使用结构光照明显微镜成像大鼠原代海马神经元的树突棘

摘要

本文介绍了一种用于成像海马神经元树突棘的工作方案 体外 使用结构照明显微镜（SIM）。基于SIM的超分辨率显微技术可在三个空间维度上显著突破光衍射极限，实现对单个树突棘的高细节成像。

摘要

树突棘是神经元树突上突起的结构，代表大脑中兴奋性输入的主要突触后靶点。技术进步已确定这些结构在神经元连接性和突触可塑性中的关键作用。由于光学固有的衍射极限带来的技术限制，利用光学显微镜对树突棘形态进行定量分析仍然是一个重要的难题。树突棘可通过共聚焦激光扫描荧光显微镜轻松识别。然而，测量树突棘形状和大小的细微变化十分困难，因为除长度外，树突棘的其他尺寸通常小于传统光学分辨率，而该分辨率受光学显微镜理论分辨极限（200 nm）的限制。

近年来开发的多种超分辨率成像技术已被用于观察小于200 nm的细胞结构，包括树突棘。这些技术基于传统的远场光学原理，因此可沿用现有的样品制备方法，并实现对样品表面以下结构的成像。本文介绍了一种应用于原代海马神经元培养物中树突棘成像的超分辨率结构照明显微镜（SIM）工作流程。SIM的应用范围与共聚焦显微镜部分重叠，但两种技术的适用性存在差异。SIM具有更高的有效横向分辨率，而共聚焦显微镜则通过物理针孔实现分辨率提升，但同时会滤除离焦光信号。本实验方案中，采用标准方法将原代神经元培养于玻璃盖玻片上，转染编码荧光蛋白的DNA质粒后，利用SIM进行成像。整个实验流程约需2周时间，因树突棘的成像在培养第16至17天进行。 超分辨率结构照明显微镜，树突棘，原代海马神经元，荧光蛋白，共聚焦显微镜，远场成像，样品制备 体外，当树突发育处于最佳状态时。完成本方案后，可使用专用软件通过SIM图像序列的堆栈对树突棘进行三维重建。

引言

树突棘是神经元膜上的微小突起。这种特征性结构通常专门接收单个突触的输入，代表了两个神经元之间的物理接触区域。大多数功能成熟的树突棘由一个球状的顶端（称为头部）和一条细窄的颈部组成，后者将头部连接到树突主干上。然而，树突棘并非静止不变，即使在成年大脑中，它们也会持续活跃地移动并不断改变其形态²。在两周的时间内，源自晚期胚胎或出生后早期阶段的大鼠原代海马神经元培养物会发育出复杂的树突分支结构，并产生大量膜突起，这些突起从早期的丝状伪足逐渐演变为类似树突棘的结构³。基于这种动态行为及其他特性，人们认为树突棘为记忆存储和突触传递提供了结构基础^4,5。

鉴于树突棘的大小和形状在突触功能中具有关键作用，准确测量其尺寸显得尤为重要。树突棘的长度通常在200至2,000纳米之间，可通过共聚焦激光扫描荧光显微镜轻易识别。然而，除长度以外的其他尺寸参数通常低于传统光学系统的分辨率，该分辨率受衍射限制，理论值约为200纳米⁶。此类分辨能力不足以成像更精细的结构，例如树突棘颈部和头部的宽度。为解决这一问题，已有大量研究工作开展，并推动了多种较新发展的超分辨率显微技术取得显著进展。特别是，通过在宽场、非共聚焦显微镜中采用横向结构化照明显微术（SIM），可在不损失任何发射光的前提下突破经典分辨率极限^7-10。将该技术与非线性显微技术结合使用时，理论上可将光学显微镜的横向分辨率提高任意倍数¹¹。然而，在大多数实验条件下，SIM通常可将分辨率极限提高两倍¹。其他超分辨率光学显微技术，如受激辐射损耗（STED）显微术¹²和光激活定位显微术（PALM）¹²，也已被应用于树突棘的成像。基于定位的方法（如PALM）需要采集大量原始图像才能实现超分辨率，因而成像速度受限。相比之下，STED可实现较高的成像速度，但其光子计数相对较低且视场较小，而这些限制在SIM中可能并不存在¹³。

