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建立一个 体外 大鼠血脑屏障（BBB）模型：重点关注BBB的不可渗透性与受体介导的转运

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DOI：

10.3791/51278

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2014年6月28日

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1VECT-HORUS SAS, 2Aix-Marseille Université, CNRS, NICN UMR 7259

本文内容

摘要

本研究的目的是验证一种方法的可重复性 体外 涉及大鼠同源性内皮细胞与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型。内皮细胞单层具有高TEER值和低LY通透性。检测了特定紧密连接蛋白的表达、对炎症的生理反应以及转运体和受体的功能性。

摘要

血脑屏障（BBB）特异性调控血液与神经组织之间的分子和细胞转运。我们的目标是建立并表征一种高度可重复的大鼠同源性 体外 使用原代大鼠脑微血管内皮细胞（RBEC）与星形胶质细胞共培养构建血脑屏障模型，用于研究跨内皮单层细胞转胞吞作用中涉及的受体。星形胶质细胞经胰蛋白酶消化后通过机械分离获得，并冻存以备后续共培养使用。RBEC来源于5周龄大鼠大脑皮层。脑组织去除脑膜和白质后，经酶消化进行机械解离。随后，将组织匀浆在牛血清白蛋白中离心，以分离血管片段与神经组织。血管片段再经二次酶消化以释放内皮细胞。残留的污染细胞（如周细胞）通过将微血管片段接种于含嘌呤霉素的培养基中进一步清除。随后将细胞传代至滤膜上，与生长于培养板底部的星形胶质细胞进行共培养。RBEC高表达紧密连接（TJ）蛋白，如occludin、claudin-5和ZO-1，且这些蛋白典型地定位于细胞边界。脑内皮单层细胞的跨内皮电阻（TEER）可达300 ohm·cm，表明其紧密连接具有高度完整性。2 平均而言，荧光黄（LY）的内皮通透性系数（Pe）重现性良好，平均值为 0.26 ± 0.11 x 10-3 cm/min。单层排列的脑微血管内皮细胞表达外排转运蛋白P-糖蛋白（P-gp），对P-gp配体罗丹明123表现出极性转运，并显示出转铁蛋白-Cy3和DiILDL特异性穿越内皮细胞单层的运输能力。综上所述，我们提供了一种建立 体外 由于采用了质量保证方法，该血脑屏障模型具有高度可重复性，适用于血脑屏障转运蛋白和受体相关研究。

引言

许多用于治疗中枢神经系统（CNS）疾病的药物无法以具有治疗意义的浓度到达脑实质。血脑屏障（BBB）通过限制离子、肽、蛋白质甚至细胞非特异性地进出大脑，保护脑神经组织免受血浆成分波动和病原体的侵害，并维持脑实质的稳态1。

血脑屏障（BBB）的特性由特化的脑微血管内皮细胞与神经胶质血管单元（NGVU）中邻近组分（如神经元、胶质细胞（更准确地说是星形胶质细胞终足）以及包埋于基底膜中的周细胞）之间的紧密接触和相互作用所诱导并维持，该基底膜主要由IV型胶原、纤连蛋白、层粘连蛋白和蛋白聚糖组成2,3。周细胞在毛细血管水平覆盖约22–32%的内皮细胞表面，在调控内皮细胞增殖、血管生成及炎症过程方面发挥重要作用。内皮细胞形成连续的单层结构，覆盖毛细血管内表面，其细胞间通过紧密连接（TJs）相连，这些连接在细胞顶端区域形成带状结构，有助于细胞极性的建立。星形胶质细胞调控血脑屏障的特性，并是多种重要调节因子的来源，如TGF-β、GDNF、bFGF和IL-6。缺乏GFAP且功能不完整的星形胶质细胞无法有效调控血脑屏障的特性4。神经元虽不直接参与血脑屏障的结构形成，但也能调节多种蛋白表达及血脑屏障功能的重要方面5。

为了进一步研究血脑屏障的结构、生理学和病理学， 体外 血脑屏障模型已被开发为研究工具。已从多种物种中提取脑血管内皮细胞以进行实施 体外 基于牛源低代次原代培养的血脑屏障模型6,7，猪8,9，大鼠10,11,12，小鼠13 以及人类14,15这些模型已知可模拟 体内 血脑屏障，特别是与大鼠或小鼠的胶质细胞和/或周细胞共培养时16,12和/或神经前体细胞分化的星形胶质细胞17 和/或神经元18“在实验室”模型通常使用啮齿类动物制备，因为它们便于 体外 / 体内 转基因模型来源的脑血管内皮细胞的实验与比较和/或研究19.

新开发的 体外 血脑屏障模型还被设计用于在潜在中枢神经系统药物候选物进入临床前，预测其进入大脑的能力 体内 测试15,20,21,3,6,22,11,23. 体外 血脑屏障（BBB）模型通常用于比较药物的转运情况：i）已知能够进入中枢神经系统（CNS）的药物，或在BBB上通透性低且无中枢作用的药物；ii）与在同种动物模型中测得的相同药物的表观渗透系数（Pe）进行比较。能够顺利通过BBB的药物多为脂溶性物质，主要通过脂质介导的自由扩散方式穿越脑血管内皮细胞膜（如咖啡因、卡马西平）。而一些被负向转运的药物，如地高辛、维拉帕米或环孢素A，则会被脑血管内皮细胞上的外排转运蛋白（如P-糖蛋白，P-gp）主动排出。然而，许多新开发的治疗分子属于生物药剂学范畴，例如重组蛋白、小干扰RNA（siRNA）或单克隆抗体。其中大多数无法穿越BBB，原因包括：i）缺乏特异性转运体；ii）内皮细胞紧密排列形成的屏障，阻止高分子量物质通过细胞旁路途径跨膜转运。鉴于上述限制，已采用“特洛伊木马”策略，利用针对BBB上已知受体的载体（如抗体、肽段），这些受体参与受体介导的转运或转胞吞作用（RMT），例如转铁蛋白受体（TfR）、胰岛素受体（Insulin receptor, IR）或低密度脂蛋白受体（LDLR）相关受体家族成员（LDLR、LRP1）。这些受体已在分离的脑毛细血管及血脑屏障中被证实存在。 体内24,25对这些受体（尤其是LDLR家族）的转录谱在脑内皮细胞、与星形胶质细胞共培养的脑内皮细胞以及直接从脑组织中分离的脑毛细血管中进行了分析和比较26. Pardridge24 使用针对转铁蛋白受体（TfR）的OX-26抗体开启该领域研究，随后开展了针对胰岛素受体和胰岛素样生长因子受体的抗体研究27,28。使用 这些基于抗体的载体，ArmaGen Technologies 已开发出一种血脑屏障分子特洛伊马平台技术，用于将药物（包括蛋白质）递送通过血脑屏障29文献中已有大量数据表明，LRP1 在脑内皮细胞中表达，并作为强大的内吞/清道夫受体发挥作用。Western blot 分析表明，LRP1 在富含脑毛细血管的组分以及大鼠脑毛细血管内皮细胞中均有表达。30一些公司（如 Angiochem）利用源自抑肽酶的肽类载体靶向 LRP1，以促进药物高效穿过血脑屏障31然而，LRP1 也参与 Aβ 的主动转运及其从脑实质向血液的外排/清除过程32此类数据表明，LRP1 参与了跨越血脑屏障的双向转运，其作用取决于配体类型。biOasis 公司开发了 Transcend 技术，利用黑色素转铁蛋白作为载体，实现溶酶体酶和抗体等生物制剂跨越血脑屏障的递送33 而VECT-HORUS公司开发靶向LDLR的肽类载体34有数据表明，LRP和LDLR可用于转运不同的分子，例如溶酶体酶。35,36 或纳米颗粒复合物穿越血脑屏障37.

