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利用热刺激和机械性伤害感受模式评估小鼠中吗啡诱导的痛觉过敏和镇痛耐受

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DOI：

10.3791/51264

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2014年7月29日

 ,  ,  , 
1Biotechnology and Cellular Signalling, UMR 7242 CNRS, Université de Strasbourg

本文内容

摘要

我们描述了一种用于研究小鼠中阿片类药物诱导的痛觉过敏和耐受性发展的方案。该方案基于对未受处理小鼠和经吗啡处理小鼠的热刺激和机械性伤害感受反应的测量，能够定量评估与长期使用阿片类药物相关的疼痛敏感性增加（痛觉过敏）以及镇痛效果的降低（耐受性）。

摘要

阿片类药物诱导的痛觉过敏和耐受性严重影响了阿片类药物在动物和人类中作为镇痛剂的临床疗效。这两种现象的分子机制尚不完全清楚，对其机制的阐明应得益于动物模型的研究以及适当实验方案的设计。

本文介绍了一种在野生型小鼠中诱导、记录和量化吗啡诱导性痛觉过敏以及证明镇痛耐受性的方法学方案，该方案采用尾浸入试验和尾部加压试验。如视频所示，该实验流程分为五个连续步骤。抓取与适应阶段有助于安全地测定动物的基础伤害感受反应。长期给予吗啡可导致显著的痛觉过敏，表现为热敏感性和机械敏感性均增强；而急性或重复使用吗啡后的镇痛作用时间进程比较则明确显示了耐受性的形成，其特征为镇痛反应幅度下降。本方案同样可适用于基因修饰小鼠，以评估单个基因在伤害感受及吗啡镇痛调节中的作用。此外，该方案还提供了一个模型系统，可用于研究潜在治疗药物在提升阿片类镇痛效果方面的有效性。

引言

阿片类药物诱导的痛觉过敏（OIH）和镇痛耐受限制了阿片类药物在动物和人类中的临床疗效1-3。目前研究正在探索促炎性4,5或促伤害性（抗阿片类）6,7系统在其中的作用。阐明OIH和耐受的机制需要结合体内和体外的研究方法，采用合适的动物模型、实验方案以及分子工具。

行为药理学是监测和量化实验动物（大鼠、小鼠）镇痛和痛觉过敏状态的主要范式。对动物方便操作的身体部位（如后爪、尾巴）施加有害刺激（热刺激、机械刺激或化学刺激），可引发伤害性防御性回缩反应，该反应易于评分。

本文提出了一种在野生型小鼠中诱导、记录和量化阿片类药物诱导的痛觉过敏（OIH）和耐受性的方法学方案，采用尾浸入试验和尾部加压试验。该方法可简便、灵敏且可重复地测定小鼠的热刺激和机械性伤害感受反应值。如视频方案所示，C57BL/6小鼠在长期给予吗啡后会出现显著的痛觉过敏，并持续数天。与未处理动物的基础值相比，其热刺激和机械性伤害感受阈值均显著降低。此外，本实验设计不仅可用于监测OIH的发展，还可同步观察吗啡镇痛效应的减弱（即耐受性）。已有数据支持痛觉过敏与耐受性可能涉及共同的细胞与分子机制8,9的观点，尽管该观点在文献中尚存争议1,10-12。最后，本方案也可类似地应用于基因修饰小鼠，以评估单个基因在疼痛调节中的作用。同时，该模型系统可用于评价潜在治疗药物增强阿片类镇痛效果的有效性。

方案

所有实验均严格遵循欧洲实验动物护理指南（European Communities Council Directive 86/609/ECC）以及清醒动物实验性疼痛研究的伦理指南13。雄性C57BL6/N Tac小鼠（10周龄，25–30 g）饲养于机构所属的动物设施中，由专业动物管理团队负责运营，确保符合环境标准。动物以群养方式饲养（每笼最多五只小鼠），在恒定温度（21 ± 1 °C）下维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期，并可自由获取食物和水。所有实验均在每天同一时间段（上午10:00至下午4:00）进行，使用一组16只小鼠完成。具体材料与设备见材料表。

