本方案描述了利用左前降支动脉（LAD）90分钟闭胸冠状动脉球囊阻塞并随后进行再灌注的方法，建立猪心肌梗死（MI）模型。此外，还介绍了多种结局参数的检测方案，包括心脏功能、血流动力学、微血管阻力和梗死面积。
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摘要
摘要
将新发现的心血管治疗手段推进至首次人体试验，依赖于严格规范的伦理与法律路径。其中一个重要的先决条件是，充分理解在大型动物模型中获得的全部安全性和有效性信息，这些信息需能有效反映人类心肌梗死（MI）的情况。猪在此方面被广泛应用，因其心脏大小、血流动力学及冠状动脉解剖结构与人类相近。本文介绍了一种有效的实验方案，采用闭胸状态下对左前降支动脉（LAD）进行冠状动脉球囊闭塞并随后再灌注，建立猪心肌梗死模型。该方法基于90分钟的心肌缺血，可诱导左心室前壁、室间隔及下后间隔区域的大面积梗死。此外，我们还提供了多种结局评估方法的方案，可提供关于心脏的广泛信息，包括心脏收缩与舒张功能、血流动力学、冠状动脉血流速度、微血管阻力以及梗死面积。该方案可灵活调整，以满足在不同阶段验证新型心肌再生生物制剂的需求（即在急性缺血损伤后立即进行、亚急性期，甚至在瘢痕形成完成后的慢性心肌梗死阶段）。因此，该模型为研究心肌梗死、继发的不良心室重构以及新型心肌再生药物的潜力提供了一个有价值的转化研究工具。
引言
急性心肌梗死（AMI）及其长期后遗症（如慢性心力衰竭，CHF）严重影响患者的预后和生活质量，更不用说对现有医疗资源造成的巨大经济负担1。据估计，西方国家慢性心力衰竭的患病率为1%–2%，其中约60%的病例由急性心肌梗死作为首要病因所致2。仅在美国，2008年就有约570万患者患有慢性心力衰竭，每年医疗费用约为300亿美元，预计到2030年这一费用将增至每年970亿美元，达三倍之多1。综上所述，这些数据强烈支持开发新型心脏再生疗法，而为了实现快速转化，必须依赖一种可重复、可靠且能准确模拟人类疾病情况的大型动物心肌梗死模型。
猪（Sus scrofa）在心血管研究中越来越多地用于药理学和毒理学测试3。作为转化研究工具，其成功的关键特征之一在于其心脏功能和解剖结构与人类心脏高度相似4,5。例如，猪的心脏与体重比、心脏大小以及冠状动脉的解剖分布均显示出与人类极为相似的特点4。此外，心肌细胞的代谢、电生理特性以及对缺血性损伤（如急性心肌梗死，AMI）的反应也被报道与人类情况高度一致6,7。最终，为了满足上述标准，需要一种标准化的心肌梗死（MI）模型，以产生稳定且可持续的MI，用于研究性新药（IND）的测试。本文介绍了一种标准化模型，该模型采用经胸冠状动脉球囊闭塞左前降支（LAD）90分钟，随后进行再灌注，从而在左心室的前尖壁、室间隔壁和下间隔壁形成可重复的心肌梗死。
方案
所有体内实验均依照由实验动物资源研究所编制的《实验动物护理与使用指南》进行。实验已获得当地动物实验委员会的批准。
1. 药物、麻醉、静脉通路及插管
- 药物与麻醉
- 预用药
- 术前10天开始给予胺碘酮150 mg/kg，以预防心律失常。从手术当天起至第28天，继续以100 mg/kg的剂量给予胺碘酮。自第29天起将剂量减至50 mg/kg，并持续给药至研究结束。
- 开始抗血小板治疗，1 mg/kg 从术前第3天开始停用氯吡格雷，并持续4.5天 mg/kg 乙酰水杨酸，术前1天开始。继续使用氯吡格雷 1 mg/kg/天，以及乙酰水杨酸 80 mg/天。
- 手术前1天开始使用芬太尼透皮贴剂进行镇痛，70 kg左右的猪使用25 μg/hr剂量。芬太尼透皮贴剂持续使用24小时 术后确保给予充分的镇痛药物。同时，每日监测是否存在可能不适的迹象（即 行为、呼吸、步态、活动能力 等等。以增加止痛药物的使用。
- 禁食动物 12 小时 hr，保持无限量供水。
- 麻醉
