啮齿类动物深部脑刺激联合同步功能性磁共振成像

摘要

本方案描述了一种在啮齿类动物中同时进行功能性磁共振成像与深部脑刺激的标准方法。结合使用这两种实验工具，可探索几乎任意脑区靶点在接受电刺激后所引发的全脑范围内的下游活动响应。

摘要

为了可视化深部脑刺激（DBS）在不同靶点引起的全脑及下游神经元反应，我们建立了一种利用血氧水平依赖性（BOLD）功能磁共振成像（fMRI）对啮齿类动物进行同步DBS成像的实验方案。DBS-fMRI面临多项技术挑战，包括电极植入的准确性、电极引起的磁共振伪影、麻醉剂和麻痹剂的选择（需在消除动物运动的同时最小化对神经元活动的影响），以及生理参数的维持（其偏离可能干扰BOLD信号）。 本实验室已开发出一系列能够克服上述大多数问题的操作流程。在电刺激过程中，采用自制的钨合金双极微电极，通过立体定位法将其植入麻醉状态下的动物刺激靶点。在成像准备阶段，将啮齿类动物固定于塑料头件上，并转移至磁体孔道内。扫描期间，持续输注右美托咪定与泮库溴铵的混合制剂，并辅以最低剂量的异氟烷，该方案可最大程度减少挥发性麻醉剂对BOLD信号的天花板效应。在本示例实验中，对丘脑底核（STN）的刺激引发的BOLD反应主要出现在同侧皮层区域，集中于运动皮层。同步进行的DBS与fMRI技术能够明确揭示神经环路的调控效应，该效应依赖于刺激部位和刺激参数，并允许无区域偏倚地观察神经元活动的调制情况。该技术可用于探索在几乎任意脑区调控神经环路所产生的下游效应，对实验性与临床DBS研究均具有重要意义。

引言

确定神经环路活动的全局下游效应，是系统神经科学多个领域面临的一项重大挑战和目标。目前可用于满足这一需求的工具十分有限，因此迫切需要提高相应实验装置的可及性。 评估神经环路激活全局效应的一种方法，依赖于深部脑刺激（DBS）与功能磁共振成像（fMRI）的同步应用。DBS-fMRI 能够在大空间尺度上检测环路激活的下游反应，并可几乎应用于任意刺激靶点。该技术组合非常适用于转化型临床前研究，包括对治疗性高频刺激反应的表征。

除了需要具备合适的MRI扫描仪外，成功的DBS-fMRI实验还需考虑多个变量，包括电极类型、镇静方法以及生理参数的维持。 例如，电极的选择应基于与刺激效果相关的因素（如. 导线尺寸与导电性、单极与双极模式），以及磁共振兼容性和电极伪影的大小。电极伪影的大小取决于电极材料和尺寸，也受所用扫描序列的影响；因此应在实验前进行充分测试，以确定每项研究适用的电极类型。通常建议本方案采用钨丝微电极。应选择适当的麻痹剂和镇静剂，以有效固定动物体位，并减少某些镇静剂对血氧水平依赖（BOLD）信号的抑制作用。 最后，维持动物处于最佳生理状态至关重要，包括体温和血氧饱和度的稳定。

我们为DBS-fMRI开发的实验方案克服了上述诸多潜在障碍，在实际操作中能够提供可靠且一致的结果。 此外，这些实验步骤也可轻松应用于fMRI与其它刺激方法的结合，包括光遗传学刺激。 

方案

伦理声明：本实验程序遵循美国国立卫生研究院动物研究指南（《实验动物护理和使用指南》），并已获得北卡罗来纳大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 电极植入

