本文介绍了一种利用近期开发的图像分析平台PhenoRipper，快速分析和探索荧光显微镜图像集合的工作流程。
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摘要
摘要
尽管高通量显微镜技术发展迅速，基于图像的定量检测仍然面临重大挑战。虽然已有多种专用的图像分析工具，但大多数传统的基于图像分析的工作流程学习曲线陡峭（需要精细调整分析参数），并且在成像与分析之间导致较长的周转时间。特别是细胞分割——即在图像中识别单个细胞的过程——在这一过程中构成了主要瓶颈。
本文介绍一种基于 PhenoRipper 的替代性工作流程，该流程无需进行细胞分割。PhenoRipper 是一个开源软件平台，专为显微图像的快速分析与探索而设计。本文所述流程针对细胞培养物的免疫荧光显微图像进行了优化，仅需极少的人工干预。在半小时内，PhenoRipper 即可完成对典型 96 孔实验数据的分析并生成图像特征谱。用户可由此直观地浏览实验数据，进行实验质量控制，确认样本对扰动的响应，并检查重复样本之间的可重复性。该方法在分析与实验之间建立起快速反馈循环，对于检测方法优化至关重要。本方案不仅适用于质量控制的初步分析，也可作为端到端的完整解决方案，尤其适用于筛选实验。此处描述的工作流程可扩展至高通量筛选所产生的大规模数据集，并已在多种生物系统中被证实能够根据表型准确聚类实验条件。PhenoBrowser 界面提供了一个直观的框架，用于探索表型空间，并将图像特征与生物学注释相关联。综上所述，本文所述方案将降低采用基于图像筛选的定量分析的技术门槛。
引言
在过去十年中，成像技术的快速发展使许多实验室具备了进行高通量显微成像的能力。当前的挑战已从成像本身转向数据分析：我们如何对典型高通量成像筛选所产生的大量复杂而细微的表型进行表征、比较和深入分析？
多种图像分析与信息学平台已为用户提供先进的工具箱1-3，用于从大量图像集合中提取生物学信息。然而，在分析高通量图像筛选所产生的数据时，仍存在诸多重要障碍。选择合适的图像表征方法以及针对特定研究系统精细调整算法参数的过程往往十分困难，尤其对于缺乏图像分析专业知识的用户而言，常导致漫长的前期设置时间。其中，细胞分割——即在图像中识别单个细胞的过程——是当前的主要瓶颈。分割结果可能对细胞类型、细胞密度和生物标记物等实验参数高度敏感，通常需要对大型数据集进行反复调整。因此，图像分析常常由专业人员作为独立的最终步骤来完成，而非实验流程中的整合环节。这阻碍了分析与实验之间的快速反馈循环，而该循环正是检测方法开发中的关键组成部分。
本文描述了一种优化的高通量荧光显微成像工作流程，可避免前述诸多技术难题。为此，我们采用了 PhenoRipper4，这是一种开源软件平台，用于显微图像的快速浏览与分析。PhenoRipper 的显著优势在于无需进行细胞分割，从而规避了相关技术挑战。该方法不尝试识别单个细胞，而是将图像分割为亚细胞尺度的像素块，并基于其所含像素块的特征对图像进行表征。具体而言，PhenoRi....
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方案
1. 样品制备与成像
- 细胞培养
- 常规进行细胞分传，并维持细胞融合度在20%-70%。实验前一天，将HeLa细胞接种于DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基，见材料表）中培养，添加10%胎牛血清（FBS）和1×青霉素/链霉素。
- 实验当天，将培养皿中生长至约50%汇合度的细胞进行传代。
- 用 PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞，加入约 2 ml 胰蛋白酶/EDTA（乙二胺四乙酸）处理数秒。吸除多余胰蛋白酶/EDTA，于室温下在通风橱中保持细胞浸没于一层薄薄的胰蛋白酶/EDTA 液膜中 约 3 分钟。
- 轻轻振荡培养瓶两次，并用含血清的培养基重悬细胞。计数细胞并稀释至5,000 细胞/50 µl 培养基，立即使用自动化液体处理机器人将50 μl/孔接种至384孔玻璃底板（此处仅使用板中的30个孔）。
- 室温孵育 30 分钟 以减少孔板边缘效应5孵育结束后，将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下2 过夜孵育。
- 每种药物将进行复孔检测。向已含有培养基的对应孔中加入25 µl药物。
- 在 PBS 中用 4% 多聚甲醛溶液固定平板，持续 24 小时 药物处理后
- 染色
此处使用的特异性一抗、荧光标记的二抗及其他荧光染料详见材料....