我们的研究领域是利用载体分子及载体化药物候选物向中枢神经系统（CNS）递送药物，以治疗中枢神经系统疾病。特别是，跨越血脑屏障（BBB）的药物递送需在神经炎症的背景下加以考虑。神经炎症的程度可能有所不同，但几乎普遍存在于所有中枢神经系统损伤和疾病中，包括脑炎、多发性硬化症、阿尔茨海默病等。神经炎症常伴随血脑屏障的炎症反应，并可能导致血脑屏障生理功能和通透性的改变，因为在病理状态下，细胞旁和跨细胞转运过程可能被显著增强。38,39,40,41,42,43例如，TNF-α、TWEAK 和其他细胞因子可调节炎症反应，相关实验研究 体外 血脑屏障模型已表明，其能够改变内皮细胞单层的细胞旁通透性38,39,40 并且TNF-α也会导致LDL跨细胞转运增加41全转铁蛋白42 和乳铁蛋白43.

我们的目标是建立并表征一种优化的、高度可重复的大鼠同基因型血脑屏障（BBB）模型，该模型采用原代脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞的共培养体系。我们分别使用5周龄和新生Wistar大鼠来制备脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞。其中一个挑战是建立一种能够实现“每周可重复”BBB模型制备的实验方案。为实现这一目标，整个制备流程的每一步均安排在每周固定的日期进行，从第一周的星期三开始进行脑微血管的制备。在过去三年中，几乎每周都进行了动物解剖操作。为进一步提高细胞培养的可重复性，我们建立了一套质量保证体系。所有试剂和化学品均录入数据库进行管理（包括入库日期、库存量、有效期等信息）。

该模型根据多种标准进行了表征，包括内皮细胞的排列与纯度、跨上皮电阻（TEER）、荧光素钠（LY）通透性、对促炎因子的反应、紧密连接蛋白的定性和定量表达、外排转运蛋白（如P-gp）的功能，以及参与跨内皮细胞单层转胞吞作用的受体（如转铁蛋白受体TfR或低密度脂蛋白受体LDLR）的功能。

方案

1. 大鼠星形胶质细胞的制备

每次制备使用10只任一性别的新生Wistar大鼠。

  1. 使用剪刀剪下大鼠头部以处死动物，并立即将其转移至超净台中的干燥培养皿内。取出脑组织（不含小脑），并立即放入含有冷解剖缓冲液的培养皿中：HBSS 加 1% 牛血清白蛋白 （低内毒素 BSA）、青霉素 100 单位/ml 和链霉素 100 µg/ml。
  2. 将脑组织沿中线切开，分离两个大脑半球，并转移至盛有冰上解剖缓冲液的洁净培养皿中。在体视显微镜下剪除视神经并剥离脑膜。
  3. 用 50 ml 冷解剖缓冲液对皮质组织块进行充分洗涤。
  4. 取 3 只大鼠的皮质组织块置于 15 ml Falcon 管中，加入 6 ml 含 0.05% 胰蛋白酶–0.02% EDTA 的溶液，在 37 °C 下孵育 5 分钟，使用带蓝色枪头的 10 ml 一次性移液管反复吹打数次以实现组织解离。
  5. 加入 24 ml DMEM 培养基，该培养基添加 10% 胎牛血清（FBS）以及青霉素 100 单位/ml 和链霉素 100 µg/ml，此培养基称为胶质细胞培养基（GCM），在室温下以 300 × g 离心 5 分钟。所用 FBS 批次均经过筛选和验证，适用于星形胶质细胞培养物的生长与存活。
  6. 将含有解离细胞的沉淀用 10 ml GCM 重悬，接种至一个 75 cm2 的 T 形培养瓶（T75）中。次日更换培养基以去除细胞碎片和 DNA。此后每周更换两次培养基。
  7. 培养 1 周后，在 37 °C 条件下，使用转速为 60 rpm 的轨道摇床轻轻振荡胶质细胞 24 小时（在 GCM 中进行）。若 T75 培养瓶无法置于含 5% CO2 / 95% 空气、37 °C 的湿润培养箱中，则需在培养基中补充 5 mM HEPES。用缓冲液洗涤细胞两次，以去除未贴壁的的小胶质细胞。
  8. 接种后三周，用不含钙和镁的 DPBS 洗涤细胞两次。加入 3 ml 预热的 0.05% 胰蛋白酶–0.02% EDTA 溶液，在 37 °C 孵育直至细胞层完全分散（通常约 5 分钟）。加入 10 ml GCM 以终止胰蛋白酶活性，将细胞悬液转移至 15 ml Falcon 管中，在 120 × g 条件下离心 8 分钟。
  9. 将星形胶质细胞沉淀用含 90% FBS 和 10% DMSO 的冻存液重悬，分装至冻存管中（每管 2 × 106 个细胞），并储存于液氮中。

2. 大鼠脑微血管的分离

我们的实验方案已获得马赛医学院伦理委员会的批准，并符合国家和欧洲法规（欧盟指令第86/609号）。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦并减少所用动物数量。