第一步是电极植入。在此步骤中，将电极单侧植入丘脑底核（STN），丘脑底核是一个在帕金森病治疗中具有转化意义的小核团，采用以下方法进行植入：

1. 使用高压灭菌器对所有手术器械进行灭菌；若无法进行高压灭菌，则使用抗菌溶液（例如 以确保电极无菌。 注意：这是一项短期存活手术，因此无菌操作技术至关重要。术后动物可在短暂恢复期（48小时）后进行成像，也可在数周内进行。
2. 使用经气管插管和小动物呼吸机给予的2.5%异氟烷麻醉大鼠（成年Sprague-Dawley大鼠，250–400 g）。将大鼠固定于立体定位手术架上，并采用无菌技术准备手术区域。
3. 准备并确保电极无菌。本实验使用自制的双通道钨丝微电极，但许多与磁共振成像兼容的电极类型均可适用。所使用的电极类型可能影响手术造成的组织机械损伤范围、刺激区域以及植入的准确性，从而影响整体实验结果。若电极无法进行高压灭菌，请尽可能使用聚维酮碘消毒剂对电极进行消毒。
4. 使用剪刀切除植入部位直径约1.5 cm范围的头皮，暴露颅骨上的前囟（bregma）和后囟（lambda）。清除覆盖颅骨的肌肉和筋膜，并使用电凝止血。
5. 用手术刀在颅骨表面以多个方向刮擦，以增强牙科水泥的黏附性（步骤1.8）。将前囟和后囟调至水平方向。
6. 在前囟后方3.6 mm、中线外侧2.5 mm处定位丘脑底核（STN），使用尖头电动钻头钻出直径约1.5 mm的骨孔。 注意： STN 在立体定向坐标中的精确定位可能因大鼠品系、体重和性别而异。应使用相同性别的成年大鼠，以尽量减少定位差异。如有可能，应通过术前解剖影像扫描或术中电生理记录，在个体受试者基础上确定 STN 的位置。此外，电极终止位置应通过组织学方法进行验证，以确保靶点的准确性。
   1. 小心切开硬脑膜，并使用小型钝头镊子将硬脑膜向孔洞两侧移开。用浸有生理盐水的无菌棉球止血。为其中一个电极创建孔洞 或更多与磁共振兼容的螺钉），并轻柔地将其插入颅骨，直至固定。螺钉可放置在任何不会干扰深部脑刺激电极外部连接器定位的位置。例如. 不在电极同侧的STN正后方）。我们推荐将位置定于颅骨的侧缘，理想位置为λ缝正后方。在此处，颅骨相对较厚，可降低螺钉损伤皮层的可能性。 注意： 本方案使用长度为 4-5 mm 的黄铜螺丝，但塑料螺丝也同样适用。
7. 将电极安装在立体定位仪臂上，确保其保持平直且垂直。将电极轻触前囟点，随后将电极精确移动至前囟后方3.6 mm、中线外侧2.5 mm处，并用电极接触皮层表面。从皮层表面开始，将电极向腹侧插入7.8 mm。上述坐标系参照神经解剖学图谱确定¹.
8. 在颅骨上（包括颅骨螺丝和电极插入点）覆盖一层牙科水泥。在从立体定位仪框架上取下电极之前，需等待水泥完全固化。将电极向后弯曲，并使用额外的水泥覆盖电极通路的其余部分及连接器，以增强耐久性。

2. fMRI 准备

第二步是功能磁共振成像（fMRI）的准备工作，包括线圈的定位以及生理监测设备的设置。

1. 固定动物头部，以防止扫描过程中发生移动。注意：此处使用定制的塑料耳杆系统进行头部固定。将耳杆插入耳道，并固定到头架上，使头部在垂直方向上可平稳旋转，且无水平方向旋转。通过将上排牙齿固定到装置上来稳定头部位置。
2. 完全麻醉大鼠，并监测呼气末 CO₂ 以确保所有扫描过程中的稳定性。为维持麻醉、通气并控制扫描期间的呼气末 CO₂ 水平，此处采用与异氟烷蒸发器联用的磁共振兼容小型动物呼吸机系统，尽管其他多种麻醉和镇静药物也可采用类似方式使用。将呼吸机设置为每分钟45次呼吸，潮气量适中，起始通气量约为500 ml/min。将异氟烷浓度设为2%，并将大鼠转移至扫描室。将呼吸机输出端连接至大鼠气管插管，并用力压紧以确保连接牢固。应使用一根尽可能靠近气管插管接头处连接的导管来获取二氧化碳波形图。调节通气量，使呼气末 CO₂ 维持在2.6%至3.3%之间。
3. 使用磁共振兼容的小动物固定装置，将大鼠置入扫描仪中，并配备循环热水浴以控制体温。将热水垫用胶带固定在固定装置上，并覆盖清洁的吸水纸。将大鼠放置于热水垫上。
4. 温度和二氧化碳水平的监测对BOLD fMRI至关重要，而动脉血氧饱和度和心率也是有用的生理参数。插入磁共振兼容的直肠温度探头，并用胶带固定于尾根部，然后调节水浴温度以维持正常体温37 °C。使用小型动物脉搏血氧仪系统监测动脉血氧饱和度和心率，分别维持在95–98%和250–350次/分钟，具体数值可能因所用麻醉剂类型而异。血氧饱和度和心率均受麻醉深度、通气量和通气频率的影响。需仔细平衡通气量和通气频率，以维持足够的呼气末 CO₂ 水平和充分的血氧饱和度。
5. BOLD fMRI 数据采集需要使用表面线圈。将表面线圈尽可能贴近头部表面放置。固定后，在颅骨水泥帽的头部表面涂抹牙膏，以减少脑表面附近的磁化率伪影。注意：我们使用自制的收发一体表面线圈，内径约为1.6 cm，但也可使用更大的表面线圈以优化深部皮层下区域的BOLD信号响应。
6. 将刺激电极连接至可编程电刺激系统。注意：我们使用自制的可编程TTL触发系统，连接双极刺激器，以输送与MR扫描射频激发同步的电脉冲。
7. 在fMRI数据采集期间，为实现镇静和肌肉松弛，使用右美托咪定（0.1 mg/kg/hr，腹腔注射）和泮库溴铵（1 mg/kg/hr，腹腔注射）的混合制剂，并联合低剂量异氟烷（0.5%）以防止癫痫样活动²。若需在磁场环境中放置输液泵，则必须使用磁共振兼容的注射泵；或者，也可将不兼容的泵置于磁场环境之外，前提是使用延长的导管管路。

