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方法文章

凝血因子VIII在脂质纳米管上的螺旋状排列

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DOI：

10.3791/51254

⸱

2014年6月3日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience and Cell Biology, University of Texas Medical Branch, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Texas Medical Branch, 3Sealy Center for Structural Biology and Molecular Biophysics, University of Texas Medical Branch

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种结合冷冻电子显微镜、脂质纳米技术和结构分析的方法，用于解析两种高度同源的凝血因子VIII（FVIII）形式——人和猪FVIII——在膜结合状态下的结构。文中描述了我们实验室开发的方法 ，即将两种具有功能的重组FVIII形式以螺旋方式有序排列在带负电荷的脂质纳米管（LNT）上。

摘要

冷冻电子显微镜技术（Cryo-EM）1 是一种强大的方法，可用于研究蛋白质及其复合物在水合状态及膜环境中的功能结构2。

凝血因子VIII（FVIII）3是一种多结构域的血浆糖蛋白。FVIII的缺陷或缺乏是A型血友病 - 这一严重出血性疾病的致病原因。在蛋白水解激活后，FVIII会结合于带负电荷的血小板膜上的丝氨酸蛋白酶因子IXa，这对正常的血液凝固至关重要4。尽管FVIII在凝血过程中发挥关键作用，但其膜结合状态的结构信息仍不完整5。重组FVIII浓缩物是治疗A型血友病最有效的药物，目前市售的FVIII可来源于人或猪，两者均能与人因子IXa形成具有功能的复合物6,7。

本研究展示了冷冻电子显微镜（Cryo-EM）、脂质纳米技术和结构分析方法的结合应用，用于解析两种高度同源的FVIII形式（人源和猪源）在膜结合状态下的结构。文中描述了我们在实验室中建立的将两种功能性重组FVIII分子以螺旋方式有序排列在带负电荷的脂质纳米管（LNT）上的方法。 代表性结果表明，该方法具有足够的灵敏度，能够明确区分这两种在序列上高度同源（序列一致性达86%）的蛋白质在螺旋排列上的差异。本文提供了螺旋组装、冷冻电镜和电子断层扫描（ET）数据采集的详细实验方案，并讨论了用于获得人源和猪源FVIII-LNT二维（2D）和三维（3D）结构重建的分析方法。所呈现的人源与猪源FVIII-LNT结构展示了该方法在高分辨率下解析凝血因子VIII功能性膜结合构象的潜力。

引言

凝血因子VIII（FVIII）是一种由2,332个氨基酸组成的大型糖蛋白，包含六个结构域：A1-A2-B-A3-C1-C2 3。经凝血酶激活后，FVIII作为因子IXa的辅因子参与膜结合的“十酶复合物”（Tenase complex）。活化后的FVIII（FVIIIa）以依赖膜的方式与FIXa结合，可将FIXa的蛋白水解效率提高105倍以上，这对有效凝血至关重要4。尽管FVIII在凝血过程及十酶复合物形成中具有重要作用，其功能性膜结合状态下的FVIII结构至今仍未被解析。

为解决这一问题，采用富含磷脂酰丝氨酸（PS）的单层脂质双分子纳米管（LNT），其可高亲和力结合FVIII8,9 并已开发出类似活化血小板表面的结构10已证明，FVIII与LNT结合后呈连续螺旋排列，可有效用于通过冷冻电镜解析FVIII膜结合状态的结构5功能化的LNT是利用冷冻电镜研究螺旋排列的膜相关蛋白的蛋白-蛋白及蛋白-膜相互作用的理想体系11,12. 冷冻电镜相较于传统结构研究方法具有优势 与X射线晶体学和核磁共振（NMR）相比，该方法在最接近生理环境（缓冲液、膜、pH值）的条件下保存样品，无需添加物和同位素。对于FVIII而言，利用该技术研究其膜结合结构具有更高的生理相关性，因为LNT在大小、形状和组成上均与活化血小板表面形成Tenase复合物的伪足结构高度相似。 体内.