  1. 每次制备及每位实验操作者使用3只五周龄的Wistar大鼠。
  2. 第一周的星期一，准备2个T75培养瓶，分别用IV型胶原蛋白和纤连蛋白包被，两者浓度均为1 µg/cm2 在无菌培养水（每T75培养瓶10 ml）中孵育，于37℃静置使其贴壁 °直至微血管接种前均置于 C 条件下。
  3. 第一周的周三上午，在逐渐增加的二氧化碳气流中对大鼠实施安乐死2 诱导嗜睡、姿势丧失和呼吸中断，随后进行颈椎脱位。用70%乙醇喷洒头部。用剪刀剪下头部，并在超净工作台内转移至干燥的培养皿中。
  4. 从颅骨中取出脑组织，去除小脑和视神经，然后将脑组织转移至一个置于冰上预冷并盛有冷解剖缓冲液（HBSS 加 1% BSA、100 单位/毫升青霉素和 100 微克/毫升链霉素）的培养皿中 µg/ml
  5. 将脑组织沿中线切开，分离两侧大脑半球，并分离中脑与前脑。将前脑转移至冰上装有解剖缓冲液的干净培养皿中。
  6. 在新的培养皿中加入几个半球，放入冷解剖缓冲液，在体视显微镜下小心去除前脑的脑膜，使用 N° 5 把弯头镊子。然后清洗脑组织内部，去除髓鞘，获得皮质层。这些步骤应控制在 2 小时内完成，以确保组织保存和细胞存活。
  7. 将3个大脑的皮层组织在7 ml的Dounce匀浆器中用6 ml冷解剖缓冲液进行分离，使用两种不同间隙的研杵各上下研磨10次， µm 后接 20 µm
  8. 将悬液分装，每1 ml含相当于1个皮层组织的量，置于50 ml Falcon管中，在室温下以1,000 × g离心5 min。弃去上清液。
  9. 用1 ml含有胶原酶/分散酶混合物（60）的酶溶液消化来自1个皮层的悬液 µ微克/毫升 – 0.3 单位/毫升，DNase I 型（35 µg/ml – 20 K 单位/ml）和庆大霉素（50 µg/ml）在37℃摇床中孵育30分钟 °C.
  10. 将1个皮层的1 ml消化液与10 ml 25% BSA/HBSS 1X混合，于室温下以3,600 × g离心15分钟，进行密度梯度分离。小心转移上层圆盘（髓鞘和脑实质）及上清液至一个新的50 ml Falcon管中，重复离心一次。将所得含有脑微血管的沉淀物置于4℃保存 °C.
  11. 小心弃去上层组织块和上清液。用1 ml冰冷的1× HBSS重悬含有脑微血管的两个沉淀物，并转移至一个洁净的50 ml Falcon管中。
  12. 加入20 ml冷的HBSS 1X洗涤微血管，于1,000 x g离心5 min，弃去上清液。
  13. 用与步骤2.9中所述相同的酶解液1 ml，将1个皮层的微血管在37℃下进一步消化1小时。 °在摇床中于 C 条件下培养。
  14. 然后，将来自3个皮层的已消化微血管混合至一个离心管中，再分装至两个50 ml Falcon离心管，使每管含有相当于1.5个皮层的微血管。加入30 ml冷解剖缓冲液，于室温下以1,000 x g离心5 min。
  15. 将微血管沉淀物重悬于10 ml DMEM/F12培养基中，该培养基添加有20%牛血小板贫浆来源血清、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，2 ng/ml）、肝素（100 µ微克/毫升），庆大霉素（50 µg/ml）和 HEPES（2.5 mM），命名为添加了嘌呤霉素（4 μg/ml）的内皮细胞培养基（ECM） µg/ml
  16. 从培养箱中取出2个已包被的T75培养瓶，吸除多余的包被液，将每根试管中的微血管分别接种至一个T75培养瓶中（每个T75培养瓶接种来自1.5个皮层的微血管）。

3. RBEC 原代培养细胞的纯化与增殖

  1. 纯化：周三至周五，在培养基中加入 4 µg/ml 的嘌呤霉素。周四更换培养基。周五洗涤细胞，然后加入 2 µg/ml 的嘌呤霉素，持续至下周一。
  2. 增殖：第二周的周一，洗涤细胞，并在培养基中添加胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠补充剂，直至第二周周三细胞达到 90% 汇合度。

4. 分化：实验设置 体外 血脑屏障模型

  1. 第二周的星期一，准备滤膜（聚乙烯，12孔，孔径1.0） μm）通过包被含有 IV 型胶原和纤连蛋白的混合物（浓度均为 0.5）µg/cm2 在无菌培养水（500 µ上室加入混合液，下室加入1.5 ml无菌培养用水。在37℃下孵育，使其贴壁 °C，直至RBEC接种。
  2. 第二周的星期一，即共培养建立前五天，将星形胶质细胞从冻存管中于37℃解冻 °C，转移至含有10 ml GCM的15 ml Falcon管中。在室温下以120 × g离心8分钟。
  3. 将星形胶质细胞沉淀重悬于GCM中，并以30 x 10⁶个细胞/mL的密度接种3 每平方厘米细胞数2 在12孔板中。
  4. 第二周的星期三，在用胰蛋白酶消化RBEC之前，用DMEM/F12培养基清洗预包被的滤膜两次。用ECM预填充室腔：下室加入1.5 ml，上室加入0.5 ml。
  5. 第二周的星期三，用不含钙和镁的DPBS将RBEC洗涤两次。加入4 ml预热至37℃的0.05%胰蛋白酶-0.02% EDTA溶液 °C，每T75培养瓶处理30秒。随后移除3.5 ml胰蛋白酶溶液，并在显微镜下观察。当细胞层开始从基质上脱落时，轻轻敲击T75培养瓶边缘，帮助细胞脱离，直至所有细胞悬浮。
  6. 每T75培养瓶加入9 ml ECM，转移至15 ml Falcon管中。使用带黄色枪头的10 ml移液器，轻轻吹打细胞悬液4次，使细胞充分解离（避免产生气泡）。对悬液中的细胞进行计数（约3 x 106 细胞/T75），并立即以高密度接种于预先包被和预填充的滤膜上（160 × 103 细胞/滤器，因此约18个滤器/T75）（图8次日（星期四），更换上室培养基两次，以去除细胞碎片。
  7. 第二周的星期四，即共培养建立的前一天，将星形胶质细胞培养基更换为1.5 ml分化培养基（含500 nM氢化可的松的ECM） 可补充1/3来自先前共培养（内皮细胞与星形胶质细胞接触培养3天）中基础室的条件培养基。
  8. 第二周的星期五定义为分化的第0天；将含有脑微血管内皮细胞（RBEC）的滤膜中的培养基更换为分化培养基。将含有RBEC的滤膜转移至含有星形胶质细胞的孔中。在此条件下， 体外 模型在3天内分化并表达与连接相关的蛋白质。
  9. 模型在第三周的周一至周三期间保持其最佳分化状态，持续3天。

结果

制备方案
该方案可分为三个阶段，分别对应培养基成分的主要变化：（a）从微血管中纯化内皮细胞，（b）增殖，以及（c）在滤膜（孔径为 1 μm 的 12 孔聚乙烯板）上与星形胶质细胞共培养进行分化。为提高原代细胞培养的可重复性，制备方案的各个步骤被安排在特定的星期几进行（图 1）。在第一周的星期三（即建立共培养系统前 9 天），分离微血管（图 2A）。为纯化内皮细胞，培养物在逐渐降低浓度的嘌呤霉素中维持 5 天。大多数污染细胞（主要是周细胞）被清除，而内皮细胞的生长速度减慢，但其表型未发生改变。从大鼠脑灰质分离出的毛细血管片段中，有纺锤形细胞向外生长（图 2B）。在第二周的星期一，将大鼠星形胶质细胞接种于 12 孔板底部。星期三，将 RBEC 接种至滤膜的管腔侧。以 160 × 103 个细胞/cm2 的高密度接种（图 2C）有助于避免滤膜边缘出现间隙（图 2D），并促进内皮细胞单层的均一性分化。细胞呈现典型的细长纺锤形形态，沿纵向排列，形成均匀的单层结构。星期四，将星形胶质细胞培养基更换为经前一轮共培养基条件化的分化培养基（图 2E）。星期五，将滤膜上的 RBEC 在含有 500 nM 氢化可的松的培养基中继续培养，并将滤膜转移至含有星形胶质细胞的 12 孔板中。在第三周，于星期一至星期三之间进行实验。

脑微血管内皮细胞的表征及单层通透性参数的测定
通过内皮细胞和血脑屏障标志物的免疫染色，以及经内皮电阻（TEER）、荧光素钠（LY）通透性和外排转运体（如P-糖蛋白）功能的测定，对脑微血管内皮细胞进行表征。