3. fMRI 数据采集

第三步是进行fMRI数据采集，包括定位、匀场、解剖扫描和功能扫描。此处使用一台9.4特斯拉的系统和自制的表面线圈，但该技术也可适配于其他高场强系统和商业化的MRI线圈。

1. 将大鼠放入扫描仪中，并置于磁体中心。使用三平面定位像精确定位大鼠，使其脑部目标区域位于磁体中心，然后采用FASTMAP匀场技术对目标区域的磁场进行均匀化处理。
2. 使用矢状位T2加权RARE序列（视野，2.56 x 2.56 cm）²；矩阵大小，256 × 256；层厚，1.5 mm；TR/TE，1500/11 ms；RARE 因子，8；翻转角，180°) 以确定前连合的位置，并将后续图像与此位置对齐。对八层单次激发GE-EPI扫描（视野，2.56 × 2.56 cm）进行对齐²；矩阵大小，96 × 96，重建为128 × 128；层厚，1 mm；TR/TE，1000/14 ms）至此采用冠状位定向。
3. 功能扫描时，采用70次连续的EPI扫描，时间分辨率为1秒，与刺激输出同步，设置为20秒静息、10秒刺激，随后40秒静息。每次扫描之间至少间隔90秒，以确保神经血管恢复。在每组刺激参数下采集多次重复扫描，通过平均化提高信噪比。扫描开始前立即执行一系列伪扫描（通常为4-8次），以减少噪声。在图像采集时确认BOLD反应，以确保实验成功，可采用第4节所述方法进行验证，但此步骤可省略平均、共配准和去颅骨处理。
4. 功能扫描完成后，使用T2加权RARE自旋回波序列（视野，2.56 × 2.56 cm）²；矩阵大小，256 × 256；层厚，1 mm；TR/TE，2500/33 ms；平均次数，8）以测量电极的解剖位置 体内获取多个冠状面和矢状面切片，沿前/后、内/外及背/腹轴测量电极伪影尖端位置，以确认电极植入位点。可采用高分辨率磁共振显微成像（视野，1.8 × 1.28 cm；矩阵大小，360 × 256；层厚，0.5 mm；TR/TE，2500/12.6 ms；RARE因子，8；平均次数，280）在取出电极后，观察电极通路相对于邻近神经解剖结构的精确位置，从而验证电极植入的准确性³.