FVIII 的缺陷和缺乏会导致血友病 A，这是一种严重的出血性疾病，影响人类男性群体中每 5,000 人中的 1 人4,6。血友病 A 最有效的治疗方法是终生给予重组人 FVIII（hFVIII）。重组 FVIII 治疗血友病 A 的一个主要并发症是约 30% 的患者会产生针对人源 FVIII 的抑制性抗体13。在此情况下，可使用猪 FVIII（pFVIII）浓缩制剂，因为猪 FVIII 与抗人 FVIII 的抑制性抗体交叉反应性较低，并能与人 FIXa 形成功能性复合物7。阐明猪源和人源 FVIII 的膜结合结构组织，对于理解 FVIII 辅因子功能的结构基础及其在血液止血中的意义至关重要。

本研究介绍了一种脂质纳米技术、冷冻电镜（Cryo-EM）与结构分析相结合的方法，旨在解析两种高度同源的FVIII形式在膜结合状态下的空间组织结构。所展示的猪源性和人源性FVIII在带负电荷的脂质纳米盘（LNT）上呈螺旋状排列的冷冻电镜数据及三维结构，表明该纳米技术具有作为在生理膜环境中解析FVIII及膜结合凝血因子与复合物结构基础的潜力。

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方案

1. 样品制备

  1. 将人FVIII-BDD14和猪FVIII-BDD15用HBS-Ca缓冲液（20 mM HEPES、150 mM NaCl、5 mM CaCl2，pH = 7.4）进行缓冲液置换，并浓缩至1.2 mg/ml。将蛋白溶液保存于-80 °C。
  2. 通过在氯仿中以1:4 w/w比例混合半乳糖基神经酰胺（GC）和磷脂酰丝氨酸（PS）制备脂质纳米管（LNT）。在氩气下蒸发氯仿，并将脂质溶于HBS缓冲液至1 mg/ml。将LNT溶液保存于4 °C。