本文旨在提供一种用于成像培养的大鼠原代海马神经元树突棘的工作方案 体外 使用SIM。该方案包括两个可区分的阶段：初始阶段包括大鼠原代海马神经元培养物的建立、发育、转染和免疫组织化学，后期阶段则专注于样品成像。

方案

所有涉及动物的实验操作均经过优化，以减少动物痛苦，并已获得阿姆斯特丹大学动物实验委员会（DEC协议号：DED204和DED250）的批准。

1. 盖玻片准备

1. 使用碳化钨或金刚石刻刀将盖玻片切割成 15 mm × 15 mm 的尺寸，以便其能够放入 12 孔板的孔中。
2. 在通风橱内操作，将盖玻片完全浸入玻璃容器中的浓硝酸溶液（70% 质量分数）以开始包被。为确保均匀分布需轻轻摇晃，随后孵育至少 4 小时。浓硝酸溶液可重复使用约 2 次，但暴露于光线下可能导致其褪色。
3. 移除浓硝酸溶液，并用蒸馏水清洗盖玻片 4 次，每次 30 分钟，每次清洗后需小心摇晃。
4. 小心移除水分。
   注意：接下来的三个步骤需在无菌超净工作台内进行。
5. 将盖玻片浸入 96% 乙醇中。从乙醇溶液中取出盖玻片并使其自然干燥。
6. 用火焰灼烧盖玻片，然后将其放入玻璃容器中。操作盖玻片时应使用精细镊子（例如 Dumont 5 号镊子）。
7. 用铝箔覆盖容器，并在干热烘箱中于 180 °C 烘烤 12–16 小时。若密封保存，烘烤后的盖玻片可在室温下储存长达 1 个月。

2. 盖玻片包被

盖玻片包被步骤有利于神经元附着于玻璃表面以及树突分支的形成¹⁴。

1. 在无菌超净工作台中，使用无菌小镊子将单个盖玻片放入12孔板的各个孔中。
2. 每孔加入500 μl多聚赖氨酸溶液（或足量以完全浸没盖玻片）。
3. 用铝箔纸包裹培养板以防止蒸发，并于室温下静置过夜。
4. 开始培养前，在无菌超净工作台中小心吸除多聚赖氨酸溶液。
5. 每孔用1 ml无菌水洗涤两次，注意避免孔内干燥。
6. 彻底吸除水分后，每孔加入1 ml铺板培养基，将盖玻片置于细胞培养箱中，待细胞接种时使用。建议在24小时内完成细胞接种。

3. 从 E16-E19 大鼠胚胎中取出脑组织

1. 使用干热灭菌器对手术器械进行过夜灭菌，或用70% EtOH清洗。若使用EtOH，需彻底干燥。
2. 准备多个含1×HBSS缓冲液的30 mm培养皿，并置于冰上。
3. 通过腹腔注射 Euthasol（160 mg/kg Euthasol，注射体积为 ± 0.4 ml
4. 检查反射是否消失。
5. 用70%乙醇喷洒母鼠腹部。
6. 沿腹部做一切口，取出子宫。
7. 将胚胎从子宫中取出，置于直径100 mm的培养皿中。
8. 用大剪刀去除胚胎的头部，并将头部放入含有冷的1×HBSS缓冲液的新培养皿中。
   注意：从此处到步骤7.1，所有操作均在超净工作台内无菌条件下进行。
9. 用大号镊子夹住两侧的头部。
10. 用小剪刀在头部顶部的皮肤上做一矢状切口，然后用大镊子将皮肤向两侧剥离。
11. 采用与步骤3.10相同的方法去除颅骨。从尾端开始做矢状切口，轻柔地打开颅骨，避免损伤脑组织。将颅骨的两半向外侧折叠，暴露脑组织。
12. 用钝头刮勺取出脑组织，置于新鲜的冷1x HBSS中。