通过嘌呤霉素纯化方法获得的脑微血管内皮细胞（RBEC）（图1 和 图2）以非重叠的连续单层形式生长，在汇合时表现出生长抑制，并呈现紧密排列、梭形和纺锤状的形态。RBEC培养物表达内皮细胞的典型标志物：它们对血小板-内皮细胞黏附分子呈免疫染色阳性（图3A；CD31/PECAM），并表达血管性血友病因子（图3B）。若不使用嘌呤霉素处理，RBEC会迅速被周细胞侵入，可通过波形蛋白（desmin）免疫染色检测到（图3C）。星形胶质细胞表达的胶质纤维酸性蛋白（GFAP）（图3D）是星形胶质细胞的重要分化标志物。随着传代次数增加，星形胶质细胞诱导内皮细胞分化的能力会丧失。因此，星形胶质细胞培养物需对其培养时间进行标准化，且仅进行一次传代。

将RBEC在添加氢化可的松的培养基中进行培养，随后与星形胶质细胞共培养，并加入先前共培养体系下室的条件培养基，与单独培养RBEC相比，可显著诱导细胞间紧密连接（TJs）的形成。细胞表达claudin-5、ZO-1和occludin蛋白，免疫荧光结果显示这些蛋白定位于细胞-细胞连接处（图4B-D），Western blot分析也证实了ZO-1和occludin蛋白的存在（图4E）。细胞间接触处呈拉链样形态分布，反映了（a）单层细胞的紧密性，（b）毛细血管内皮细胞的大脑来源特性，以及（c）高度分化的脑内皮细胞的典型特征。通过测量跨内皮电阻（TEER）以及荧光黄（LY，457 Da）从滤器上室向下室的渗透速率，监测内皮层的旁细胞通透性。TEER使用连接至EVOM伏欧表的ENDOHM-12装置测定（适用于12 mm培养插件）。脑内皮单层细胞的TEER平均达到300 ohm · cm2（12孔板滤器，数据未显示）。LY的表观渗透系数（Pe(LY)，作为屏障完整性的对照，并与待测化合物共同孵育）在为期1年的观察期间平均为0.26 ± 0.11 × 10-3 cm/min（图4F）。

为了诱导 RBEC 发生炎症，我们使用 5 ng/ml 的促炎性细胞因子 TNF-α 处理 24 小时，并通过检测培养系统上室 RBEC 分泌的 CCL2（MCP-1）来监测炎症反应，其分泌量从 120 ng/ml（未处理对照组）增加至 250 ng/ml（图 5A）。使用 5 ng/ml 或 50 ng/ml TNF-α 处理 24 小时也会导致血脑屏障开放，这通过 Pe(LY) 的测定结果得以证实（图 5B）。

通过免疫细胞化学法在分化后的RBEC中对P-gp进行可视化图6AP-gp 的定位具有高度极性，主要表达于内皮细胞的顶膜44 而谷氨酸转运蛋白-1（GLT-1）主要存在于基底外侧组分中45为了评估培养的RBEC极化程度，采用蔗糖密度梯度法从质膜制备物中分离顶膜和基底外侧膜蛋白。46. 采用 Western blot 分析法检测血浆、顶膜和基底膜制备物中 P-gp 和 GLT-1 的表达水平。 freshly extracted 的大鼠脑微血管被用作最接近的阳性对照 体内 这些蛋白质的分布（图6B）。在微血管和分化后的RBEC膜制备物中，P-糖蛋白以170 kDa的条带表达，主要定位于F1顶膜组分图6B、CGLT-1在微血管F3基底膜组分中以65–70 kDa的条带形式表达，但在培养的RBEC中未检测到。

在平行实验中，使用罗丹明123（R123）作为配体检测内皮细胞单层中P-糖蛋白（P-gp）的功能活性。R123从基底侧向管腔侧（B到A）的外排量比相反方向高出1.7倍（图6D）。为证实P-gp的参与作用，我们使用了特异性P-gp抑制剂维拉帕米（25 µM，预孵育30分钟）和环孢素A（1 µM，预孵育30分钟）。与未处理对照组相比，经维拉帕米和环孢素A处理后，脑微血管内皮细胞（RBEC）中R123的积累分别增加了1.6倍和2倍（图6E）。

受体介导的转胞吞作用（RMT）机制中涉及的受体
该模型进一步表征了在血脑屏障（BBB）转胞吞机制中可能发挥作用的多种受体的表达情况，例如 LRP1、LDLR 或 TfR（图 7A）。

使用转铁蛋白受体（TfR）和低密度脂蛋白受体（LDLR）的配体进行功能性转运研究。活的大鼠脑微血管内皮细胞（RBEC）在37 °C下与CY3标记的大鼠转铁蛋白（Tf-Cy3）共同孵育180分钟 37 °C (图7B、C). 转铁蛋白-Cy3 摄取与转运在大鼠中的定量分析 体外 BBB模型显示，曲线的斜率在超过2,400皮摩尔后略有下降图7B)，表明结合/摄取过程具有可饱和性。此外，结合/摄取的饱和与Tf在下室中的积累呈相关性。为验证这一观察结果，将Tf-Cy3在1,200皮摩尔（曲线上升段）和过量非荧光Tf（4,800皮摩尔，平台期/饱和浓度）条件下进行孵育（图7C）。这些实验显示下室中Tf-Cy3的累积减少，证实了在我们的体系中存在典型的配体-受体相互作用所特有的可饱和机制 体外 血脑屏障模型。

类似地，LDLR 的功能通过其配体 DiILDL 跨内皮细胞单层的摄取与转运得以证实（图7D、E）。活的RBEC与DiILDL在37°C下孵育30分钟 37 °C. 结合/摄取与DiILDL在下室的积聚无相关性图 7D). DiILDL 转运的定量结果显示，曲线的斜率在超过 2 µg，表明在本模型中，转运过程具有可饱和性且与受体相关。在DiILDL孵育前15分钟，加入0.05%的叠氮化钠图7E）。通过Pe评估了0.05%叠氮化钠孵育的无毒性(LY) 测量（数据未显示）。这些实验显示，下室中 DiILDL 的累积减少。总体而言，我们的结果提示 DiILDL 在我们的模型中存在受体介导的转胞吞作用（RMT） 体外 血脑屏障模型

其他 体外 基于大鼠脊髓内皮细胞或小鼠脑内皮细胞的血脑屏障模型
使用胶原酶/分散酶混合物进行酶消化是控制脑微血管细胞活力和产量的关键参数之一。酶的浓度，尤其是酶与组织量之间的比例，需要在大鼠脑、大鼠脊髓和小鼠脑之间进行精确校准。微血管接种密度以及达到90%融合度所需的内皮细胞数量（微血管接种后9天）密切相关，是改善细胞生长、限制群体倍增次数和提升模型质量的重要参数。大鼠脊髓微血管的制备采用了与本文所述大鼠脑微血管相同的操作流程（在组织用量方面，2条脊髓约相当于1个脑组织），以在相同时间范围内获得每T75培养瓶相当的细胞数量。来自5周龄C57Bl6小鼠脑的脑膜难以去除，因其紧密附着于皮层。对脑组织进行短暂的分散酶处理有助于脑膜的剥离。本文重点强调并总结了从大鼠脑、大鼠脊髓和小鼠脑制备可重复性内皮细胞单层的关键参数。 图8.