监测吗啡诱导的痛觉过敏和耐受性的五步法

该方案在15天内分为五个连续的步骤（A-E）图1。

1. 小鼠操作（步骤 A；第 -7 天至第 -5 天）

  1. 操作小鼠并使其适应自由进入固定器。这一初步步骤可减少应激反应，从而避免与应激诱导的镇痛作用相混淆，同时让动物适应实验人员的操作以及被放入小鼠固定器的过程。每天对每只小鼠进行约5分钟的温和操作。

2. 基础伤害性感受反应（步骤 B；第 -4 天至第 -1 天）

  1. 使用尾浸试验（Tail Immersion Test, TIT）测量尾部回缩潜伏期：
    1. 将恒温器设置为 48 °C。
    2. 将小鼠轻轻放入固定器中。将其尾巴外露的2/3部分浸入水浴，同时启动计时器。
    3. 当小鼠将尾巴从热水中缩回时，立即停止计时器，并记录潜伏时间（单位：秒）。若未出现任何伤害性感受反应，则采用25秒作为截止时间，以防止组织损伤。
    4. 将小鼠放回笼中，然后测试下一只，直至完成全部系列。
    5. 以相同顺序对动物重复进行两次伤害感受反应测量。每只小鼠的伤害感受反应潜伏期（秒）取连续三次测定结果的平均值。
  2. 使用尾部压力测试（Tail Pressure Test, TPT）测量机械反应
    1. 将小鼠轻柔地放入固定器中，并将其尾巴置于镇痛仪的圆锥形探头下方。
    2. 踩下脚踏开关，对尾巴近端施加均匀递增的压力，直至出现首次伤害性反应（挣扎、吱叫）。当动物发生反应的瞬间，记录引发伤害性反应的当前力值（单位：克）。若动物未出现任何反应，则采用600克的截断值，以避免组织损伤。
    3. 在同一小鼠尾部的中段和远端重复此测量。每次对同一只小鼠进行测量时，应至少间隔30秒，以避免适应性或应激反应带来的偏差。测量完成后将小鼠放回笼中，随后测试下一只动物，直至完成整组实验。即 所有小鼠均进行测试。每只小鼠的伤害感受值（克）取三次测量的平均值。即 每只动物尾部的近端、中段和远端部分
  3. 在随后的几天（第-3天至第-1天）重复进行伤害性感受测试（步骤2中所述的所有操作程序）。

3. 吗啡镇痛作用的测定（步骤 C；d0）

  1. 确定最佳的动物组合，使得无论考虑哪种伤害性刺激模式（TIT 或 TPT），均可从中选出两组具有稳定且可比的平均伤害感受值的小鼠（每组 n=8）。该数值将作为后续“生理盐水”组和“吗啡”组的基线伤害感受反应参考值。
  2. 测量每只动物的体重。
  3. 用无菌生理盐水（0.9% NaCl）配制吗啡溶液（每毫升含 0.5 mg 吗啡），用于皮下注射（剂量为每公斤动物体重 5 mg 吗啡）。
  4. 在 TIT 上测定“生理盐水”组和“吗啡”组每只小鼠的伤害感受反应潜伏期（记为时间点 0）（执行上述 2.1 中所有步骤）；随后在 TPT 上测定伤害感受（执行上述 2.2 中所有步骤）。
  5. 分别对“吗啡”组和“生理盐水”组小鼠进行皮下注射：按每 25 g 体重注射 0.25 ml 的 0.5 mg/ml 吗啡溶液，或等体积的生理盐水（每 25 g 体重 0.25 ml）。
  6. 在给药后不同时间点（每隔 30 分钟）测定 TIT 和 TPT 上的伤害感受值（分别按照上述步骤 2.1 和 2.2 所述方法），以评估吗啡（5 mg/kg）诱导的镇痛效应：
    1. 注射后 30 分钟，使用 TIT 再次测定“生理盐水”组和“吗啡”组每只小鼠的伤害感受反应（单次测定），然后使用 TPT 测定。
    2. 随后在注射后各时间点（小时）：1、1.5、2、2.5、3 和 3.5 小时，测定所有小鼠在 TIT 和 TPT 上的伤害感受反应值。