4. 海马体的解剖

解剖操作必须在无菌条件下尽快完成，以确保细胞活性。将样品置于冰上保持低温。

1. 用精细剪刀移除并丢弃小脑。
2. 沿中线做矢状切口，分离大脑的两个半球。
3. 取每个半球，将其放入一个新的含有新鲜冷的1×HBSS的30 mm培养皿中。
4. 放置每个半球，使颞叶朝向培养皿底部。
   注意：从这一步开始，建议使用解剖显微镜。
5. 用小镊子轻轻夹住中脑，用另一把镊子将其移除。保留包含皮层和海马体的其余半球组织。
6. 将组织翻转，使海马体朝向培养皿底部。
7. 用精细镊子轻轻固定半球组织，再用另一把精细镊子小心而轻柔地去除脑膜。建议从嗅球处开始操作，并注意避免损伤海马体。
8. 调整组织方向，使海马体朝上。此时可通过其特有的C形结构辨识海马体。
9. 使用精细镊子将海马体解剖分离，并收集到一个新的含有新鲜冷的1×HBSS的30 mm培养皿中。

5. 细胞解离与接种

1. 计数海马体的总数，然后将其切成小块。
2. 将组织块收集到含有3 ml 1×HBSS的15 ml离心管中。
3. 以 300 × g 离心 5 分钟，小心移除上清液。
4. 加入6 μ每海马体加入胰蛋白酶。
5. 37℃孵育，时间不超过20分钟 °C. 3分钟后涡旋混匀。
6. 用5 ml新鲜的冷1×HBSS洗涤两次，弃去上清液。
7. 第二次洗涤后，加入1.5 ml预热至37℃的铺板培养基 °C. 铺板培养基中的血清会抑制胰蛋白酶活性。
8. 用经火焰抛光的巴斯德移液管缓慢吹打30次，直至所有组织块均匀分散为单细胞。避免产生气泡。
9. 加入5 ml预热至37℃的铺板培养基 °C.
10. 使用台盼蓝染色法进行细胞计数。
11. 在12孔板中每孔接种50,000个细胞，加入1 ml铺板培养基（于第2节中配制，总体积为2 ml）。
12. 轻轻摇动培养板，使细胞均匀分布。
13. 37℃孵育 °C，5% CO₂. 2-3天后，用含有10的培养基替换一半的铺板培养基（0.5 ml） µM FUDR
    注意：树突棘成像在铺板后16-17天进行（16-17天 体外，体外培养天数（DIV）。

6. 使用脂质体转染法对大鼠海马原代神经元进行转染

在体外培养第14-15天（DIV 14-15），采用以下方案对神经元进行转染：

1. 准备表达GFP的质粒DNA和孵育培养基（10 ml含100 μl GlutaMAX的Neurobasal培养基）。
2. 将孵育培养基预热至37 °C。
3. 配制DNA混合液（A管）。每张盖玻片加入1 μg DNA溶于100 μl普通Neurobasal培养基中，轻轻混匀。
4. 配制Lipofectamine混合液（B管）。每张盖玻片加入2 μl Lipofectamine溶于100 μl普通Neurobasal培养基中，轻轻混匀。
5. 将Lipofectamine混合液逐滴加入DNA混合液中。
6. 在超净台中室温孵育30分钟。
7. 向1号培养板中加入1 ml预热的孵育培养基。
8. 将2号培养板在37 °C、5% CO₂条件下静置5分钟。
9. 用移液器轻轻将200 μl DNA/Lipofectamine混合液逐滴加入每个孔中，于37 °C、5% CO₂条件下孵育45分钟。
10. 使用小镊子小心夹起含有神经元的盖玻片，将其浸入盛有新鲜温热Neurobasal培养基的3 cm培养皿中漂洗，随后转移至2号培养板中。
11. 将转染后的神经元在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育48小时。
12. 转染后24小时检测转染效率。