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结果
在此，我们测试了该工作流程根据药物作用机制对药物进行分类的能力。将 HeLa 细胞接种于 384 孔板的 30 个孔中，并对 DNA/肌动蛋白/α-微管蛋白进行染色。所用的特异性一抗、荧光标记的二抗及其他荧光染料详见材料表。各孔分别用属于三类不同作用机制（组蛋白去乙酰化酶抑制剂、微管靶向药物和 DNA 损伤剂）的 15 种药物处理 24 小时，并使用 20 倍物镜的落射荧光显微镜进行成像。每个孔采集 16 幅图像，共获得 480 幅图像（3 个通道）。本文所描述的数据可从 www.phenoripper.org 下载。
如上所述，使用 PhenoRipper 分析这些图像。前景阈值设置为 5%（即 最大可能强度的 5%），块大小设置为 20 像素（图 2）。在标准台式计算机（3.2 GHz、64 位、8 核、16 GB 内存）上分析该数据集大约需要 10 分钟。使用 PhenoBrowser 界面（图 3）浏览分析结果。成像伪影（如染色不良和空白帧）很容易识别，因为它们表现为明显的离群值（
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讨论
本文所述的工作流程可快速、简便地对显微图像进行表征和比较。我们首先展示了该工作流程如何帮助优化实验，例如通过快速对显微图像执行质量控制。接着，我们展示了其在分析高通量筛选数据方面的潜力：能够根据药物的作用机制对其进行分组。尽管PhenoRipper的速度比更复杂的方法快几个数量级，但其药物分组结果与使用复杂方法所获得的结果相当6。
尽管我们发现该方法对偶然的实验波动具有较强的抗干扰能力，但与任何基于图像的分析方法一样，检测结果会受到系统性非生物学因素的影响。例如，不同培养板间标记物强度的差异可能会掩盖感兴趣的生物学效应。通过适当的校正方法，可降低此类技术假象的影响。7,8 例如孔间标准化和背景扣除。PhenoRipper 生成的分析结果也可能受到细胞密度变化的影响。尽管这种特性通常是可取的（反映细胞存活或生长情况），但通过取消选中相关选项可降低其影响 "使用背景信息" 选项中的 "高级参数".
在选择合适的分.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Adam Coster 以及 Altschuler 实验室和 Wu 实验室的所有其他成员提供的有益反馈和讨论。本研究得到了美国国立卫生研究院基金 R01 GM085442 和 CA133253（S.J.A.）、R01 GM081549（L.F.W.）、CPRIT RP10900（L.F.W.）以及 Welch 基金会 I-1619（S.J.A.）和 I-1644（L.F.W.）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM，高葡萄糖 | Invitrogen | 11965 | 高葡萄糖，L-谷氨酰胺 |
| 标记物 Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA染色剂，将5 mg/ml储存液按1:2,000稀释 |
| 标记物鬼笔环肽-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | 偶联鬼苷素，按1:200稀释 |
| 一抗 α-微管蛋白 | Sigma | T9026 | 一抗，小鼠单克隆抗体，按1:200稀释 |
| 二抗 TRITC标记抗小鼠抗体 | Jackson | 115-025-166 | 偶联二抗，0.5 mg溶于1 ml PBS加1 ml甘油 |
| 醛固酮 | 使用浓度：0.2 μM | ||
| 阿普西丁 | 使用浓度：20 μM | ||
| 秋水仙碱 | 使用浓度：0.16 μM | ||
| 皮质醇 | 使用浓度：0.2 μM | ||
| 地塞米松 | 使用浓度：0.2 μM | ||
| 多西他赛 | 使用浓度：0.2 μM | ||
| M344 | 使用浓度：20 μM | ||
| MS-275 | 使用浓度：5 μM | ||
| 诺考达唑 | 使用浓度：0.3 μM | ||
| 泼尼松龙 | 使用浓度：0.2 μM | ||
| RU486 | 使用浓度：0.2 μM | ||
| Scriptaid | 使用浓度：70 μM | ||
| 紫杉醇 | 使用浓度：0.3 μM | ||
| 曲古抑菌素 A | 使用浓度：0.2 μM | ||
| 长春瑞滨 | 使用浓度：0.3 μM |
参考文献
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., ....
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