4. 慢性吗啡处理 - 吗啡诱导的痛觉过敏（步骤 D；第1天至第6天）

  1. 第1天（d1）：
    1. 按照上述方法（步骤2.1和2.2）测量TIT和TPT上的伤害性反应值。仔细记录每只动物的缩足潜伏期和压力阈值。
    2. 按照步骤3.2所述，配制新鲜的吗啡溶液。
    3. 对整个“吗啡”组皮下注射吗啡（5 mg/kg 体重），对“生理盐水”组注射生理盐水（每25 g小鼠体重0.25 ml）。让动物休息至次日。
  2. 第2至第6天（d2、d3、d4、d5和d6）：重复第4.1节所述操作

5. 镇痛耐受性的证据（步骤 E；d7）

  1. 根据第3节中已详细描述的时间进程范式，评估吗啡诱导的镇痛作用。

6. 数据采集与统计分析

  1. 评估基础痛觉反应值（步骤 B）
    1. 针对每只动物（在 d-4 至 d-1 期间），分别计算“生理盐水”组和“吗啡”组中来自 TIT 和 TPT 的基础痛觉反应的平均值 ± 标准误（SEM）（n=8）。
    2. 将两组的基础痛觉反应平均值随时间（天）的变化绘制成图 图 2。
  2. 在 d0 天（步骤 C）和 d7 天（步骤 E）分析吗啡镇痛作用的时间进程
    1. 在每次注射吗啡后的各个时间点，分别计算每组中来自 TIT（单位：秒）和 TPT（单位：克）的痛觉反应平均值 ± 标准误（SEM）（n=8）。
    2. 将“生理盐水”组和“吗啡”组在第 0 天 图 3 和第 7 天 图 5 的痛觉反应平均值随时间变化绘制成图。
  3. 吗啡诱导的痛觉过敏发展（步骤 D）
    1. 在 d0 至 d7 治疗期间的每一天，分别计算“生理盐水处理”组和“吗啡处理”组中来自 TIT 和 TPT 的基础痛觉反应值的平均值 ± 标准误（SEM）（n=8）。
    2. 将“生理盐水处理”组和“吗啡处理”组的基础痛觉反应平均值随时间（天）的变化绘制成图 图 4。
  4. 镇痛耐受性的证据（步骤 C 和 E）
    1. 根据在 d0 天进行的吗啡时间进程实验 图 3，确定吗啡诱导最大镇痛反应所需的时间值（或时间范围）。
    2. 将该时间值（通常为 30 分钟）作为参考时间点，用于在 d7 天 图 5 评估痛觉基础水平（生理盐水处理组）以及急性吗啡给药后的实际镇痛反应（吗啡处理组）。
    3. 从 d0 和 d7 天进行的吗啡时间进程实验中，在生理盐水处理组和吗啡处理组于 30 分钟时间点采集的痛觉反应值，以柱状图形式展示 图 6。
    4. 统计学分析：采用单因素重复测量方差分析（ANOVA）。变异因素包括处理方式（组间因素）和时间（组内因素）。为分别检验各组内的差异，进行重复测量方差分析；组间比较则根据情况采用非配对 t 检验或配对 t 检验。
  5. 显著性水平设定为 P<0.05。所有统计分析均使用 STATview 软件完成。

结果

评估未处理小鼠的基础伤害感受值（步骤 B）

TIT 和 TPT 被依次应用于全部小鼠队列（n=16），以获得平均伤害感受反应值。通过优化动物组合，实现了最佳 事后 两组的定义（n=8）的小鼠，分别称为Saline组和Morphine组，两组均表现出相似且稳定的基线伤害性感受值 图2两组之间的等效性在任何伤害性刺激测试中均成立（TIT： 图2A；TPT： 图2B所选的）