- 为避免造成不必要的应激和不适，应在猪的圈舍内通过肌肉注射给予混合药物以进行镇静，药物成分为：咪达唑仑 0.4 mg/kg、氯胺酮 10 mg/kg 和阿托品 0.014 mg/kg
- 通过使用18 G静脉导管穿刺耳缘静脉建立静脉通路。经静脉注射5 mg/kg硫喷妥钠诱导麻醉，并给予1,000/100 mg阿莫西林/克拉维酸以预防感染。术后第二天，猪将接受1,000/100 mg阿莫西林/克拉维酸作为抗生素治疗。
- 使用气管插管（对于体重约70 kg的猪，选用8.5号导管）对猪进行插管。必要时以每分钟12次的频率进行球囊通气，并将猪转运至手术室。
- 到达手术室后，立即使用 FiO₂ 开始机械正压通气2 0.50，潮气量 10 ml/kg，呼吸频率 12 次/分，并持续进行呼气末二氧化碳监测。
- 通过持续静脉输注咪达唑仑 0.5 mg/kg/hr、舒芬太尼 2.5 microg/kg/hr 和泮库溴铵 0.1 mg/kg/hr 的组合药物，开始实施平衡麻醉。 在整个手术过程中，持续监测心电图、动脉血压、体温和二氧化碳监测，以评估麻醉深度。例如，若出现窦性心动过速，应检查镇痛药物和/或麻醉是否充分。
- 灌注 4.3 500 ml 6% 葡萄糖静脉注射液中加入胺碘酮 mg/kg，静脉输注。
- 通过5导联心电图监测心律。
- 剃除颈部和后肢区域的毛发并清洁该区域。
- 插入导尿管。
- 预用药
2. 经胸超声心动图
- 将动物置于右侧卧位。在长白猪等品种（如达尔兰猪）中，仅可获取胸骨旁切面（长轴和短轴）。由于胸廓的形态，无法获取心尖切面。
- 以二维（B模式）获取胸骨旁长轴切面图像，并在M模式下测定左心室舒张末期和收缩末期的内径。
- 保持超声探头位于胸骨旁位置，顺时针旋转90°，以获取二尖瓣、乳头肌及心尖水平的左心室短轴切面图像。乳头肌和心尖的短轴切面可能需要将超声探头较二尖瓣短轴切面位置下移一至两个肋间隙。
3. 外科准备与血管通路
- 用2%碘溶液消毒手术区域，并使用无菌手术单覆盖猪的非无菌部位。
- 在颈部做正中切口。穿过白线以尽量减少肌肉损伤，并钝性分离至气管旁的颈总动脉和颈内静脉。
- 仔细分离颈总动脉和颈内静脉，确保迷走神经未受损伤。在两根血管周围分别放置Vicryl 2-0缝线以控制血管。采用Seldinger技术，通过置入8F鞘管进入颈内动脉以建立动脉通路。将鞘管固定于动脉上，注意缝线不要完全闭塞动脉。静脉通路可通过Seldinger技术在颈内静脉置入9F鞘管获得。在固定鞘管前，需确保静脉已结扎。 alternatively，也可使用股动脉建立动脉通路。
- 鞘管插入后立即给予100 IE/kg肝素，以抑制血栓形成。
- 为获得稳定且持续的动脉压测量，可在后肢某条较小动脉上方做小切口， cannulate该动脉。动脉位于皮下浅层，可通过皮肤触及其搏动。将动脉从周围组织中分离出来，在血管周围放置两根Vicryl 2-0缝线，近端和远端各一根。结扎远端后，插入18 G静脉留置针，并牢固连接测压装置。
4. 有创压力-容积环分析
- 通过先前置入的鞘管，经颈内静脉插入Swann-Ganz导管（SG）。
- 将心输出量监测设备连接至SG导管末端的近端腔。
- 向SG近端管腔注入5 ml 0.9%生理盐水，测量心输出量；重复该操作三次，取指数平均值。
- 使用先前测定的心输出量对脉搏波速度（PV）系统进行校准。
- 插入7F导管导纳导管 通过 在荧光透视引导下将导管经颈动脉插入左心室。
- 选择左心室中最大的节段进行容积测量，并在屏气状态下进行基线扫描。
- 容积校准完成后，在屏气状态下记录10-15次心跳。
- 在荧光透视引导下，移除SG，并将球囊导管置入下腔静脉的膈肌水平。
- 通过在屏气状态下充盈球囊以减少前负荷，并记录相应的压力-容积环（PV-Loops）。
5. 冠状动脉内压力与血流测量