7. 大鼠海马原代神经元的免疫染色与封片

为了提高转染细胞中的荧光强度，可在转染后48小时进行免疫染色操作，以增强GFP的检测效果。

1. 配制 4% PFA 和 0.05 M TBS。
2. 将 4% PFA 溶液预热至 37 °C。
3. 轻柔吸除含有盖玻片的孔板中的培养基。
4. 小心加入 500 μl 预热的 4% PFA，避免损伤树突。
5. 室温孵育 15 分钟。
6. 用 1× HBSS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   注意：此时样品可在 4 °C 下保存最多 3 周，或立即开始免疫染色。
7. 若样品已保存，请用 0.05 M TBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
8. 用 TBS-BSA（1%）溶液在室温下封闭 30 分钟。
9. 用 0.05 M TBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
10. 加入用孵育液稀释的一抗。
11. 在室温下孵育 1 小时。
12. 随后在 4 °C 下轻轻振荡过夜孵育。
13. 移除一抗。
14. 用 0.05 M TBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
    注意：从此步骤开始，需将盖玻片避光保存。
15. 加入用孵育液稀释的荧光标记二抗。
16. 室温孵育 2 小时。
17. 移除二抗。
18. 用 0.05 M TBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
19. 用 1× TB 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
20. 使用精细镊子将盖玻片从孔板中取出。
21. 用纸巾吸去多余的 TB 液体，并使用封片剂将盖玻片封片。
22. 用指甲油封边，防止封片剂蒸发。

8. 使用结构光照明显微镜进行树突棘成像

使用材料中所述SIM系统进行树突棘成像时，其横向分辨率（XY）约为85-110 nm，轴向（Z）分辨率在200-250 nm之间，相比宽场显微镜，分辨率提高了约2倍。