第0天吗啡镇痛作用的时间进程（步骤C）

在 naïve 小鼠中，通过皮下注射（s.c.）吗啡（5 mg/kg）一次后，采用 TIT 图 3A 和 TPT 图 3B 评估其镇痛效果。在两项测试中，采用单因素重复测量方差分析进行统计分析，结果显示 TIT（F(7, 98) = 72，p<0.001）和 TPT（F(7, 98) = 31，p<0.001）的处理与时间之间存在显著交互作用。对 TIT 和 TPT 数据进行重复测量方差分析表明，生理盐水注射在 TIT 和 TPT 测试中均无显著效应（F(7, 49) = 0.49，p>0.05；F(7, 49) = 1.85，p>0.05）；而吗啡注射在小鼠中诱导出强烈的镇痛作用（TIT 测试：F(7, 49) = 92.46，p<0.001；TPT 测试：F(7, 49) = 34.37，p<0.001）。与注射生理盐水的对照组相比，吗啡在 TIT 测试中于 30 分钟时达到最大镇痛效果，在 TPT 测试中于 60 分钟时达到最大镇痛效果（p<0.001，非配对 t 检验）。

反复给予吗啡在小鼠中诱导痛觉过敏（步骤 D）

在每次生理盐水或吗啡给药前，每天测量基础痛觉阈值（见实验方案）。如图4所示，在为期6天的治疗期间，每日给予吗啡导致热刺激（F(7, 56) = 11.6，p<0.001，重复测量方差分析；图4A）和机械刺激（F(7,56) = 15.55，p<0.001，重复测量方差分析；图4B）的基础痛觉阈值显著且进行性降低。痛觉过敏发展迅速，在TIT检测中，从第1天起即出现显著差异（p<0.01，非配对t检验，与注射生理盐水的对照组相比）；在TPT检测中，从第2天起出现显著差异（p<0.05，非配对t检验，与注射生理盐水的对照组相比）。

慢性吗啡处理后第7天吗啡镇痛作用的时间进程（步骤E）

在第7天，对在7天期间（第0天至第6天）每天接受吗啡或生理盐水注射的小鼠进行检测，首先测定其基础痛觉敏感值，然后测定其对急性吗啡（5 mg/kg，皮下注射）的镇痛反应，结果见TIT 图5A 和TPT 图5B。与图4所示的痛觉过敏发展一致，长期接受吗啡处理的小鼠的基础痛觉敏感值（0时间点）显著低于生理盐水注射对照组小鼠（p<0.001，非配对t检验）。给予急性吗啡后，长期吗啡处理组的痛觉反应显著升高，但在TIT和TPT中仅在30分钟时略微超过生理盐水对照组的基础痛觉敏感值（p<0.01 和 p<0.05，非配对t检验， respectively），在TIT中60分钟时也略微超过（p<0.05；非配对t检验）。从吗啡处理后2小时直至实验结束，痛觉反应再次降至低于对照组小鼠的水平（p<0.001，非配对t检验）。

小鼠在慢性吗啡处理前（第0天）和处理后（第7天）对吗啡最大镇痛反应的比较。

伤害感受阈值数据如图所示 图6 来自中国台湾的 TITA）和 TPT（B在生理盐水或吗啡注射后30分钟进行，如图所示 图3 （第0天）和 5 （第7天）。在两种伤害性刺激测试中，与第0天的初始镇痛反应相比，经连续7天慢性吗啡处理后，小鼠的吗啡镇痛效应显著下降p<0.001 配对 t-测试）。这些数据表明，在疼痛过敏动物中确实产生了耐受性。

吗啡镇痛时间线；伤害性反应研究中镇痛和痛觉过敏阶段示意图
图1. 监测吗啡诱导的痛觉过敏和耐受性的五步实验流程。 该实验方案共分为五个连续步骤（A–E），总持续时间为15天。

比较生理盐水组和吗啡组的尾部回缩潜伏期及伤害性反应图。
图2. 基础伤害性反应值的确定（步骤B；第-4天至第-1天）。 对全部动物系列进行尾部浸入试验（TIT）（A）和尾部加压试验（TPT）（B），以评估其基础伤害性反应值。随后，将小鼠分为两组（n=8），分别称为“生理盐水组”和“吗啡组”，确保无论考虑何种伤害性刺激模式，两组的平均伤害性反应值均保持稳定且具有可比性。