Rat brain microvessel isolation and purification process; chart detailing 3-week timeline experiment.
图1. 总结主要步骤的流程图 体外 血脑屏障模型制备 为了提高原代内皮细胞培养的可重复性，将生产流程的各个步骤分配至每周的特定日期。该流程始于第一周的星期三，从5周龄的Wistar大鼠中分离微血管。

细胞培养显微镜观察，生长阶段；实验装置示意图，细胞黏附过程。
图2. RBEC、星形胶质细胞及共培养系统的相差显微照片。（A）接种时5周龄Wistar大鼠脑微血管片段。（B）接种后第3天的RBEC培养物，用P-糖蛋白底物嘌呤霉素（4 µg/ml）处理2天。（C）接种至12孔板中经IV型胶原和纤连蛋白包被的Millipore滤膜上后第1天形成的致密内皮单层细胞。（D）插入式滤膜边缘处细胞单层的均一性。（E）共培养建立当天的致密星形胶质细胞培养物，显示典型的蜂窝状形态。（F）共培养系统示意图，显示照片C、D和E的拍摄位置。

细胞骨架和细胞核染色的荧光显微镜图像；细胞结构分析。
图3. 脑微血管内皮细胞（RBEC）培养物的免疫荧光显微镜表征。 (A) 脑内皮细胞在细胞边界处表达血小板内皮细胞黏附分子PECAM/CD31；(B) 血管性血友病因子（VWF）呈现相对点状染色，在某些细胞中比其他细胞更亮且更聚集，并集中在核周区域；(C) 未经嘌呤霉素处理的RBEC培养物中，周细胞对结蛋白（desmin，绿色）呈免疫染色阳性，并具有典型的小而圆的细胞核；(D) 星形胶质细胞表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP）。请点击此处查看该图的放大版本。

Immunofluorescence microscopy of endothelial cells, protein expression analysis, Western blot, BBB model.
图4. 大鼠的免疫细胞化学表征 体外 血脑屏障模型及荧光素黄（LY）在内皮单层中的旁细胞通透性 细胞单层用免疫染色法进行染色 （A） 波形蛋白，以显示融合的脑血管内皮细胞单层，细胞形态不重叠，呈典型的内皮细胞形态，具有梭形细胞特征，并表达紧密连接蛋白 （B） claudin-5 (C) ZO-1 和 (D) occludin，也通过蛋白质印迹检测ZO-1和occludin蛋白 (E). (F) 通过测量小分子亲水性物质荧光黄（LY-CH，二锂盐）的转运情况来评估12孔血脑屏障模型中的单层细胞紧密性。荧光黄分子量为457 Da，已知可被血脑屏障阻留。简言之，将荧光黄加入培养系统的上室，使其与脑微血管内皮细胞接触，于37°C孵育60分钟 37 °C. 此后，收集下室中的培养基，并使用荧光分光光度计在激发波长430 nm、发射波长535 nm条件下通过荧光分析法测定荧光强度。结果以通透性或Pe值表示，单位为10-3 cm/min。当LY的Pe值高于0.6×10⁻⁶ cm/min时，认为屏障具有通透性或处于开放状态。-3 cm/min。在每次持续1小时的实验中，将平均清除体积对时间作图，并通过线性回归分析估算斜率。对照组滤膜（涂有IV型胶原-纤连蛋白）清除曲线的斜率记为PSf，含脑微血管内皮细胞单层滤膜清除曲线的斜率记为PSt。内皮细胞单层的PS值（PSe）通过以下公式计算： 请点击此处以查看此图的放大版本。

电学组件效能公式，显示 1/Pse = 1/Pst - 1/Psf；公式展示。

将PSe值除以多孔膜的面积（12孔板中Millipore滤膜的面积为1.1 cm2），得到通透系数（Pe），平均值为0.26 ± 0.11 × 10-3 cm/min。结果以垂直散点图形式展示，共90次实验（每次实验取3至6个单层细胞的平均值）。

MCP-1 释放和细胞旁通透性柱状图；TNF-α 对 RBEC 作用 24 小时的影响。
图 5. 体外 血脑屏障模型对促炎因子 TNF-α 处理的响应。 在 TNF-α 处理前，更换培养系统的培养基，并在上室加入 5 ng/ml TNF-α，分别作用 6 小时、12 小时和 24 小时。通过 ELISA 法检测上室中 RBEC 释放的 CCL2，并与未处理的对照组进行比较。需注意的是，即使在未处理的孔中，MCP-1 水平也随时间略有升高。通过荧光素标记的鬼笔环肽（LY Pe(LY)）测定内皮细胞屏障完整性，结果显示，经 5 ng/ml 或 50 ng/ml TNF-α 处理 24 小时后，单层细胞通透性分别增至 0.62 ± 0.02 × 10-3 cm/min 和 0.7 ± 0.01 × 10-3 cm/min，而对照组为 0.33 ± 0.03 × 10-3 cm/min（Student’s t 检验，p < 0.05）。

Immunofluorescence microscopy, protein expression, Western blot, RBEC transport activity graph.
图6. P-糖蛋白外排转运体功能及脑微血管内皮细胞极化 星形胶质细胞共培养条件下脑血管内皮细胞中外排转运蛋白 P-gp 的免疫细胞化学表达检测 （A） 以及蛋白质印迹法 (B & C)细胞膜蛋白使用细胞蛋白分级试剂盒提取。通过低渗裂解和差速离心获得质膜，以去除细胞器和细胞核。利用蔗糖密度梯度分离质膜中的顶膜和基底外侧膜蛋白。P-糖蛋白主要定位于顶膜组分（F1），而谷氨酸转运体-1（GLT-1）主要定位于基底外侧膜组分（F3）。铺板前的纯化微血管用于作为对照 体内 这些蛋白的定位。通过测定P-gp底物R123的转运极性来确定P-gp的活性。R123的转运通量 1 µM R123 持续测量 1 小时 37 °C 管腔侧到外膜侧 （A 至 B） 以及相反的基底侧到管腔侧 （B 到 A） 方向。在未使用RBEC的情况下进行了相同的实验，以评估跨插件滤膜的被动扩散，并将数据相对于该条件下的值进行归一化处理以计算Pe。(R123) 计算（参见 图5 Pe 计算方法图注）。使用荧光分光光度计测定两个腔室中的 R123 含量（激发波长 485 nm，发射波长 535 nm）。数据以基于 Pe 的管腔至非管腔转运率为 100% 进行表示(R123) （A 至 B）维拉帕米（Verapamil）25 µM，30 分钟预孵育）和环孢素 A（1 µM，30分钟预孵育）作为参考的P-gp抑制剂。在有或无P-gp抑制剂预孵育的情况下，测定RBEC中R123的累积量（Student t检验，p < 0.05). 请点击此处以查看此图的放大版本。