注意：使用SIM进行树突棘成像通常在步骤7.22之后2天进行，但如果样品保存在避光且温度控制在22 - 23 °C的条件下，最迟可在3周后进行。

1. 打开 488 nm 激光器、汞灯、载物台控制器、压电控制器、透射光卤素灯以及计算机，并启动 SIM 软件的“ANDOR for N-SIM”模式。
2. 用 95% 乙醇清洁 100x TIRF 物镜三次，必要时再用石油醚清洁。
3. 使用以下滤光片设置：520 LP 滤光片配合 488 二向色镜。
4. 在物镜上滴加一滴浸油。检查油滴中无气泡。将物镜向上移动，直至油接触样品。
   注意：用盖板覆盖载物台以保护样品免受环境光影响，并尽可能调暗室内灯光。
5. 将物镜的校正环设置为 37 °C、200 µm，以获得最佳的点扩散函数（PSF）对称性。为设置正确的校正环位置，首先将物镜环置于最佳标称位置，然后检查 100 nm 荧光微球样品。根据 PSF 对称性的最佳状态，在标称位置附近微调校正环位置。
6. 照明使用 3D-SIM 光栅（3D 1层 100X/1.49 所有波长）。开始光栅对准前，将选定的光栅块插入 SIM 照明器中，并使用 100X 1.49 物镜。使用介质封片的 100 nm 荧光微球样品，其浓度应允许在视野（FOV）中分离出 10–15 个微球。在将物镜校正环设置到所需位置后，选择 3D-SIM 照明模式并启动软件引导的对准程序。该程序将采集 (5 个相位) × (1 个方向) × (100 个 z 平面) 的图像，并重建包含微球的视野。通过适当 ROI 选择单个微球（覆盖整个微球及其离焦模糊光），软件将自动进行 PSF 拟合并根据结果调整光栅位置。
7. 为检查显微镜性能，每两周重复一次光栅对准，以应对可能因载物台移动和/或温度漂移引起的错位。此外，还应根据制造商建议检查激光强度和稳定性。
8. 用 95% 乙醇清洁样品表面三次。
   注意：后续步骤请参见图 3，了解 SIM 软件中控制面板及正确设置的概览。
9. 在 SIM 软件中选择“Optical Configuration Eye FITC”，并在转轮 1（Turret 1）中选择空滤光片位，用于白光下的目视检查。
10. 将 XY 载物台的聚焦速度和移动速度设置为“Fine”（精细）。
11. 打开快门并快速对样品进行聚焦。
12. 再次关闭快门并将 Z 坐标设为零。
13. 在转轮 1 中选择绿色滤光片，用于绿色通道的目视检查。
14. 将汞灯强度设置为最低档。
15. 小心移动至样品边缘，确保物镜不接触封片剂。
16. 打开快门，并以尽可能低的强度快速扫描样品。
17. 当发现足够明亮的目标树突并将其感兴趣区域居中于视野后，关闭快门。
18. 将软件设置为“Optical Configuration 3D-SIM 488”，相机设置为读出模式 EM，增益 1 MHz 16 位，曝光时间 100 毫秒，激光功率 5%，EM 增益 200。
    注意：请确认转轮 2 中已选择绿色滤光片，且转轮 1 为空。
19. 确认光栅设置为“Moving”（移动），点击“Live”以通过激光和相机观察样品。
20. 启用查找表（Look Up Table）。
21. 如有必要，居中目标对象，并将聚焦速度设为“Extra Fine”（超精细）进行对焦。
    注意：在 EM 增益 1 MHz 16 位读出模式下，良好 SIM 图像的目标强度应在 30,000–45,000 之间。
22. 快速调整相机设置，使 EM 增益 1 MHz 16 位读出模式下的强度值达到 30,000–45,000。初始设置建议如下：
    1. 激光功率：0%–20%（对于上述方法制备的样品，5% 或 2.6 mW 已足够）
    2. 曝光时间：50 毫秒–2 秒
    3. 读出模式：EM 增益 1 MHz 16 位
    4. EM 增益：0–300
    5. 转换增益：1x–5.1x
    6. 实时成像格式：无 binning
    7. 采集格式：无 binning
       注意：使用这些设置通常可实现 6.3% ± 1.3% 的光漂白，处于可接受最大漂白率 10% 以内，超过此限值可能显著影响图像质量¹⁵。
23. 点击“Stop”以关闭实时成像。
24. 在 ND 序列面板中配置 3D Z 栈设置如下：
    1. 范围：2 µm
    2. 步长：120 nm
    3. Z 平面
    4. 点击“Home position”（归零位置）
    5. 在 Lambda 部分选择“Optical Configuration 3D-SIM 488”
25. 在 N-SIM 控制面板中选择 3D-SIM 作为采集模式。
26. 运行 ND 序列采集并保存原始数据。
27. 再次选择“Optical Configuration Eye FITC”，并重复步骤 8.15–8.27，直至完成整个样品的成像。
28. 3D 图像重建：步骤 8.23 中获取的数据可立即或稍后重建。首先使用“Reconstruct Slice”或“Reconstruct Stack”模式中的默认重建参数对 Z 栈进行重建，并根据需要进行调整。
    注意：为获得最佳效果，Z 栈应使用指定步长采集，并在“Reconstruct Stack”模式下重建。始终通过与原始数据或更优的宽场图像对比，检查重建图像的有效性。可调整的重建参数包括对比度和高频噪声抑制。这两个参数均会影响重建过程中对不同原始图像特性的考虑方式。对于调制深度较低的原始数据，对比度参数尤为重要。若用户数据集信噪比较低，则高频噪声抑制参数可能严重影响重建质量。
29. 成像完成后，将 XY 载物台居中，并将物镜完全降至静止位置。
30. 卸下样品，并用 95% 乙醇清洁样品和物镜。
31. 关闭软件和计算机，并关闭所有其他设备。
32. 将文件转换为 TIFF 格式后，可使用 NeuronStudio 软件进行 3D 重建和树突棘分类（见图 4）¹⁶。
33. 在 NeuronStudio 软件中使用以下重建参数：
    1. 体积：体素尺寸：X：0.03 μm；Y：0.03 μm；Z：0.120 μm。
    2. 树突检测：连接比：1.3；最小长度：5 μm；离散化比：1；重新对齐连接点：是。
    3. 树突棘检测：最小高度：0.2 μm；最大高度：5.001 μm；最大宽度：3 μm；最小短粗型棘大小：10 个体素；最小非短粗型棘大小：5 个体素。
    4. 树突棘分类器：颈比（头颈比）：1.1；细长比：2.5；蘑菇型大小：0.35 μm；
34. NeuronStudio 渲染所用参数：神经突顶点形状：实心椭圆；神经突顶点颜色：按类型；神经突边缘形状：线；神经突边缘颜色：单色；树突棘形状：实心椭圆；树突棘颜色：按类型。
    注意：完成 3D 重建后，也可设置体渲染。默认阈值设为 20，并启用“Regenerate volume rendering”（重新生成体渲染）选项。勾选“Automatic Intensity”（自动强度）设置不透明度。“Surface only”（仅表面）和“Use Point Pre-Rendering”（使用点预渲染）选项也处于启用状态。