Pain response analysis graph comparing saline vs. morphine; tail withdrawal and nociceptive response.
图3. 第0天TIT（A）和TPT（B）中吗啡镇痛作用的时间进程（步骤C）。 小鼠在单次注射吗啡（5 mg/kg，皮下）或生理盐水后，每30分钟测定一次基础痛觉反应值。数据以均值 ± 标准误表示。 n每组8只小鼠。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001，非配对 t与对照组相比进行检测。

显示生理盐水与吗啡治疗结果的尾部回缩潜伏期和伤害性反应图。
图4. 反复给予吗啡后痛觉过敏的发展（步骤D；第1至第6天）。 小鼠的基础伤害性反应值通过TIT (A) 和TPT (B) 在每日注射吗啡（5 mg/kg，皮下）或生理盐水前测定一次。数据以均值±标准误表示，每组 n=8 只小鼠。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，与生理盐水处理对照组相比，采用非配对 t 检验。

Pain response graphs: Tail withdrawal latency and nociceptive response vs. time under saline, morphine.
图5. 慢性吗啡处理小鼠在第7天（步骤E）的TIT（A）和TPT（B）中吗啡镇痛作用的时间进程。 从第0天到第6天持续接受吗啡（黑色圆点）或生理盐水（白色三角形）处理的小鼠，在第7天分别接受一次单独的吗啡（5 mg/kg，皮下注射）或生理盐水注射。在注射吗啡或生理盐水后每30分钟测定小鼠的伤害性反应。数据以均值 ± 标准误表示。 n每组8只小鼠。*P < 0.05, **P < 0.01，通过非配对检验 t与生理盐水处理对照组相比。误差线若未超出符号大小则隐藏。

慢性吗啡潜伏期、伤害性反应比较；柱状图；痛阈分析。
图6. 小鼠在慢性吗啡处理前（第0天）和处理后（第7天）对吗啡（5 mg/kg，皮下注射）最大镇痛反应的比较。 此处报告的数值来自图3和图5所示实验。在注射吗啡或生理盐水后30分钟，使用TIT（A）和TPT（B）测量伤害性反应值。数据以均值±标准误表示，每组n=8只小鼠。***P < 0.001，配对t检验。

讨论

关键步骤

伤害感受测量中动物模型的选择

小鼠品系间伤害感受和镇痛敏感性的差异已被研究（综述） 14-16) 使用多种疼痛模型进行评估，这些模型在病因（伤害性、炎症性、神经病理性）、刺激方式（热、化学、机械）、持续时间（急性、强直性、慢性）以及给药部位（皮肤、皮下、内脏）方面各不相同。与其他品系相比，C57BL/6J（“J”代表Jackson Laboratory）小鼠因其表现出较高的基础伤害感受敏感性，已成为疼痛研究中广泛使用的动物模型。17,18 对阿片类药物具有中等镇痛反应14,19长期吗啡处理后，它们也会产生显著的镇痛耐受性20,21，痛觉过敏21,22 和依赖性20,23.

本实验使用C57BL/6N Tac小鼠（“N”代表美国国立卫生研究院，“Tac”代表Taconic农场），该品系属于B6谱系中的一个独立分支。尽管长期以来C57BL/6小鼠被视为可互换使用，但近期研究指出C57BL/6J与C57BL/6N亚系之间存在显著的行为学差异24。特别是，三种C57BL/6N亚系（包括Tac亚系）对急性热痛刺激的敏感性较低，这一特性在检测该表型时可被视为一种优势。

选择雄性小鼠是因为使用小鼠作为动物模型的疼痛研究绝大多数都是在年轻的雄性个体上进行的25。在我们的实验中，从镇痛或痛觉过敏的角度观察，雄性小鼠能够提供稳健且可重复的数据。偶尔我们注意到，在TIT和TPT测试中，C57BL/6N品系雌性小鼠的反应变异性较大。尽管这一现象可能反映了与雌性激素状态相关的自然变异，但疼痛和镇痛中性别差异的总体机制仍存在争议。关于这一热点争论的某些方面，将在下一节“技术的局限性”中简要介绍。