细胞摄取与转运示意图；包含蛋白质（LRP1、LDLR）的荧光显微镜图像，以及不同孵育时间下Tf-Cy3和DiILDL转运结果的摄取曲线图。
图7. 受体介导的转胞吞作用（RMT）中相关受体的表征。（A） 分化的RBEC单层细胞使用针对低密度脂蛋白相关受体1（LRP1）和低密度脂蛋白受体（LDLR）的抗体进行免疫染色。对RBEC进行共聚焦成像，检测DiILDL（LDLR的荧光配体）和大鼠转铁蛋白-Cy3（TfR的荧光配体）的摄取情况，结果显示细胞表面呈点状染色，部分在核周区域聚集。（B） 将大鼠Tf-Cy3以每插入物75、150、300、600、1,200、2,400和4,800皮摩尔的浓度加入含有分化RBEC单层细胞的上室，在37 °C孵育180分钟（上室200 µL，下室1,200 µL）。孵育结束后，通过荧光分光光度计（激发波长550 nm，发射波长570 nm）对细胞裂解液（200 µL含0.1% Triton X100的PBS）和下室中的Cy3荧光进行定量分析。荧光单位通过线性工作范围转换为皮摩尔数。（C） 在饱和实验中，将大鼠Tf-Cy3以每插入物1,200皮摩尔的浓度加入含有分化RBEC单层细胞的上室，在37 °C孵育180分钟，部分样品在加入前15分钟预孵育4,800皮摩尔/插入物的非荧光转铁蛋白（Tf）。下室中的转运量按（B）中方法进行定量（Student’s t检验，p < 0.05）。（D） 将DiILDL以每插入物1、2、4和8 µg的浓度加入含有分化RBEC单层细胞的上室，在37 °C孵育30分钟（上室200 µL，下室1,200 µL）。孵育结束后，通过荧光分光光度计（激发波长554 nm，发射波长571 nm）对细胞裂解液（200 µL含0.1% Triton X100的PBS）和下室中的DiI荧光进行定量分析。荧光单位通过线性工作范围转换为微克（µg）。（E） 在转运阻断实验中，于37 °C孵育DiILDL（2 µg/插入物，30分钟）前15分钟，加入0.05%的叠氮化钠。下室中的转运量按（D）中方法进行定量（Student’s t检验，p < 0.05）。通过Pe(LY)测定评估0.05%叠氮化钠孵育无细胞毒性（数据未显示）。请点击此处查看该图的放大版本。

大鼠脑研究；ZO-1、occludin免疫荧光图像；细胞汇合数据；实验表格。
图8. 体外血脑屏障模型来源于大鼠脊髓内皮细胞或小鼠脑组织。 该表格列出了从大鼠脑、大鼠脊髓和小鼠脑组织中提取微血管的重要参数。显微照片显示了来源于大鼠脑、大鼠脊髓和小鼠脑组织的内皮细胞单层中ZO-1和occludin的免疫染色结果。

讨论

我们描述了一种可重复的周度实验方案，用于脑微血管的分离与接种，在经过纯化及大鼠脑微血管内皮细胞（RBEC）的培养后，进一步建立与原代大鼠星形胶质细胞的共培养体系，以构建一个 体外 具有典型血脑屏障特性的血脑屏障模型。

成功建立标准化 体外 BBB 培养需要在该过程的多个连续步骤中保持最佳条件。该模型经过优化以获得最低的旁细胞通透性，这仍是该领域的“圣杯”。 体外 BBB 模型，以及 (b) 针对外排和受体介导的转运机制进行了验证。

脑微血管内皮细胞的制备、纯化与增殖

培养脑微血管内皮细胞（RBEC）时最大的挑战在于实现不同培养批次间的可重复性。该方案的标准化需要高质量的解剖工具、高质量的试剂，并严格遵守试剂的有效期。实验人员必须熟练掌握在体视显微镜下进行显微解剖的技术，以快速去除大脑皮层表面的脑膜和大血管。在脑组织被分离并进行机械解离后，一个主要挑战是新鲜分离的脑微血管的最佳酶消化条件。所用酶的种类和质量至关重要。本研究采用高浓度且批次间差异较小的I型和II型胶原酶与dispase混合酶。此外，酶消化的时间以及酶浓度、组织重量与消化体积之间的比例也十分关键。最佳的脑微血管产量是在两次消化过程中，分别使用相当于一个脑的皮层组织加入1 ml 酶混合液（胶原酶/dispase，60 µg/ml），消化时间分别为30分钟和1小时的条件下获得的。

同样关键的是清除污染细胞（星形胶质细胞和主要是周细胞）。这些细胞的增殖速度高于内皮细胞，且不能与内皮细胞形成紧密连接，从而阻碍了具有良好旁细胞限制性的均一细胞单层的建立。由于脑内皮细胞表达的外排泵（尤其是P-gp）水平显著高于微血管中其他类型的细胞，因此它们更能耐受对其他细胞具有毒性的P-gp配体药物浓度，而非内皮细胞则被清除。在培养的前两天使用4 µg/ml嘌呤霉素处理，随后再以2 µg/ml继续处理两天，可获得较高纯度的内皮细胞。该筛选过程还可优先保留毛细血管内皮细胞，而非小静脉、前毛细血管微动脉或较大微血管来源的内皮细胞，从而形成更紧密的单层结构。此外，使用无血小板血浆来源的牛血清是获得纯内皮细胞培养的必要条件47,48。这种血浆来源的血清缺乏血小板源性生长因子（PDGF），而PDGF对成纤维细胞、平滑肌细胞以及周细胞具有促有丝分裂作用。

我们观察到，使用小鼠IV型胶原和人纤维连接蛋白的混合物处理塑料器皿和滤膜，与传统推荐使用的鼠尾I型胶原相比，可显著提高细胞增殖产量，达2倍之多。细胞外基质可提供促进细胞增殖的重要信号，例如整合素以及生长因子（bFGF）的激活49。已有研究指出，培养基的缓冲液浓度和pH值对细胞旁通路紧密性具有积极影响50，我们发现添加5 mM HEPES缓冲液后，不同培养之间的重复性更佳。

脑微血管内皮细胞的分化：在插入式滤膜上建立共培养体系

待脑微血管内皮细胞经纯化并增殖培养6天后，可将其接种于滤膜上。高密度接种对形成完整单层细胞至关重要。推荐接种密度为160×10³个细胞/滤膜。3 每12孔板滤膜接种细胞数量足以在接种后24小时形成融合的单层细胞。然而，从其微环境中分离原代脑毛细血管内皮细胞在血脑屏障构建中存在悖论 体外 模型，因为已知原代细胞尤其是脑毛细血管内皮细胞受到其微环境及周围不同类型细胞所产生的诱导因子的强烈调控。单独培养的脑毛细血管内皮细胞会迅速去分化，并丢失部分特异性的脑内皮标志物。因此，原代内皮细胞应使用低代次（P1）细胞，并通过与星形胶质细胞共培养或使用星形胶质细胞条件培养基，至少部分地重建其与微环境的联系47,51这一点在星形胶质细胞分化过程中同样成立，因为脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞之间存在双向诱导作用。将原代脑微血管内皮细胞（RBEC）与星形胶质细胞共培养，可显著诱导内皮细胞间紧密连接（TJ）的形成。52,23重新诱导的分子机制在很大程度上仍不清楚，目前多个实验室正在开展研究，以鉴定星形胶质细胞分泌的特定调节因子，这些因子可能促进内皮细胞的最佳分化53,54脑内皮细胞分泌的因子，包括白血病抑制因子（LIF），已被证明可诱导星形胶质细胞分化55,56在建立共培养体系之前，星形胶质细胞被暴露于含有糖皮质激素受体激动剂氢化可的松和共培养条件培养基的分化培养基中。已知氢化可的松可增强脑微血管内皮细胞的紧密性，在血脑屏障模型中尤其常用于大鼠来源的细胞57 和小鼠58,59 内皮细胞。在内皮细胞/星形胶质细胞共培养体系中，于培养3天后收集下室的条件培养基，并冷冻保存以备后续使用。使用共培养条件培养基可将内皮细胞分化时间缩短至3天，并在随后2天内维持最佳的细胞旁通透性，同时提高了不同培养批次间的可重复性。