2. FVIII-LNT的冷冻电子显微镜观察

  1. 冷冻电镜样品制备
    1. 将300目Quantifoil R2/2铜网（碳膜面朝上）在O2和H2 混合气体中辉光放电10秒 ，功率为50 W。
    2. 在HBS-Ca缓冲液中按1:1（w/w）比例混合FVIII与LNT溶液，并在室温下孵育15分钟 。
    3. 将2.5 µl的FVIII-LNT样品滴加至Vitrobot Mark IV加湿腔（100%湿度）中的亲水性透射电镜载网上。
    4. 用液态C2H6进行 blotting 并快速冷冻载网（blot一次，3.5秒，blot力为1），液态C2H6由液氮冷却，以形成非晶态冰。
    5. 将载网置于液氮（LN2）中保存于储存盒内。
  2. 冷冻电镜数据采集
    注：JEM2100-LaB6（2010年款）配备TEMCON操作系统，该系统包括一台连接电子显微镜的计算机、一个显示真空系统、照明系统、高压（HT）、透镜电流等信息的屏幕，以及位于镜筒两侧的左（LEFT）和右（RIGHT）两个控制面板。束流偏移X、Y旋钮（SHIFT Y, SIFT Y）和多功能（DEF/STIG）旋钮分布在两个面板上。左侧面板上有照明（BRIGTHNESS）旋钮；右侧面板上有放大倍数（MAG/CAM LENGTH）和聚焦（FOCUS）旋钮，以及三个成像模式按钮（MAG1、MAG2、LOWMAG）和一个衍射模式按钮（DIFF）。我们在MAG1模式下以alpha 2条件采集数据。冷冻电镜数据采集所需的最小剂量照明条件（MDS）通过右侧面板顶部的F1至F6按钮设定。本方案中使用通用设置：F1 — 升降荧光屏，F2 — 搜索（SEARCH）模式，F3 — 聚焦（FOCUS）模式，F4 — 拍照（PHOTO）模式，F5 — MDS关闭/开启，F6 — 束流遮挡（BEAM BLANK），用于通过偏转电子束来保护样品免受辐射损伤。
    1. 将冷冻电镜样品杆插入冷冻站，并用液氮（LN2）填充样品杆杜瓦瓶和冷冻站。当温度降至-192 °C时，打开样品杆尖端的快门，将预先冷冻的冷冻电镜载网放入指定位置，并用环形夹固定。
    2. 将冷冻样品杆插入电子显微镜中。重新填充样品杆杜瓦瓶和防污染装置腔室中的液氮。等待样品杆稳定30–60分钟。按下F6并开启灯丝。当灯丝达到饱和后，关闭F6并打开样品杆快门以观察载网。
    3. 按下低倍镜/alpha 1（设定为200X 倍率），在载网上寻找冰层较薄的区域。
    4. 切换至MAG 1/alpha 2模式以设定最小剂量（MDS）模式，并在低电子剂量下采集冷冻电镜数据，避免损伤样品。
      1. 按下F2进入搜索（SEARCH）模式。将放大倍数设为40,000倍。使用BRIGTNESS旋钮扩大电子束，使电子剂量最小化至约0.04 e-/Å2·s。按下DIFF键切换至衍射模式。使用MAG/CAM LENGHT旋钮将相机长度设为120 cm。在LOWMAG模式下预选的区域内，寻找碳膜孔洞中含有脂质纳米管的区域。
      2. 按下F4进入拍照（PHOTO）模式，放大倍数为40,000X ，使用BRIGHTNESS旋钮调节照明，使剂量达到16–25 e-/Å2·s。按下标准聚焦（Standard Focus）按钮，通过右侧控制面板上的Z UP/DOWN按钮调节样品Z轴高度以设定聚焦条件。将欠焦值设定在-1.5至-2.5 µm之间。
      3. 通过在数字相机显示器的LIVE VIEW窗口中绘制一个方框，将SEARCH模式与PHOTO模式对齐，该方框对应PHOTO模式下将要成像的区域。
      4. 按下F3进入聚焦（FOCUS）模式，放大倍数为100,000X 。调节照明聚焦，使光束覆盖CCD芯片（半径约4–5 cm），并偏离轴线，以避免照射PHOTO模式下将要成像的区域。使用FOCUS旋钮将欠焦值调节至约-1.5至-2.5 µm，并使用DEF/STIG旋钮校正图像的像散。
    5. 在SEARCH模式下，通过在数字相机显示器的LIVE VIEW窗口中采集实时图像，选择待成像的FVIII-LNT区域，并将FVIII-LNT置于LIVE VIEW窗口中方框的中心位置。
    6. 切换至拍照（PHOTO）模式，点击数字显微图像相机显示器上的ACQUIRE按钮，在52,000X 有效放大倍数和0.5秒曝光时间下，用CCD相机记录一幅数字图像。图像采集条件设定为：仅在PHOTO模式下采集图像时，束流遮挡（SHUTTERS）才打开。
    7. 按下CTRL-F键获取快速傅里叶变换（FFT）图像，以检查所采集图像的质量和欠焦程度。

3. 三维重建

注意：用于二维和三维分析的图像分析软件 EMAN2 和 IHRSR 均可免费获取。EMAN2 可从以下网址下载：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Install。IHRSR 软件可向 Egelman 教授申请获取：egelman@virginia.edu。最终的 IHRSR 精修步骤在位于德克萨斯大学奥斯汀分校的德克萨斯高级计算中心集群上运行：http://www.tacc.utexas.edu/。图 1 所示的三维重构算法主要包括两个步骤：首先，使用 EMAN2 中实现的二维无参考对齐（RFA）算法，筛选出一组均一的螺旋片段（颗粒）；其次，基于螺旋参数和 IHRSR 中集成的反投影算法，实现三维重构。第一步利用了为单颗粒 SPA（单颗粒分析）开发的程序，这些程序专门用于筛选适用于三维重构的均一颗粒集，而 EMAN2 正是为此目的开发和发布的：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2。该步骤已针对冷冻电镜（Cryo-EM）数据进行了优化。第二步采用 IHRSR 算法，该算法专为重组凝血因子 VIII 形式所获得的此类螺旋组装结构而设计。该算法已在科学文献中得到广泛记录12。