动物适应

小鼠首先在动物房中适应一周时间。与其他行为学研究类似，实验在为期3天的适应期后进行（图1，步骤A）。由于伤害性刺激测试对压力敏感，初次测量的结果潜伏期可能长于后续测量，尤其是在未充分适应环境的小鼠中26,27。适应步骤还有助于在同一天内及不同天之间获得更稳定的伤害性反应数值（图2和 图4）。为了减少昼夜节律对伤害感受和镇痛敏感性的影响28,29，所有测试均在上午10:00至下午4:00之间进行。

伤害性感受测试的选择

伤害性感受测试采用热刺激、机械刺激、化学刺激或电刺激（综述 26,27,30。选择何种刺激至关重要，因为不同的伤害性感受模式可能通过不同的伤害感受器和神经纤维进行处理18,31,32。

我们选择了尾浸试验（TIT）33——D’amour 和 Smith34 开发的经典尾甩试验的一种改良版本——以及由 Randall 和 Selitto35 方法改进而来的尾压试验（TPT），作为研究吗啡诱导的小鼠镇痛、痛觉过敏及耐受性的热刺激和机械刺激模型示例。这两种试验在大鼠中已被广泛应用。为避免或降低组织损伤的风险，系统地设定了截止时间。

吗啡诱导的镇痛、痛觉过敏和耐受性

吗啡是典型的μ-阿片受体激动剂，因其在人类和小鼠中均具有强效镇痛作用并可诱导痛觉过敏，故被选用于本研究1,2,36。已知吗啡的镇痛效力随小鼠品系、给药途径和伤害性刺激方式的不同而有所差异。在C57BL/6小鼠中，皮下注射1–20 mg/kg剂量范围的吗啡通常可获得可靠的镇痛效果14,21。因此，我们选择研究单次皮下注射5 mg/kg吗啡后的急性镇痛效应，该剂量接近其基于热痛觉测定所得的ED50值（7–20 mg/kg）19,21。

反复给予吗啡通常伴随镇痛耐受（表现为剂量-反应曲线右移或镇痛反应幅度或持续时间降低）和痛觉过敏（表现为基础痛觉阈值降低，即对疼痛刺激的敏感性增强）。这两种不良现象的发生依赖于啮齿类动物品系、所选阿片类药物的性质及其剂量、治疗持续时间以及痛觉检测方式21。例如，研究耐受和痛觉过敏的实验范式包括每日给予高剂量且恒定（20至40 mg/kg/天）22或递增剂量（高达50甚至200 mg/kg）20,21的吗啡。在此基础上，我们通过连续8天每日皮下注射给予C57BL/6小鼠中等剂量吗啡（5 mg/kg）以诱导痛觉过敏和耐受的形成。选择该中等剂量而非更高剂量，旨在更好地模拟临床用药情况。

建立 TIT 操作窗口

TIT 实验中一个可能的缺陷可能与尾巴在啮齿类动物体温调节中的作用有关26,37。由于环境温度是影响伤害感受反应变化的关键因素，因此在整个实验过程中应保持恒定（此处为 21 °C）38。通常将热刺激强度设定为在 5 至 10 秒内检测到伤害感受反应27。事实上，过长的潜伏期可能会增加监测到与伤害性刺激无关的动物运动的风险，而过短的潜伏期则可能降低测试的分辨能力。我们以 48 °C 的固定温度进行 TIT 测量。尾部回缩潜伏期接近 9 秒（基础伤害感受值），并在 4 秒（痛觉过敏）至 25 秒（最大镇痛效应；截止时间）之间变化。除了实际操作上的原因外，在固定温度下测量伤害感受反应值可能先验地涉及相同类型的伤害感受器及其神经回路，从而有助于数据的解释。

可能的修改

镇痛和痛觉过敏测量中TIT操作窗口的优化

在关注镇痛反应时，较低的基线值（较高的热强度）可能有利于检测反应延迟。相反，为了评估疼痛刺激的后果或痛觉过敏现象（OIH）的发展，较高的基线值（较低的热强度；此处为 48 °C）可能有助于检测到更快的反应 图 4。