总体而言，我们所描述的方案可重复地获得超过 300 ohm · cm2  的跨上皮电阻（TEER），以及平均旁细胞通透系数 Pe(LY) 为 0.26 ± 0.11 × 10-3 cm/min，与目前最优的基于原代细胞的血脑屏障（BBB）模型相当22,12。本论文中所描述的方案，结合所建议的微血管酶消化调控方法，可进一步拓展应用于大鼠脊髓60 和小鼠脑组织来源的内皮细胞。

分子与功能表征

除了诱导紧密连接外，星形胶质细胞还促进脑微血管内皮细胞中P-gp等外排转运蛋白的表达61我们确实展示了外排转运蛋白P-gp在血脑屏障模型中的表达，并通过生化方法证明了P-gp外排泵定位的极性，以及通过功能实验验证了P-gp的活性。在微血管的基底膜组分中检测到GLT-1的表达，但在培养的大鼠脑微血管内皮细胞（RBEC）中未检测到。我们推测，与体内情况相比，GLT-1在培养的RBEC中表达下调 在体 条件，因此无法通过蛋白质印迹分析检测。过量的谷氨酸具有神经毒性 体内 GLT-1 负责将谷氨酸从基底侧室（实质）转运至顶侧室（血液循环）。在星形胶质细胞培养中，GLT-1 的表达水平始终很低，可通过在培养基中添加谷氨酸诱导其表达62,63.

我们还证实了位于顶膜的内流转运体（如 LRP1、LDLR 和 TfR）的表达。TfR 和 LDLR 的功能已通过转铁蛋白-Cy3（Tf-Cy3）和 DiLDL 从单层细胞管腔侧至基底侧的结合与转运实验得到验证，该结果与此前在牛源模型中的研究一致。 体外 血脑屏障模型64有趣的是，已有研究表明，星形胶质细胞对脂质的需求会增加脑毛细血管内皮细胞上LDLR的表达65,66 进一步证实了星形胶质细胞与脑血管内皮细胞之间的生理串扰，包括 体外 我们选择使用荧光染料（如 Cy3 和 DiI）来示范运输过程，因为大多数实验室都具备荧光分光光度分析条件，该方法可用于验证 体外血脑屏障 模型。然而，荧光定量的灵敏度远低于放射性检测，需要增加实验次数以获得显著数据。理想情况下，转铁蛋白（Tf）和低密度脂蛋白（LDL）通常采用放射性碘（碘-125）标记，用于此类结合/摄取和转运实验。

我们还发现，采用本方案获得的已分化内皮细胞单层在TNF-α诱导的炎症刺激下可产生响应，表现为CCL2的释放和血脑屏障（BBB）的开放。CCL2（MCP-1）及其受体CCR2参与多种中枢神经系统（CNS）病理过程，如多发性硬化症、实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）67、CNS创伤68，并被公认为在神经炎症条件下介导白细胞向CNS迁移的重要因子69,70。由于BBB开放使得CCL2在上腔（顶侧）和下腔（基底侧）之间的浓度趋于平衡，因此在本实验方案中无法判断CCL2是否存在极性分泌。因此，我们对24小时时脑微血管内皮细胞（RBEC）在顶侧腔室中实际产生的CCL2量明显低估（图5A）。

血脑屏障的总体概述与局限性 体外 模型： I体内 与 体外 啮齿类与人类的比较

许多有前景的中枢神经系统药物已证明能有效通过血脑屏障 体外 因临床前模型预测性不足而在临床试验中失败 体外 血脑屏障模型通常基于从非人类物种分离的细胞。据我们所知，该 体外 血脑屏障模型在研究蛋白质网络、信号转导、转运蛋白和受体等机制性问题时可能更具预测性。每一个待研究的机制、通路或靶点 体外 必须通过互补的环境信号（其他细胞类型、化学物质、蛋白质）来表征其调控机制 并合并 原位 采用相同动物物种的研究，以及在可能的情况下，采用从人类分离的微血管和内皮细胞进行的研究，但需遵循下文所述的限制与注意事项。

体外血脑屏障（BBB）模型应被视为独立的系统，与机体调控相隔离，但仍具备主要的体内特性，并具有响应环境信号进行调控的潜力。目前尚未提出一种“理想”的体外BBB模型71,72,73，因为内皮细胞单层缺乏神经-胶质血管单元（NGVU）中的多种重要组分，且脱离了血液和机体的调控。在最常见且“最容易构建”的基于星形胶质细胞诱导分化的内皮细胞体外BBB模型中，缺乏周细胞74,16或神经元17,18，或所使用的塑料包被物、细胞外基质成分、培养基及血清的不同，可能会影响蛋白质表达，从而与体内情况产生差异75。这些模型可能表达许多体内存在的转运体，但并非全部。在某些情况下，转运参数首先在分离的微血管（最接近体内状态）中验证，然后再在细胞培养系统中进行研究76,61。

分子生物学研究使得对分离的微血管以及来自相同物种或不同物种的低代次内皮细胞培养物中的基因和蛋白质表达进行表征成为可能，这些研究最常以小型动物（如小鼠和大鼠）或牛、猪与人类之间的比较为主77,78,75,15转录组学比较 体内 和 体外 脑微血管内皮细胞显示出大量差异表达的基因转录本，其中大多数往往显著下调 体外转录编码转铁蛋白受体（TfR）等内流转运蛋白以及参与囊泡运输的蛋白质的mRNA在培养的脑微血管内皮细胞中主要呈下调状态，提示此类细胞的内吞作用和囊泡运输功能普遍减弱。通过嘌呤霉素处理提高细胞纯度，以及氢化可的松处理，可能有助于恢复更“体内-样”基因表达谱77转录组学研究还揭示了物种间的重要差异，这些差异使得基于啮齿类动物来预测人类药物吸收情况变得更加复杂 体外 血脑屏障模型75. 体外 已有关于人脑微血管内皮细胞与星形胶质细胞共培养的血脑屏障模型的描述15尽管相关，但这些模型在常规应用中较难实施，因为它们需要对死后人体组织进行受控获取，且人脑微血管内皮细胞的质量和特性因供体的年龄、疾病状况以及可能的药物治疗而存在异质性。有必要进一步努力开发新的 体外 更准确地再现生理、解剖和功能特征的模型 体内 血脑屏障。涉及三种细胞类型的共培养体系限制性很强，似乎难以常规实施。迄今为止，最复杂的 体外 血脑屏障模型是动态的 体外 包含星形胶质细胞并具有血管样结构以及模拟血流的培养基流动的模型（DIV-BBB） 75,79,80,81,82,83,84,85当脑微血管内皮细胞受到流体作用时，所产生的剪切应力会激活细胞表面的机械感受器，进而调控多种参与内皮细胞生理功能的基因表达，如细胞分裂、分化、迁移和凋亡等。80. 在体内， 血流产生的剪切应力可导致细胞接触处的有丝分裂停滞，从而促进血管内皮细胞单层结构的形成80. 正常人脑微血管内皮细胞的基因组学与蛋白质组学分析揭示了剪切应力对血脑屏障内皮细胞生理功能的影响84剪切应力有助于细胞存活、内皮细胞黏附程度更高、外排泵的诱导以及转运蛋白的更好极化75，葡萄糖代谢的调控75,86，由CYP450酶介导的氧化反应75 通过上调编码紧密连接蛋白（如occludin和ZO-1）等细胞间连接元件的基因表达，调节细胞旁通透性87,75,80 因此，TEER值较高，约为1,500 - 2,000 ohm · cm2，最接近已知的 体内 参数79,80

