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方法文章

使用连续流动微点样仪在修饰表面上进行细胞的浸没式打印

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DOI：

10.3791/51273

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2014年4月22日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wasatch Microfluidics, 2Department of Mechanical Engineering, University of Utah

本文内容

摘要

这种三维微流控打印技术可将细胞阵列打印到浸没的表面上。我们描述了如何通过三维流动池以微流控方式将细胞阵列递送到浸没的表面上。通过在浸没表面上进行打印，可制备出细胞微阵列，从而在多个领域实现药物筛选和细胞毒性评估。

摘要

用于微阵列应用的细胞打印技术面临诸多挑战，包括打印后难以维持细胞生理相关的表型、目标细胞的排列与分布效果不佳，以及无法向阵列中的特定区域递送药物和/或营养物质等问题。我们的三维微流控打印技术能够以自动化和多重化的方式，将细胞阵列密封并打印到浸没的表面上。微流控细胞阵列（MFCA）的三维流体设计使打印头尖端可下降至充满液体的孔板或培养皿中，并通过与表面接触加压形成密封。打印头的柔软硅胶尖端起到垫圈的作用，通过施加压力或回撤即可实现可逆的密封。其他细胞打印技术，如针式或喷墨打印机，均无法在浸没条件下进行打印。在浸没表面进行打印对于维持细胞表型、以及在不干扰材料表面特性的前提下对细胞进行监测至关重要。通过在浸没表面打印，可制备出适用于多种领域（包括癌症、糖尿病、炎症、感染及心血管疾病）的药物筛选和细胞毒性评估的细胞微阵列。

引言

制药行业的最新进展使得细胞微阵列在药物发现过程中的药物筛选和细胞毒理学分析中受到越来越多的关注1,2,3. 发展 体外 利用细胞微阵列的高通量检测与筛选方法将有助于药物候选物的快速且经济高效的开发，同时推动对细胞基本生物学特性的深入理解1,4传统的细胞筛选方法采用常规的孔板平台，但该方法受限于高成本、通量有限以及在获取细胞功能定量信息方面的能力不足1,5由于这些局限性，细胞微阵列技术在分子生物学表征、组织工程和药物筛选领域的研究正在迅速发展1,6细胞微阵列的优点包括样本用量少、可最大限度减少细胞表型异质性对信息的掩盖作用，以及最重要的是能够实现检测的自动化，从而适用于更高通量的应用。1,7,8.

目前，制药行业利用基于2D细胞单层培养的高通量细胞筛选实验，在微孔板中进行药物筛选9。在微孔板的孔中实现细胞的多重化，可提高通量，并提供独特的实验选择。此外，现有的细胞微阵列技术允许细胞干燥，这可能会显著改变细胞相对于体内（in vivo）的表型10,11。为克服这些问题，研究人员设计了MFCA，如图1所示。MFCA的3D流体结构使得图1中的打印头尖端可降低至液体环境中，并压紧于表面形成密封。打印头的柔软硅胶尖端起到垫圈的作用，可形成可逆的密封。MFCA技术特别适用于与浸没表面连接，这对于细胞培养和组织切片系统均是必需的，而大多数其他方法难以甚至无法实现这一功能。针式点样或喷墨打印技术无法实现此目的，而2D微流控装置也不适用于在大量独立点阵上进行沉积或界面连接。此外，通过微型化和局部化实验——即细胞微阵列——MFCA克服了高通量细胞筛选实验中的主要问题。

CFM 利用三维通道网络，在表面的微观点位上循环小体积的液体样本12,13。通过在流动状态下进行打印，生物分子、细胞及其他试剂在整个打印过程中始终保持在液体环境中，从而能够在不接触空气的情况下打印敏感的生物分子和细胞，克服了现有细胞打印技术的局限性。只要芯片表面具备捕获机制，还可直接使用粗制材料（如杂交瘤或上清液）进行打印。本文旨在详细阐述将两种细胞类型在液下打印至表面的方法。