- 将硝酸甘油稀释至浓度为 100 μg/ml，腺苷稀释至浓度为 30 μg/ml。
- 将8F指引导管置于左冠状动脉开口。
- 将压力/血流联合导丝置入左冠状动脉近段。
- 冠状动脉内给予200 μg硝酸甘油，并将导丝测得的远端压力（Pd）与动脉压力进行校准归零。
- 将导丝置于前降支中段。
- 开始测量基础状态下的压力和血流。通过冠状动脉内注射60 μg腺苷诱发充血，随后用2 ml生理盐水冲洗，测量充血状态下的压力和血流。等待血流恢复至基础水平后，重复测量两次。
- 再次冠状动脉内注入200 μg硝酸甘油，并对左回旋支冠状动脉重复步骤1.6和1.7。
6. 心肌梗死的诱导
- 使用静脉鞘将心内除颤导管置入右心室。远端电极应位于心室心尖部，近端电极位于心房和/或上腔静脉。
- 在正位（AP）和左前斜30°（LAO 30°）投照下测量第二对角支（D2）远端前降支（LAD）的直径。
- 根据D2远端LAD的直径选择合适尺寸的血管成形术球囊（图1）。
- 将导丝经指引导管送至前降支远端。
- 沿导丝推送球囊导管，将球囊置于D2远端位置。
- 给予肝素30 IE/kg。
- 充盈球囊，直至压力达到前降支右侧直径对应的数值。
- 通过血管造影确认前降支完全闭塞（图1）。
- 用无菌手术巾覆盖无菌操作区域及颈部切口部位，暴露胸部，以便进行胸外按压或经胸除颤。
- 在接下来的90分钟内持续监测球囊压力，必要时重新充盈以维持压力。
- 如发生心室颤动：
- 立即以每分钟100次的频率开始胸外按压。
- 静脉快速推注胺碘酮300 mg（约1分钟内完成）。
- 启动心内除颤，给予50 J电击。
- 若连续5次电击无效，重新开始胸外按压，将心内除颤转为经胸除颤，使用150 J电击；若仍未成功，改为200 J电击。
- 必要时追加胺碘酮150 mg和/或肾上腺素1 mg；如需重复使用肾上腺素，可每3–5分钟给药一次，最多两次。
- 持续进行胸外按压，并交替实施经胸除颤。
完成手术操作（用于长期随访）
- 90 分钟后通过血管造影检查左前降支（LAD）是否仍完全闭塞。
- 再次给予 30 IE/kg 肝素，然后放气球囊。检查是否实现再灌注。将已放气的球囊连同引导导管一并从颈动脉鞘中移出。
- 小心移除动脉鞘，并立即使用吻合钳夹闭颈动脉（图 1）。采用连续缝合（6-0 Prolene 缝线）关闭颈动脉。松开钳夹后检查有无渗漏。
- 移除内置除颤导管，并从颈内静脉拔出鞘管。在鞘管入口近端进行结扎。
- 使用 2-0 Vicryl 缝线分两层缝合颈部皮下组织和皮肤。
7. 心脏磁共振成像
- 将动物仰卧位头先进置于磁共振成像（MRI）检查台上，并持续麻醉。
- 在动物胸部放置专用的相控阵心脏线圈。
- 为进行图像规划，获取短轴和两腔心长轴视图的定位像。
- 采集心电门控的稳态自由进动（SSFP）电影序列，包括从左心室心尖至基底部的短轴视图及两腔心长轴视图。
- 静脉推注双倍剂量的钆对比剂后15分钟，可采用反转恢复三维快速梯度回波技术获取晚期钆增强（LGE）图像。
- 使用经过验证的软件对功能参数进行离线分析，评估左心室射血分数（LVEF）、左心室质量、舒张末期容积、收缩末期容积、每搏输出量、心输出量以及瘢痕质量。
8. 研究结束与梗死面积
- 在研究结束时，按照方案1-5和方案7获取随访测量数据。
- 从胸骨上切迹下方至剑突下方稍低处做一长度为30–40 cm的正中切口。沿白线逐层深入，直至胸骨。切开剑突，并谨慎使用克林根贝格剪刀将胸骨后方与心包分离。使用剪刀进行钝性分离后，继续进一步分离。行胸骨正中切开术， 例如 使用锤子和Lebsch刀。通过在骨髓上涂抹骨蜡来减少骨髓出血。使用胸骨牵开器打开胸腔。
- 进入第3肋间间隙，在纵隔内定位下腔静脉。
- 在深度麻醉下通过切断下腔静脉人道处死动物。使用吸引装置清除血液。将9 V电池置于心尖以诱发心室纤维性颤动。