尽管我们发现5 mg/kg的吗啡剂量便于诱导显著的镇痛反应图3 ，并在重复给药后促进明显的痛觉过敏图4，但其剂量可根据前述内容进行调整（关键步骤：吗啡诱导的镇痛、痛觉过敏和耐受性）。例如，可使用较低剂量以降低镇痛幅度（从而避免达到截断值限制），而选择较高剂量则可加速痛觉过敏的发生并增强其幅度。

总体而言，应根据所研究小鼠的遗传背景优化“伤害性感受窗口”，并考虑不同类型的伤害性感受器及其神经回路可能参与其中的可能性。

替代性阿片类激动剂（芬太尼、瑞芬太尼）

尽管大多数临床使用的阿片类药物均以μ-阿片受体为靶点并作为激动剂发挥作用，但它们在药理学特性方面存在显著差异 体外 和 体内例如，瑞芬太尼和芬太尼与吗啡形成显著对比，表现为完全激动剂，并促进μ-阿片受体的内化39. 吗啡和芬太尼等阿片类镇痛药的半衰期在数小时范围内40，而瑞芬太尼的半衰期极短，仅为数分钟41在人类中，阿片类药物诱发的痛觉过敏（OIH）的最佳证据来自手术期间使用了阿片类药物的患者，包括瑞芬太尼等短效化合物2,42因此，芬太尼和瑞芬太尼在TIT和TPT范式下也可作为研究小鼠痛觉过敏和耐受性发展的有效工具。

阿片类药物诱导的痛觉过敏（OIH）的不同诱导方式（慢性 vs 急性给药）

在人类和动物模型中，无论使用极低剂量还是极高剂量的阿片类药物，均可观察到阿片类药物诱导的痛觉过敏（OIH）1,2。本文报道了小鼠在长期接受中等剂量吗啡治疗后出现的OIH。C57BL/6N小鼠需连续给药数天，方可观察到明确且可重复的痛觉过敏状态图4。每日注射吗啡可有效替换为植入式吗啡药丸：在移除药丸后，小鼠已出现热痛觉过敏和机械性异常性疼痛43。通过微型渗透泵输注阿片类药物是另一种可行方法44。在啮齿类动物中，采用模拟芬太尼在人类外科手术中使用的方案进行单次给药，也可诱导持久的痛觉过敏36,45,46。

技术的局限性

用于疼痛研究的动物物种与模型

对多种小鼠品系的比较研究表明，不同品系对疼痛刺激的伤害感受反应存在显著差异17,31,47，在连续4天吗啡治疗后的阿片诱导痛觉过敏（OIH）水平也存在差异22。动物模型（小鼠和大鼠）中疼痛信息处理与调节机制是否适用于慢性疼痛患者，仍是一个基本且尚未解决的问题。因此，在解释动物实验数据及其对人类的预测有效性时，应保持高度谨慎16。

疼痛与镇痛中的性别差异

大多数关于疼痛动物模型的临床前研究都是在雄性啮齿类动物上进行的16,25,48。尽管存在这种选择偏倚，但以往观点认为雄性对阿片类镇痛药的反应更佳49,50，比雌性更不易产生阿片类药物诱导的痛觉过敏51,52，且对吗啡镇痛作用的耐受性更强53（综述 54）。然而，关于伤害感受和镇痛药物疗效的性别差异并不能简单地归结为“一刀切”的模式。事实上，大量数据表明，多种变量可能影响性别差异的程度和方向，例如阿片类药物的疗效与选择性、伤害感受检测方法、遗传背景、年龄、性腺激素状态以及社会互动等48,54。在人类中，临床疼痛在女性中更为普遍，但这一现象是否真实反映了性别差异仍有争议48,55,56。例如，对五十项临床试验的综合分析显示，不同性别之间的镇痛特性无显著差异；而针对患者自控镇痛人群的荟萃分析则表明女性对阿片类药物的疗效显著更高57。这一发现与在啮齿类动物中观察到的结果形成明显对比，再次引发了关于这些差异来源的诸多疑问16,48,55,57。总体而言，镇痛效应中的性别差异确实存在，亟需进一步关注其潜在机制及临床意义。