在生物技术和制药行业中，由于药物的常规筛选甚至高通量筛选（HTS）的需求，以及减少动物实验的努力，推动了多种细胞系的开发，以替代难以常规建立的脑微血管内皮细胞原代培养。大多数情况下，通过质粒DNA转染或逆转录病毒载体感染，将永生化基因（如SV40或polyoma病毒大T抗原或腺病毒E1A）导入脑微血管内皮细胞的原代培养物中，从而获得可长期传代的细胞模型。88,89,75已开发出多种源自脑部的内皮细胞系，例如 RBE4、GP8/3.9、GPNT、RBEC1、TR-BBBs 或 rBCEC4 大鼠细胞系88,75小鼠 b.End3 细胞系90,75， PBMEC/C1–2 猪细胞系87,75，以及hCMEC/D3人细胞系89,75其他模型基于非脑源性细胞，例如Madin-Darby犬肾（MDCK）或Caco2细胞系12,75在不同的人类脑微血管内皮细胞系中，hCMEC/D3 自2005年建立以来，已被广泛引用并改进为血脑屏障（BBB）的研究模型。91,92与原代培养相比，细胞系具有优势和局限性。它们比原代培养更易于操作，具有更长的生命周期，特征明确，且有利于大规模实验之间的可重复性。然而，细胞系可能丧失组织特异性功能，失去微环境调控能力，并获得与原始细胞差异较大的分子表型。 体内75,89特别是，由细胞系生成的单层细胞紧密性降低，TEER值较低，且表现出转运蛋白谱的变异75,89因此，尽管动物实验或原代细胞研究更为复杂，但仍常被优先选用。

披露

Michel Khrestchatisky 是 UMR7259 实验室主任，同时也是 VECT-HORUS 生物技术公司的联合创始人和科学顾问。

致谢

感谢Fonds Unique Interministériel（FUI/MEDUL项目）为VECT-HORUS提供的资金支持，以及法国国家科研署（ANR，TIMPAD、VECtoBrain、VEC2Brain、ADHOC和PREVENTAD合作项目）为VECT-HORUS和UMR7259实验室提供的资金支持。UMR7259实验室还感谢法国国家科学研究中心（CNRS）和艾克斯-马赛大学（Aix-Marseille Université）提供的资金支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
BSA 第 V 组分，低内毒素PAAK45-011-500g4 °C 
青霉素-链霉素Invitrogen15140-122-20 °C
0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)Invitrogen25300-054-20 °C
DMEM 高糖Invitrogen61965-0264 °C 
胎牛血清Invitrogen10270-098-20 °C / 1 年
T75 培养瓶Becton Dickinson Falcon353135
HEPES 缓冲液 (1 M)Invitrogen15630-0564 °C / 1 年
小鼠 IV 型胶原酶 (10 x 1 mg)Becton Dickinson356233-20 °C / 1 个月
人血浆纤连蛋白 (5 mg)Becton Dickinson356008-20 °C / 1 个月
Vannas 弹簧剪刀，直头 (9 cm)Fine Science Tools91500-09
剪刀，直头 (9 cm)Fine Science Tools14568-09
Dumont #5/45 镊子 (11 cm)Fine Science Tools11251-35
Graefe 镊子，尖端宽度 0.8 mmFine Science Tools11050-10
Graefe 镊子，弯头尖端宽度 0.8 mmFine Science Tools11051-10
胶原酶/分散酶混合物 (2 x 5 mg)Roche Diagnostics05 401 054 001-20 °C / 3 个月
DNase I (100 mg / 569 KU / mg)Sigma AldrichDN25-100 mg-20 °C / 1 年
庆大霉素 (10 mg/ml)Invitrogen15710-0494 °C / 1 年
DMEM/F12Invitrogen31331-0284 °C 
来自血小板贫乏血浆的牛血清 (500 ml)ClinisciencesBT-214-100-20 °C / 1 年
bFGF (10 µg)Invitrogen13256-029-20 °C / 6 个月
猪黏膜肝素钠盐 I 型Sigma AldrichH3149-100KU4 °C / 1 年
嘌呤霉素Sigma AldrichP8833-10 mg-20 °C / 6 个月
ITSXInvitrogen51500-0564 °C / 1 年
用于 12 孔板的聚乙烯悬挂式细胞培养插件MilliporePIRP15R48孔径：1 µm
表面积：1.1 cm2
氢化可的松Sigma AldrichH0888-1 g-20 °C / 1 年
小鼠抗 CD31 / PECAM ChemiconMAB1393，克隆 TLD-3A12 (1 mg/mL)1/200 - 4% 多聚甲醛固定
兔抗冯·维勒布兰德因子ChemiconAB73561/200 - 4% 多聚甲醛固定
小鼠抗结蛋白ChemiconMAB34301/200 - 4% 多聚甲醛固定
小鼠抗波形蛋白Invitrogen, Zymed08-0052 克隆 V9, (58 µg/ml) 1/50 - 4% 多聚甲醛固定
小鼠抗 Claudin-5Invitrogen, Zymed35-2500, (500 µg/ml)1/200 - 4% 多聚甲醛固定
兔抗 ZO-1Invitrogen, Zymed61-7300 (250 µg/ml)1/200 - 4% 多聚甲醛固定
兔抗 Occludin Invitrogen, Zymed71-1500 (250 µg/ml)1/200 - 4% 多聚甲醛固定
Alexa Fluor 488、594 标记的二抗Invitrogen1/800
荧光黄 CH，二锂盐Sigma AldrichL0259-20 °C
人 TNF-αPeproTech300-01A-20 °C
大鼠 MCP-1 ELISA 试剂盒PeproTech900-K594 °C / -20 °C
小鼠抗 P-糖蛋白Covance, EurogentecSIG-38710-1000，克隆 C219 (1mg/mL)1/400 - 4% 多聚甲醛固定
1/200（Western blot）
兔抗 GLT-1Abcamab416211/1,000（Western blot）
罗丹明 123Sigma Aldrich837024 °C
盐酸维拉帕米Sigma AldrichV46294 °C
环孢素 ASigma Aldrich300244 °C
单克隆抗 a2 巨球蛋白受体（CD91, LRP1），靶向氨基酸 4291-4344 区段内的 EGF 重复序列American Diagnostica3501 (100 µg/ml)1/5 - 4% 多聚甲醛固定
小鼠抗 LDLRR&D systemsAF2255 (200 µg/ml)1/50 - 4% 多聚甲醛固定
大鼠转铁蛋白-Cy3GentaurJOR1600504 °C
DiILDLInvitrogenL-34824 °C

参考文献

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