- 心脏切除后，从心尖至基底部将左、右心室各切成五个切片，置于37 °C、含1%氯化三苯基四氮唑的0.9%生理盐水中孵育15分钟。随后用0.9%生理盐水冲洗切片，并对两面进行拍照记录。
结果
死亡率和梗死面积
在本中心，接受该心肌梗死（MI）方案的32只猪（雌性达兰德长白猪，6月龄，约70 kg）中，有5只（15.6%）因缺血期间发生难治性心室颤动而死亡。该方案产生的梗死区约占左心室的10–15%，位于前间隔、间隔和下间隔壁（图2A）。若需对梗死面积进行连续无创评估，可采用心脏磁共振成像（CMR）上的延迟钆增强（LGE）技术，以随访非存活梗死区域的变化情况（图2B）。
心脏功能与重构
心肌梗死（MI）后四周，反映心脏功能的整体和局部参数应较健康基线值下降。具体而言，左心室射血分数（LVEF）在心肌梗死后四周应降至约35-45%。除整体收缩功能外，还可测量多项反映心肌梗死后不良重构的参数，例如通过心脏磁共振（CMR）和超声心动图评估左心室形态和直径（图3A和3B）。心肌梗死后四周，舒张末期容积（EDV）增加作为不良重构的标志，亦可被观察到（图3A和3B）。
冠状动脉血流与压力参数
血管生成和新毛细血管的形成通常被视为缺血性心脏病治疗的重要目标8。微血管阻力的评估可间接基于冠状动脉内压力与血流速度的联合测量。在正常条件和最大充血状态下具有代表性的压力和血流速度测量结果如图4所示。心肌梗死（MI）后四周，梗死相关冠状动脉（LAD）的充血期微血管阻力应较基线情况升高8。
图1. 基于LAD球囊闭塞的MI模型。（A）标准手术器械，包括：1）巾钳；2）蚊式钳；3）解剖镊；4）圆形容器；5）持针器（精细和粗糙）；6）Klinkenberg剪刀；7）解剖剪刀（直型和弯型）；9）镊子（De-Bakey型，精细和粗糙）；10）软管夹；11）吻合夹；12）纱布；13）电外科笔；14）手术刀柄；15）Dreesman吸引器；16）拉钩；17）灯架。（B）LAD和LCX的左前斜位透视图像。（C）在观察到第二对角支后，将球囊上的两个不透射线标记（见插图，黑色箭头）置于D2远端。充盈球囊，并通过造影剂注射确认冠状动脉血流成功阻断（见星号）。右心室内可见心内除颤导线（见白色箭头）。LAD表示左前降支动脉；LCX表示左回旋支动脉；LAO表示左前斜位；AP表示前后位；D1表示第一对角支；D2表示第二对角支。点击此处查看高清图像。
图 2. 心肌梗死后梗死面积。（A）左前降支（LAD）球囊闭塞 90 分钟导致广泛的心肌损伤和瘢痕形成（白色区域），在随访 1 个月时通过 TTC 染色可见。（B）梗死分布示意图显示，梗死区域位于心脏的前壁、前间隔和下间隔节段。（C,D）短轴和长轴的延迟钆增强心脏磁共振（CMR）图像显示，广泛的梗死瘢痕（高信号，见黑色箭头）定位于心脏的前壁、前间隔和下间隔节段。LGE-CMR 指延迟钆增强心脏磁共振成像。比例尺为 3 cm。点击此处查看高分辨率图像。
图 3. 缺血性心肌梗死模型中心脏功能的评估。 （A）舒张末期和收缩末期的代表性心脏磁共振（CMR）电影序列图像，显示梗死瘢痕节段的功能受损。（B）通过超声心动图获得的二维胸骨旁长轴 M 型图像，显示心肌梗死后 1 个月左心室扩张（LVIDd 增加）以及功能受损（室间隔无增厚现象）。EDV 表示舒张末期容积；ESV 表示收缩末期容积；LVIDd 表示舒张期左心室内径，LVIDs 表示收缩期左心室内径。 点击此处查看高分辨率图像。
图 4. 冠状动脉内压力与血流速度衍生参数。 使用 Combowire 进行冠状动脉内压力与血流速度记录，显示（A）心肌梗死（MI）前的参考值，对充血具有明显反应（黑色箭头）。（B）心肌梗死后1个月，梗死相关动脉（LAD）的冠状动脉血流速度充血反应降低（黑色箭头）。因此，由压力和血流速度衍生的参数，如充血微血管阻力（HMR）或冠状动脉血流储备（CFR），较基线水平下降。bAPV 表示基础平均峰值速度；pAPV 表示充血期平均峰值速度；CFR 表示冠状动脉血流储备；HMR 表示充血微血管阻力。 点击此处查看高清图像。