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方案

1. 细胞培养准备

  1. 将 NIH/3T3 细胞株储存于液氮中，直至使用时取出。
  2. 使用添加了 10% 胎牛血清、10 mM HEPES 缓冲液、50 单位/毫升青霉素和 50 μg/ml 链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）制备 NIH/3T3 细胞的完全培养基。
  3. 在 37 °C 摇动水浴中解冻细胞 2-3 分钟。
  4. 将细胞重悬于 5 ml 完全培养基中，并在 1,500 × g 离心 3 分钟。
  5. 移除上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
  6. 将细胞重悬于 5 ml 培养基中，并使用血细胞计数板进行细胞计数。
    1. 取 10 μl 细胞悬液，置于 0.5 ml 微量离心管中。
    2. 向细胞悬液中加入 10 μl 台盼蓝染液，并用移液器吸头轻轻混匀。
    3. 吸取 10 μl 染色后的细胞悬液，加入血细胞计数板的计数室中。
    4. 在 10 倍物镜下对血细胞计数板中的细胞进行计数。
      1. 对 9 个大方格中的 4 个进行活细胞计数（活细胞呈小的白色圆球状），仅计数未被台盼蓝染成深蓝色的细胞。
      2. 计算每个大方格的平均细胞数，由此得出原始细胞悬液中每毫升的细胞数量（单位为 ×104 个细胞/毫升）。
      3. 以每毫升 1×105 个细胞的密度接种细胞，每个 T25 培养瓶中加入总共 5 ml 培养基。
    5. 在开始实验前，将细胞培养至 70%–80% 汇合度。每 2–3 天或根据需要更换培养基。

2. 打印表面准备

  1. 在组织培养处理的聚苯乙烯（TCTPS）12孔板底部用记号笔标记一个与打印头尺寸相同的矩形区域（7 mm × 19 mm）。
  2. 用移液器将50 μl胎牛血清加入该矩形区域内，并用枪头将血清完全覆盖整个区域。
  3. 将培养皿置于无菌生物安全柜中过夜，使血清斑完全干燥。这些培养板应在使用前不超过2天内制备。

3. 沉浸式打印

  1. 用蒸馏水冲洗打印头。
    1. 在60 mm的培养皿中加入蒸馏水，并将打印头置于液面之上。
    2. 使用气动泵以150 μl/min的流速对每条通道冲洗2分钟。
    3. 倒掉培养皿中的水，重新加入洁净的蒸馏水。
    4. 将打印头在水中上下移动3次。
  2. 将打印头中心对准预先准备好的12孔板中已包被血清的位点并定位。
  3. 用预热的完全培养基对打印头进行引液，每通道300 μl。
  4. 将细胞悬液以50,000个细胞/ml的浓度打印到表面，流速为60 μl/min，每通道100 μl。
  5. 将打印头保持与表面接触的状态，连同多路管一起放入设定为5% CO2和37 °C的细胞培养孵箱中孵育2小时。
  6. 孵育2小时后，取出打印头并盖上培养皿盖。打印头取出的时间点记为0小时时间点。

4. 标准细胞培养

  1. 向步骤 2 中制备的血清点样 TCTPS 12 孔板的一个孔中加入 1 ml 预热的培养基。
  2. 从步骤 2 剩余的细胞悬液中取出 1 ml，用移液器接种至一个 TCTPS 12 孔板的单个孔中。此操作将使培养皿中的细胞数量达到 50,000 个。
  3. 将细胞培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。
  4. 2 小时孵育结束后开始计时；为确保打印样品与接种样品之间的一致性，此时间点被视为 0 小时。