关于伤害性感受测试

甩尾实验是一种脊髓反射，但可能受到脊髓上中枢的影响58。TIT在大鼠上相对容易操作，但在小鼠上则需要更高的操作技巧。一个潜在的难点是保持小鼠处于正确的体位，同时避免引起不必要的应激反应。该实验方案可根据动物群体的大小进行调整。当需要测定基础痛觉反应值时（先使用TIT，然后对整组小鼠使用TPT），16只动物（8只对照组和8只处理组）的数量较易管理。监测镇痛作用的时间进程需要制定精确的时间安排，并确定在规定的时间间隔内（此处为30分钟）能够完成测试的动物最大数量（先TIT，后TPT）。因此，可将整个动物群体划分为若干亚组，以便实验者遵守动力学时间限制。

该技术相对于现有/替代方法的重要性

大鼠与小鼠中的 OIH 比较

大鼠已被广泛用于研究急性或慢性阿片类药物给药后的阿片类镇痛作用、痛觉过敏及耐受性46,59-61。实际上，由于多种实际原因，大鼠在疼痛实验中可被视为优于小鼠的动物模型16,61。然而，直到最近，基因修饰大鼠的制备仍不是一项简便的技术。由于目前已拥有大量可用的基因修饰小鼠品系，本模型为研究众多单个基因在阿片类药物诱导的痛觉过敏（OIH）及耐受性发展中的作用提供了机会。

TIT 和 TPT 与其他伤害性感受测试的比较

TIT 是甩尾实验的一种变体，最明显的区别在于刺激部位。与辐射热不同，将尾巴浸入热水中会导致其温度快速且均匀地升高。与其他形式的热伤害感受测试（如热板实验或 Hargreaves 实验）相比，TIT 在不同个体之间以及同一受试个体内部均能提供较为可重复的结果。

TPT 是研究机械性伤害感受的一种非常流行的实验方法26,27,35，其可能涉及与 TIT 不同的伤害性感受纤维和分子换能机制32。该方法可提供快速且可靠的测量结果59，但要求实验人员具备一定的操作经验，并需要较大的动物样本量。除本研究中所用的镇痛仪外，还存在其他基于应变仪的替代方法或装置（综述 27）。TPT 更适用于研究机械性痛觉过敏，而 von Frey 纤维丝通常用于评估机械性异常性疼痛（综述 27）。

掌握此技术后的未来应用或发展方向

我们在此介绍的实验性OIH/耐受模型也可适用于转基因小鼠，以评估单个基因在疼痛调节中的作用。该模型还为研究潜在治疗药物缓解慢性疼痛的效果提供了一个系统平台。

披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

感谢 J-L. Galzi 博士（法国伊尔基希，CNRS UMR7242）提供的支持。

本工作由法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）、斯特拉斯堡大学、阿尔萨斯生物谷，以及Conectus、法国国家科研署（ANR 08 EBIO 014.02）、阿尔萨斯大区议会（Pharmadol）、斯特拉斯堡城市共同体（Pharmadol）、ICFRC（Pharmadol）、OSEO（Pharmadol）和企业总署（Pharmadol）的资助项目共同支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C57BL/6N Tac 小鼠Taconic，丹麦里厄C57BL/6N Tac B6-M雄性小鼠（25–30 g）
盐酸吗啡Francopia，法国巴黎CAS 号：52-26-6需特殊许可方可获取
注射器（Terumo）Dutscher，法国布鲁马特050000聚丙烯材质，无菌，容量：1 ml
针头（Terumo）Dutscher，法国布鲁马特05010126 G ½（Terumo 货号：NN2613RO1）
小鼠固定器自制两个金属网格（5 × 11 cm），用胶带和订书钉组装而成
恒温水浴槽 GR150Grant Instruments，英国剑桥GP 0540003
镇痛仪Panlab，西班牙巴塞罗那LE 7306
Kaleidagraph 软件Synergy Software，美国宾夕法尼亚州雷丁Kaleidagraph 4.03 科学绘图
STATview 软件免费下载，用于统计分析

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利用热刺激和机械性伤害感受模式评估小鼠中吗啡诱导的痛觉过敏和镇痛耐受
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