  1. 使用 EMAN2 科学图像处理套件进行二维图像分析：http://blake.bcm.edu/eman2/doxygen_html16，以选择用于螺旋重构的均一颗粒（螺旋片段）集合。
    1. 使用数码相机软件和可视化工具选择具有笔直且有序排列螺旋管的冷冻电镜显微照片。
    2. 在 e2workflow.py 图形用户界面（GUI）的单颗粒重构（spr）选项中，对图像进行反相、归一化处理，并滤除 X 射线像素：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2projectmanager
    3. 将反相、归一化并滤除 X 射线像素后的图像导入 e2helixboxer.py 图形用户界面。使用以下链接中的工具选择 FVIII-LNT 螺旋管，并以 256 × 256 像素（2.9 Å/像素）进行片段截取，重叠率为 90%：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2helixboxer
    4. 从原始显微照片评估离焦量，并对来自相同显微照片的螺旋片段应用对比度传递函数（CTF）校正（仅相位校正），该功能集成在 e2workflow.py 的 e2ctf.py 选项中：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2ctf。
    5. 在 e2workflow.py 图形用户界面的 SPR 选项中生成初始颗粒（螺旋片段）集合：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2workflow。
    6. 使用 e2refine2d.py 算法计算二维分类平均图，应用无参考 k-均值分类法以选择具有相同直径 LNT 和螺旋有序程度的均一数据集（图 2），执行如下脚本：‘e2refine2d.py --iter=8 --naliref=5 --nbasisfp=8 --path=r2d_001 --input=INPUT.hdf --ncls=51 --simcmp=dot --simalign=rotate_translate_flip --classaligncmp=dot --classraligncmp=phase --classiter=2 --classkeep=0.8 --classnormproc=normalize.edgemean --classaverager=mean --normproj –classkeepsig’，并根据需要调整 ncls 值。
      1. 将初始数据集在 8 次迭代中分为 150 个类别（‘ncls=151’），设置 ‘classkeep=0.8’，即排除与类别平均图相似度低于 80% 的颗粒。http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/e2refine2d
      2. 在 e2display.py 中合并具有明显螺旋衍射特征的类别平均图中的颗粒，以创建中间数据集。
      3. 将中间数据集进一步分为 50 个类别（‘ncls=51’），以区分具有相同直径和有序程度的类别。
      4. 在 e2display.py 中合并具有相同直径和有序程度类别的颗粒，以生成用于三维重构的最终数据集：http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2/Programs/emselector。
  2. 使用迭代螺旋实空间重构（IHRSR）算法进行螺旋重构，方法如 Egelman17,18 所述。
    1. 从最终数据集中颗粒的联合傅里叶变换估算 FVIII-LNT 螺旋的上升距离 Δz (Å)。
    2. 通过运行并行的 IHRSR 精修（固定 Δz，将 ΔΦ 从 5° 以 5° 为增量逐步增加至 60°）来确定方位角 ΔΦ (º)。
    3. 对每个最终数据集运行 100 次连续的 IHRSR 循环，初始体积采用无特征圆柱体，并使用步骤 3.2.1 和 3.2.2 中定义的初始螺旋参数 Δz 和 ΔΦ。
    4. 检查最终体积中螺旋参数的收敛性，以及最终数据集的二维分类所得类别平均图与最终 IHRSR 重构的投影图之间的一致性。
    5. 对最终三维重构施加对称性，对应于最终非对称三维体积中观察到的不对称单元分布：人源 FVIII-LNT 为四重对称，猪源 FVIII-LNT 为五重对称。再运行 100 次精修循环，生成最终的对称化三维重构。
    6. 通过首先将对应数据集分为奇数和偶数两部分来计算两个体积的傅里叶壳层相关（FSC）曲线：‘e2proc2d.py <infile> <outfile> --split=2’。然后按照步骤 3.2.3 所述运行 100 次连续 IHRSR 精修。计算由奇数和偶数数据集生成的三维体积之间的 FSC：‘e2proc3d.py evenvolume.mrc fsc.txt --calcfsc=oddmap.mrc’。
  3. 在 UCSF Chimera 中可视化并分割 FVIII-LNT 体积。
    1. 在 UCSF Chimera 中打开步骤 3.2.5 生成的最终体积，在 TOOLS > VOLUME DATA > VOLUME VIEWER 选项中将等值面阈值设为 0.005。
    2. 在 TOOLS > VOLUME DATA > SEGMENT MAP 中，于 SEGMENT MAP 标签页选择体积，点击 SEGMENT 按钮进行体积分割。
    3. 通过按住 CTRL+SHIFT 并点击 group，将对应于一个晶胞的片段进行分组。
    4. 使用 ACTIONS > COLOR 选项按晶胞和螺旋对片段着色，以突出结构特征。