5. 培养物观察

  1. 在0、2、24和48小时，分别取上述两种方法的细胞，使用标准倒置显微镜进行成像。
    1. 使用碘化丙啶（propidium iodide）对细胞进行染色，这是一种红色荧光染料，仅能进入死细胞的细胞核并与其结合。
      1. 用1 ml含钙镁的磷酸盐缓冲液（PBS++）轻柔冲洗细胞3次，以去除任何碎片。
      2. 向每个培养容器中加入1 ml预热的PBS++。
      3. 向每个培养容器中加入 1 μl 的碘化丙啶储备液（1 mg/ml）。
      4. 将用碘化丙啶染色的细胞在37 °C孵育 10 分钟
    2. 使用倒置显微镜在10倍和40倍放大倍数下观察细胞。
  2. 将细胞弃置于适当的生物危害容器中。

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结果

将成纤维细胞系 NIH/3T3 细胞打印或接种到浸没的表面。细胞培养至密度为每毫升 5 × 104 个细胞。使用传统的细胞培养技术进行细胞接种。细胞使用一种大尺寸、十二通道的细胞打印头进行打印，其通道尺寸（约 500 µm）大于用于蛋白质和其他生物分子的 CFM。将细胞打印或接种到经血清包被的表面。打印过程如图 1所示。

打印并接种细胞后，在相应时间点（0、2、24 和 48 小时）对细胞进行观察，以评估其密度和形态。通过显微镜下 10X 和 40X 放大倍数评估各时间点的细胞密度和形态。图 2 显示，各时间点及各放大倍数下的细胞表型几乎相同。根据这些图像，打印对细胞的影响被确定为极小。

使用PI染色法评估细胞活力。如图3所示，在每个时间点，打印细胞的细胞活力与接种细胞相比无显著差异。两种将细胞附着于表面方法的主要区别在于打印细胞的密度。在2小时时间点，接种细胞和打印细胞的细胞密度均下降超过50%。需要进...

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讨论

本文所述的3D微流控打印技术能够独特地将细胞阵列通过微流控方式打印到充满液体的孔板中，即浸没式表面。i.e. 在浸没表面上进行打印，可制备出能够维持细胞生理相关表型的细胞微阵列，同时可在单个孔的底部实现细胞的多重化排列 图4。本研究结果表明，通过微流控方式打印细胞可实现细胞贴附，且细胞形态和活力与传统方法相当；然而，打印的细胞可在特定位置更密集地贴附，从而缩短整体实验周期。实验周期的缩短可能为高通量药物筛选带来显著的成本节约14。

微流控技术此前已被用于细胞微阵列和高通量药物筛选。数十项研究详细阐述了基于流体的检测方法如何消除静态流动问题；然而，这些研究采用的是二维微流控（勿与二维和三维组织培养混淆），这限制了检测密度、多重分析能力以及显微镜在高度并行分析中的整合应用15–19数字微流控和基于液滴的微流控技术已被提出用于此类应用，可实现在高度并行、多重配置下的操作。15,17,18但这些方法仅限于单个或少量细胞群，且在样品...

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披露

作者是Wasatch Microfluidics的员工及股东，该公司生产本手稿中使用的试剂和/或仪器。

致谢

作者谨此感谢 Chris Morrow 提供的技术支持。本研究由美国国立卫生研究院小型企业创新研究项目（NIH SBIR R43）资助，资助编号为 1R43GM101859-01（MPI），资助号 GRANT10940803。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
连续流式微点样仪Wasatch Microfluidics
NIH/3T3 细胞ATCCCRL-1658
杜尔贝科改良伊格尔培养基Invitrogen11965-092细胞基础培养基
HEPES 缓冲液Invitrogen15630-080细胞培养基添加剂（调节 pH）
丙酮酸钠Invitrogen11360-070细胞培养基添加剂
青霉素-链霉素 Invitrogen细胞培养基添加剂
台盼蓝Invitrogen15250-061细胞染色用于计数
血细胞计数板Fisher267110用于细胞计数的计数室
Nikon Eclipse TS100Nikon用于观察细胞
Nikon Eclipse TE2000-UNikon用于采集图像
磷酸盐缓冲液（含钙和镁）Invitrogen14040-133传代前及碘化丙啶染色前冲洗细胞
TrypLE Express InvitrogenA12177-01用于从表面解离细胞

参考文献

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