关键组成部分是设计一种动物手术操作，以尽可能模拟人类癌症手术。在该动物手术应激模型中，当原发性4T1乳腺肿瘤体积达到1 cm³时，对其进行切除。由于人类癌症手术常伴随显著的免疫抑制，因此在"手术应激"处理组中，额外实施开放腹腔肾切除术。与人类更常规的肿瘤切除手术相比，完全左肾切除术的侵入性程度与多种实体恶性肿瘤的外科治疗相当，包括结直肠癌、卵巢癌、肾癌、胰腺癌、肺癌及食管癌手术。此外，我们认为，由于剖腹探查联合肾切除术所引起的围手术期剧烈生理变化，能够充分模拟大多数实体恶性肿瘤在侵入性手术后所发生的整体性生理改变。为控制可能导致过度手术应激和动物死亡率的围手术期因素，我们对麻醉和手术持续时间以及术中体温维持等参数进行了精确规定。所有这些参数均在我们的手术方案中被严格定义并准确执行，以模拟人类癌症患者常规的围手术期护理。

围手术期治疗的时机是围手术期挽救模型中的另一个关键因素。携带4T1肿瘤的小鼠此前已接受过3种流感疫苗给药方案：新辅助治疗（术前5天给药）、围手术期给药（手术当天给药）以及围手术期联合多剂量给药（手术当天给药，随后每隔5天追加一次，共额外给药两次）。值得注意的是，所有三种疫苗治疗模式均显著减少了肺转移灶²²。然而，单次围手术期给予流感疫苗在抑制转移方面效果最为显著。总体而言，这些实验突显了围手术期这一短暂治疗窗口在干预转移过程中的重要性。

目前，仅我们研究团队开展了在围手术期使用溶瘤病毒和疫苗等创新性免疫疗法的研究。我们首次证明，在动物模型中，围手术期给予新型的ORF病毒和痘苗病毒可逆转手术后自然杀伤（NK）细胞功能的抑制¹。更重要的是，免疫功能的恢复与术后转移灶形成减少相关。在人体研究中，癌症术后患者的NK细胞毒活性降低，而围手术期使用溶瘤病毒（OV）可显著增强癌症患者的NK细胞活性¹。利用 commercially available 预防性疫苗，我们在临床前肿瘤模型中证明，围手术期接种流感疫苗可显著减少肿瘤转移，并改善NK细胞的细胞毒作用。在人体研究中，流感疫苗显著增强了健康人供体及癌症手术患者的NK细胞活性²²。

为降低癌症复发率，目前采用多种方法，包括化疗和放疗，但这些疗法通常在手术前数周至数月（新辅助治疗）或手术后（辅助治疗）进行。该领域的研究表明，术后即刻阶段对于决定长期肿瘤复发率至关重要。因此，在这一关键时期采用免疫治疗等临床干预措施，可能带来显著的长期益处。我们利用自发性肺转移小鼠模型及手术应激模型开展的研究，为探索新型治疗方法提供了独特的机会，有助于评估这些疗法在预防癌症手术患者围手术期免疫抑制方面的潜力，从而降低癌症复发率。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）	Corning Cell-Gro	10-013-CV
灭活胎牛血清（FBS）	HyClone	SH30396.03
青霉素/链霉素	Gibco	15070-063
1× 无菌磷酸盐缓冲液（PBS）	Corning Cell Gro	21-031-CV
丁丙诺啡	Chiron, Guelph	RXN309968
异氟烷	Baxter Corp	1001936040
1/2 超细注射器	Terumo	30 G, SS05M3009
9 mm 钉皮钉	Braintree	ACS BX
5-0 编织可吸收缝合线	Covidien	UL-202
3-0 蜡涂层编织丝线缝合线	Covidien	S-194
福尔马林	Fisher	SF100-20
4T1 肿瘤细胞	ATCC	CRL-2539
BALB/c 小鼠	Charles Rivers Labs	品系编号：028