图5. 不同研究设计的概述。（A）利用该左前降支心肌梗死（LAD MI）猪模型在不同心肌梗死（MI）阶段验证研究性新药（INDs）的多种可能研究设计示意图。根据所研究的MI特定阶段，可在治疗分组前进行功能分析，作为基线值以及风险区域评估。点击此处查看大图。
讨论
左前降支（LAD）冠状动脉内球囊阻断可提供一种可重复且稳定的心肌梗死（MI）临床前猪模型，可用于评估新型心血管疗法的安全性和有效性，该模型能紧密模拟人类临床情况。如图5所示，所介绍的缺血/再灌注梗死模型为研究心肌梗死的不同阶段及梗死后心室重构提供了平台，同时确保两种情况下的初始缺血/再灌注损伤保持一致。
本方案的成功实施依赖于心肌缺血阶段，这是整个方案中最关键的环节。将球囊准确放置于左前降支第二对角支远端，对于实现理想的梗死面积同时确保较高的存活率至关重要。基于该心肌梗死模型，观察到约15%的死亡率，而心脏前壁、室间隔及下壁的中段和心尖段出现广泛梗死，这在心脏磁共振成像（CMR）和三苯基四氮唑（TTC）染色中均可见（图2A和2B）。缺血持续时间可根据所需的梗死面积进行调整。尽管本方案使用了长白猪，但小型猪（例如哥廷根小型猪）通常需要更长的心肌缺血时间（例如 150分钟闭塞）。
在临床前和临床心肌梗死（MI）研究中，结局分析通常基于左心室射血分数（LVEF）。尽管较低的LVEF已明确与心血管死亡风险升高相关，但其仍受前负荷等血流动力学参数的影响9。可以认为，鉴于左心室（LV）平均仅有10-15%发生梗死，将LVEF作为左心室收缩功能的整体性指标存在若干概念和实践上的局限性，因其无法反映局部功能的改善10。因此，本模型中所采用的结局评估指标揭示了心肌梗死及梗死后心室重构的不同方面，从而为研究人员提供了在多个层面上准确评估新疗法疗效的手段。
为了优化从临床前模型到临床实践的转化，我们选择使用大型猪而非小型猪。血流动力学测量、药物剂量和外科器械均可与临床实践直接互换。与小型猪相比，大型猪的体重增长相对较多。这可能在长期随访中对连续结果的可比性造成问题。6月龄的雌性达尔兰德长白猪体重约为70 kg。为防止随访期间体重过度增加，动物需采用限制性饮食。猪每天两次接受750 g定制的低热量饲料（成分：蛋白质15.6%、脂肪2.0%、纤维14.8%、灰分8.8%、钙0.9%、磷0.57%、镁0.29%、钾0.18%），在4周内体重增加约10 kg。
McCall 及其同事此前已发表过一种类似的猪心肌梗死实验方案11。本方案与他们的方案存在显著的相似之处，均强调优先选择前降支冠状动脉（LAD），而非左回旋支动脉（LCX）或右冠状动脉（RCA）。根据我们的经验，使用 LCX 时左心室总体梗死面积较小，而 RCA 梗死则更容易伴随不必要的传导障碍（即 窦房结功能障碍、房室结功能障碍）。两种方案之间的一个差异在于本方案采用了增强的药理学血小板抑制策略，因为我们观察到，在冠状动脉阻塞后90分钟止血过程中，由于血栓形成导致无复流现象的发生率较高。这一观察结果与已知的猪体内高凝状态相符12。尽管 McCall 提出使用单次高剂量静脉推注肝素，但本方案则依赖于在整个手术过程中分次给予多个较低剂量的肝素，以尽量减少血栓相关并发症。
综上所述，我们提出了一种猪的心肌梗死模型，该模型使研究人员能够利用一种有效、可重复且尤其具有实用性的大型动物人类疾病模型，作为开展首次人体临床试验之前研究新型治疗方法的关键步骤。
披露
本工作由 HGG Group BV（SK）和“Wijnand M. Pon Stichting”基金会（SC、SK）资助。该研究是生物医学材料研究所项目 P1.04 SMARTCARE 的一部分，由荷兰经济事务、农业与创新部共同资助（SJL、JG）。所有作者均报告无任何关系需要披露。