4. 电子断层扫描

  1. 负染色 FVIII-LNT 样品制备
    1. 按照冷冻电镜实验的方法制备 FVIII-LNT 样品。
    2. 将碳膜覆盖的 300 目铜网（碳膜面朝上）置于 O2 和 H2 混合气体中辉光放电处理 10 秒 ，功率为 50 W，操作同冷冻电镜实验。
    3. 向铜网上滴加 2.5 μl 含 6 nm 胶体金纳米颗粒的 FVIII-LNT 悬液，吸去多余液体后，加入 5 µl 1% 醋酸铀溶液进行负染 2 分钟。吸去多余染液后，将铜网自然晾干。
  2. 电子断层扫描数据采集
    1. 将铜网转移至单倾转样品台。
    2. 将样品台插入电子显微镜中。
    3. 使用 SerialEM 软件19自动采集倾斜系列图像，倾斜角度范围为 -60° 至 +60°，步长为 2°，采用 CCD 相机记录图像，有效放大倍数为 52,000X ，欠焦值为 -6 至 -10 μm，每张断层图像的电子剂量为 150 - 170 电子/Å2·s。
  3. FVIII-LNT 的电子断层扫描重构
    注：使用 IMOD 软件中的 ETomo 模块，按照以下教程对 4.2 节中获取的 pFVIII-LNT 和 hFVIII-LNT 倾斜系列图像进行重构：http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/etomoTutorial.html
    1. 通过终端窗口，使用 3DMOD 打开断层图像。http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html。
    2. 使用 IMOD 的 BINVOL 命令将断层图像进行 4 倍二值化降采样，以减小数据体积。
    3. 在降采样后的断层图像中，使用 IMOD 的 ROTATEVOL 命令选择合适的角度，将脂质纳米管沿 Y 轴对齐。
    4. 使用 IMOD 的 ROTATEVOL 命令对完整的断层图像进行旋转。
    5. 使用 IMOD 的 CLIP RESIZE 命令裁剪出沿 Y 轴取向的脂质纳米管区域。
    6. 使用 3DMOD 打开裁剪后的子断层图像。
    7. 点击断层图像，观察凝血因子 VIII 分子在 Z 轴切片方向及 Y 轴方向上的排列分布。

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结果

重组人和猪FVIII成功在带负电荷的单层双层LNT上呈螺旋状排列，模拟了活化血小板表面. 人和猪的FVIII-LNT的螺旋结构在所收集的数字显微照片中保持一致图 2).  对照LNT以及人和猪的FVIII-LNT螺旋管被选中，并使用e2helixboxer.py图形用户界面进行分割，随后通过e2workflow.py图形用户界面的单颗粒选项创建初始数据集（表1).