结果

本文介绍了一种用于成像大鼠原代海马神经元树突棘的标准操作流程 体外 使用SIM。该方案的工作流程及其关键步骤如下所示： 图1总体而言，该实验方案大约需要两周的实验工作时间，分为两个阶段：第一阶段为样品制备，包括大鼠原代海马神经元的培养、发育、转染以及免疫组织化学处理；第二阶段为使用SIM进行样品成像。大鼠原代海马神经元在培养开始约两周后固定，此时神经元已发育出具有大量树突棘的复杂树突分支 ^3,5. 通过详细描述于第1-8节中的方案，可系统地以超分辨率对树突棘进行成像。与此前描述的使用共聚焦荧光显微镜的传统树突棘成像方法相比 ^16,17本文所述利用SIM的方案可显著提高图像分辨率和三维重建效果，从而能够识别和分类从早期丝状伪足到类似树突棘结构的神经元膜突起。

讨论

本文介绍了一种用于成像培养的大鼠原代海马神经元树突棘的工作方案 体外 使用SIM的方法被描述。原代海马神经元培养方法是对Kaech和Banker所描述的原始方法的改进 ¹⁸主要区别在于使用 Neurobasal/B27 培养基，从而无需星形胶质细胞饲养层培养；并在第3天加入有丝分裂抑制剂 FUDR，以促进神经元存活并抑制胶质细胞增殖，如 Brewer 所述。 等 ¹⁹.

该实验方案中有多个关键步骤。用于接种细胞的盖玻片厚度对于获得准确的SIM实验结果至关重要。在盖玻片的制备和包被过程中保持无菌状态非常重要。  在步骤2.3和2.4中，经多聚赖氨酸处理的盖玻片切勿干燥。步骤5.8中使用的火焰抛光移液管的直径非常关键，过细的管尖会导致后续细胞存活率降低。应尽快完成海马体的分离，以确保较高的细胞存活率。孵育时间与胰蛋白酶浓度的控制至关重要，以维持高细胞存活率。胰蛋白酶活性的丧失也可能影响细胞存活率。最后，在步骤5.14中加入FUDR对于促进神经元存活和抑制胶质细胞增殖至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
精细镊子
大型镊子
精细剪刀
大型剪刀
钝头刮匙
带照明装置的解剖显微镜
光学显微镜
37 °C 水浴箱
层流细胞培养罩
高温干热烘箱
本生灯
细胞培养孵箱（5% CO2，37 °C）
微量离心机
旋转振荡器
[header]
尼康结构光照明显微镜系统，包括：
配备完美聚焦系统的尼康Eclipse Ti型研究用倒置显微镜
尼康CFI Apo TIRF 100x油镜物镜（数值孔径1.49）
4台Coherent Sapphire激光器（激发波长分别为458、488、514和561 nm）
SIM照明器
尼康载物台控制器
MCL Nano-Drive压电控制器
尼康Intensilight C-HGFIE汞灯
SIM显微镜 enclosure 温度控制系统
Andor EM-CCD相机iXon DU897
配备Microsoft Windows 7家庭版操作系统的计算机
尼康’s NiS Elements 6.14 SIM软件包
尼康A型浸油