致谢
感谢 Cees Verlaan、Joyce Visser、Merel Schurink 和 Grace Croft 在动物实验中提供的出色技术支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.9% 生理盐水 | Braun | ||
| 6-0 Prolene | Ethicon | ||
| 乙酰水杨酸 | Ratiopharm | 80 mg | |
| 腺苷 | Apotheek UMCU | 3 mg/ml | |
| AdVantage PV 回路系统 | Transonic Science | ||
| 胺碘酮 | Cordarone I.V. (Sanofi) | ||
| 盐酸胺碘酮 (PCH) | |||
| 阿莫西林/克拉维酸 | Sandoz | 500/50 mg | |
| 硫酸阿托品 | PCH | 0.5 mg/ml | |
| 骨蜡 | Syneture | ||
| 心脏除颤器 | Philips | ||
| 氯吡格雷 | Apothecon B.V. | 氯吡格雷 75A | |
| 造影剂 | Telebrix | ||
| 气管插管 | Covidien | ||
| 芬太尼透皮贴剂 | Durogesic (Janssen-Cilag) | 25 μg/hr | |
| Fogarty 导管 | Edwards Life Sciences | ||
| 钆喷酸 | Gadovist | ||
| 导丝 | Abbott | ||
| 肝素 | Leo | ||
| 静脉套管 | Abbocath (Hospira Venisystems) | ||
| 碘 | Jodiumtictuur 2% (Eurovet) | ||
| 氯胺酮 | Narketan 10 Vétoquinol | ||
| 咪达唑仑 | Actavis | 5 mg/ml | |
| 硝酸甘油 | Pohl Boskamp | 1 mg/ml | |
| 泮库溴铵 | 2 mg/ml | ||
| Seldinger 血管鞘 8F | Arrow | ||
| 舒芬太尼 | Sufentanil-Hameln | 50 μg/ml | |
| Swann-Ganz 导管 | Criticath ref 680078 (Argon) | ||
| 头孢喹肟 | Pfizer | 250 mg | |
| 四极导管 | Transonic Science | ||
| 硫喷妥钠 | Inresa | 0.5 g | |
| 氯化三苯基四氮唑 | Merck | ||
| Venofundin | Braun | ||
| Vicryl 2-0 | Ethicon | ||
| Volcano ComboMap 系统 | Volcano |
参考文献
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs
Posted by JoVE Editors on 9/01/2014. Citeable Link.
A correction was made to Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs. An author's middle initial was omitted at publication.
The author's name was updated from:
Sanne Jansen of Lorkeers
to:
Sanne J. Jansen of Lorkeers