通过 EMAN2 软件中的 e2display.py 图形用户界面（GUI）对分类平均图像进行傅里叶变换，评估了膜结合型人源和猪源 FVIII-LNT 的螺旋有序性（图 3）。在最佳对照 LNT 的二维分类平均图像中，脂双层结构清晰可辨，内层和外层叶以及膜疏水核心的较低密度区域均清晰可见（图 3A）。朝向膜表面且垂直于膜表面的膜结合型人源和猪源 FVIII 分子的投影密度结构明确，清楚地显示了两种蛋白在螺旋组织结构...

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讨论

本研究提出一种方法，用于区分两种高度同源蛋白质在膜结合状态下的组装形式：在人体环境条件下，人源和猪源FVIII在脂质纳米管上的自组装结构。

在所述步骤中，人和猪的FVIII成功地在脂质纳米管上呈螺旋状排列，这是最关键的一步。下一步关键步骤是通过快速冷冻将样品保存在薄层非晶态冰中 接近液氮温度2 温度。将样品保存在非晶态冰和液氮温度下，可保持螺旋管的水合状态以及蛋白质-脂质大分子复合物的生理活性。最后的关键步骤是在接近液氮温度下获取足够数量和质量的冷冻电镜数据，以解析高分辨率的三维结构。在接近液氮温度下收集数据，还可进一步防止样品在显微镜高真空环境中的脱水以及电子束引起的辐射损伤。

为了计算FVIII的膜结合结构，第一步关键操作是通过应用无参考二维分类，获得均一的颗粒（螺旋片段）集合，并将具有相同直径和有序程度的类中的颗粒合并。第二步关键操作是为螺旋重构设定正确的初始体积以及螺旋参数...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益，有关本文发表的任何实验步骤均可直接联系作者。

致谢

本研究由美国心脏协会的国家科学家发展基金（10SDG3500034）以及德克萨斯大学医学分部（UTMB）-NCB为SSM提供的启动资金支持。作者感谢德克萨斯大学医学分部塞利结构生物学中心的冷冻电镜与科学计算设施（www.scsb.utmb.edu），同时感谢Steve Ludtke博士和Ed Egelman博士在二维和三维螺旋重构算法方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
JEM2100 配 LaB6JEOL 有限公司JEM-2100在 200 kV 下运行
配备 TEMCON 软件JEOL 有限公司
Gatan626 冷冻样品台Gatan 公司626.DH冷却至 -175 °C
配备温度控制器单元Gatan 公司
Gatan 4K x 4K CCD 相机Gatan 公司US40004,096 x 4,096 像素，物理分辨率为 15 μm/像素
Solarus Model 950 等离子清洗仪Gatan 公司
Vitrobot Mark IVFEI
碳膜覆盖的 300 目 3 mm 铜网Ted Pella01821高功率等离子清洗 10 秒
Quantifoil R2/2 300 目电子显微镜科学公司Q225-CR2碳膜覆盖的 300 目铜网，孔径为 2 mm 
乙酸铀酰二水合物Ted Pella194811% 溶液，经过滤
半乳糖基神经酰胺Avanti 极性脂质公司860546
二油酰基-sn-甘油磷脂酰-L-丝氨酸Avanti 极性脂质公司840035
电镜软件 Digital MicrographGatan 公司http://www.gatan.com/DM/
电镜软件 EMAN免费下载http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN/ 
电镜软件 Spider免费下载http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html
电镜软件 IHRSR免费下载程序可从 Edward H. Egelman 处获取 http://people.virginia.edu/~ehe2n/
电镜软件 (IMOD)免费下载http://bio3d.colorado.edu/imod/ 
电镜软件 (SerialEM)免费下载ftp://bio3d.colorado.edu/pub/SerialEM/
UCSF-Chimera免费下载http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html

参考文献

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