4. fMRI 数据处理与分析

第四步是fMRI数据的处理与分析，包括生成反应图谱和计算BOLD信号变化百分比。在计算环境中运行的自定义程序（例如 MATLAB）或商业fMRI软件工具（例如. SPM、FSL 或 AFNI）可用于分析。

1. 首先在受试者内部按频率进行图像共配准和数据平均，然后进行受试者间的共配准和平均。注意：我们使用SPM代码实现此步骤。
2. 通过手动定义信号阈值的感兴趣区域（ROI），进行颅骨剥离以去除非脑组织。也可采用自动颅骨剥离算法。
3. 通过计算每个体素的BOLD响应随时间变化与刺激范式之间关系的相关系数，生成响应图谱。为补偿血流动力学响应的延迟，可能需要将范式延迟数秒。经Bonferroni校正后，设定显著性水平为 P < 0.05。也可采用其他统计方法。为提高分析敏感性，可使用随机场理论或基于高斯随机场的簇水平校正来替代Bonferroni校正，以校正多重比较⁴。注意：血流动力学延迟可能因靶向脑区、所用药物制剂及生理参数的不同而有所变化。控制这些参数对于防止受试者内部及受试者之间的变异性至关重要。
4. 通过定义感兴趣区域（ROI）提取时间过程数据，以量化BOLD响应。对同一解剖结构内所有体素的信号百分比变化取平均值。也可使用一般线性模型进行体素水平的分析⁵。

结果

根据上述方案，在一只右侧丘脑底核植入刺激电极的大鼠中获得了典型的脑功能数据。图1展示了进行深部脑刺激功能性磁共振成像（DBS fMRI）数据采集的关键实验设置。刺激参数遵循上述方案，电流强度为0.3 mA，频率为130 Hz，脉宽为0.09 msec。采用该方案以丘脑底核为刺激靶点时，同侧运动皮层的激活信号可被稳定地观察到。在方波刺激模式下，血氧水平依赖（BOLD）信号相对于基线状态（无刺激条件）应随时间发生调制，其时间进程与刺激周期相关。本实验中，在预期的脑区观察到明显的正向BOLD反应（图2），且其ON/OFF模式与刺激范式高度一致，同时考虑了短暂的血流动力学延迟（图3）。通过功能图谱（图2）叠加神经解剖图谱¹，可精确定义感兴趣区域，用于比较不同脑区的BOLD效应。对于丘脑底核深部脑刺激（STN DBS），运动皮层的BOLD反应如图3所示，但感兴趣区域也可设置于任意脑区。这些反应可在扫描间及受试者间进行平均，以识别对刺激产生稳定响应的脑区。针对...

讨论

同时进行的脑深部电刺激（DBS）与功能磁共振成像（fMRI）代表了一种有前景的实验工具包，可用于在活体（in vivo）条件下识别和表征神经环路刺激引发的全局性下游反应。 与电生理记录等其他现有技术相比，该方法的主要优势在于fMRI具有相对无偏倚的特性，能够对广泛且多样化的脑组织区域进行检测，以评估其对任意靶点DBS的响应情况。尽管本文所述方案专用于大鼠的DBS-fMRI研究，但针对DBS反应的神经影像学研究也已在其他模式生物中成功开展，包括猪⁶。

该技术最明显的一个应用可能是用于模拟临床上治疗某些神经及精神疾病时所采用的深部脑刺激（DBS），例如帕金森病^7-9。在帕金森病患者中，对丘脑底核（STN）或内侧苍白球（GPi）施加高频刺激，可有效缓解多种运动症状¹⁰。在这两个靶点中的任一处进行高频DBS，均可引起经典的运动区和边缘区的显著激活⁶。当结合行为学分析来表征这些空间动态的fMRI反应时，可能有助于识别具有治疗作用的DBS神经环路。此类研究得出的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
异氟烷（Forane）	Baxter	1001936060
右美托咪定（Dexdomitor）	Pfizer	145108-58-3
泮库溴铵	Selleckchem	S2497
9.4 T 小动物磁共振成像仪	Bruker		BioSpec 系统，配备 BGA-9S 梯度线圈
立体定位仪	Kopf		型号 962
小动物呼吸机	CWE, Inc.	12-02100	型号 SAR-830
牙科水泥	A-M Systems	525000	Teets 冷固化型
MouseOx Plus 监测系统	STARR Life Science Corp.
二氧化碳浓度监测仪	Surgivet, Smith Medical		V9004 系列
刺激隔离器	World Precision Instruments		型号 A365
磁共振兼容黄铜螺钉	McMaster Carr	94070A031	0-80 螺纹规格，1/4 英寸长，可按需截断
钨丝	California Fine Wire Company	100211	用于制作磁共振兼容刺激微电极
注射泵	Harvard Apparatus		型号 PHD 2000（非磁共振兼容）