脑微切片的兴奋性毒性刺激作为一种方法 体外 卒中模型

摘要

我们建立了一种脑切片模型，可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤所涉及的分子机制。 该技术可获得具有活性的成熟脑组织，在部分保留神经元回路、细胞间相互作用及突触后区室的同时，减少了实验所需的动物数量。

摘要

研究缺血性中风等神经病理状况所涉及的分子机制时，使用整体动物系统可能会存在困难。因此，通常采用原代或“类神经元”细胞培养系统。虽然 这些系统相对易于操作，是可用于便捷量化多种功能结果（如细胞死亡）的有用模型系统。然而，在培养的未成熟神经元中所研究的结果和通路（如兴奋性毒性介导的细胞死亡通路）并不一定与成熟脑组织或完整组织中观察到的相同。因此，有必要建立能够研究成熟神经组织中细胞机制的模型。我们已开发出一种 体外 一种可用于研究完整神经组织中多种分子通路的技术。本文所述技术采用大鼠皮层组织，但该技术可经调整后用于多种物种（如小鼠、兔、豚鼠和鸡）或脑区（例如海马、纹状体）的组织。 等等。）。此外，可采用多种刺激/处理方法（例如，兴奋性毒性刺激、抑制剂给药， 等等。综上所述，本文所述的脑切片模型可用于研究兴奋性毒性介导的脑损伤中涉及的多种分子机制。

引言

最常见的中风类型是缺血性中风，当脑血管发生阻塞时即出现该病症。血流中断所导致的组织缺血会引起细胞膜广泛去极化、兴奋性神经递质释放以及细胞内钙离子持续升高，进而激活细胞死亡通路¹。这一过程被称为“兴奋性毒性”，是多种病理状态（包括中风）引起神经元死亡的共同通路²。抑制兴奋性毒性及其他神经元死亡级联中的信号通路，是减轻中风后神经元损伤的一种有前景的策略。

确定兴奋性毒性及缺血性脑卒中中所涉及的精确分子机制在使用整体动物系统时可能较为困难。因此，原代胚胎神经元及“类神经元”（例如 神经母细胞瘤和腺癌永生化细胞系等细胞培养系统常被使用。这些模型的主要优势在于易于操作、相对经济，并且可以方便地检测和量化细胞死亡。然而，所采用的培养条件可能会改变信号通路 ^3,4，且与成熟脑组织相比，未成熟神经元和永生化细胞系可表达不同的受体和信号分子 ^5-8此外，培养的神经元仅能用于研究一种细胞类型（或两种，若使用共培养系统），而完整的脑组织具有异质性，包含多种相互作用的细胞类型。器官型脑片培养系统（脑组织的薄片外植体）也可用于此类研究，这些模型能够保留细胞在体内所处的异质性群体环境，从而允许对其进行研究 体内然而，使用该技术时从每只动物获取的组织量有限，且脑片无法像永生化细胞系那样进行长期培养，中长期培养还可能导致脑片中信号通路和受体发生改变。尽管可以利用成熟脑组织制备器官型脑片，但来自未成熟脑组织的脑片更易于培养，因此更为常用。因此，有必要开发能够模拟或代表完整成熟脑组织、易于操作且可用于研究神经元信号通路的模型。

在此，一种 体外 一种涉及完整神经组织的技术，可用于阐明兴奋性毒性或缺血性损伤后细胞死亡相关的分子机制。该技术可减少实验所需的动物数量，具有良好的可重复性，并能产生代谢行为与较大体积的器官型脑片相似的存活组织。此外，神经元环路、细胞间相互作用以及突触后区室部分保持完整。所使用的生理缓冲液有助于细胞膜“重新封闭”，并使细胞恢复原有的膜电阻。 ⁹该脑切片模型能够真实模拟兴奋性毒性介导的脑损伤后所观察到的反应 ¹⁰可用于研究中风相关的分子机制。

方案

所有操作均经纽卡斯尔大学动物护理与伦理委员会批准，并遵循相关指南和法规，包括新南威尔士州动物研究法、新南威尔士州动物研究条例以及《澳大利亚科学用途动物护理与使用实践规范》。

1. 脑组织的解剖

1. 通过断头法处死十二周龄雄性大鼠。大鼠可通过击晕后断头法处死，或先用异氟烷（5%诱导，1.5–2%维持）在70% N₂O和30% O₂混合气体中麻醉后再进行断头。₂ 和 30% O₂，然后断头处死。
2. 尽快将脑组织从颅骨中取出（理想情况下应在2分钟内完成）。
3. 通过徒手解剖去除皮层。解剖过程应尽可能迅速完成，并尽量减少对脑组织的损伤，以保持脑片的完整性。
4. 为了去除任何残留的皮肤、毛发和血液， 等等。将脑组织浸入少量（3–5 ml）37 °C 的 Krebs 缓冲液中（含 118 mM 氯化钠、4.7 mM 氯化钾、1.3 mM 氯化钙、1.2 mM 磷酸二氢钾、1.2 mM 硫酸镁、25 mM 碳酸氢钠、11.7 mM 葡萄糖、0.03 mM 乙二胺四乙酸二钠（EDTA），用 95% 氧气/5% 二氧化碳（碳合气）平衡，pH 7.4）。

2. 微切片的制备

1. 将脑组织置于McIlwain切片机的载物台上，载物台上已放置两张滤纸并用温热的Krebs缓冲液润湿。保持脑组织和滤纸湿润，但不可过于潮湿，以免滤纸表面出现自由流动的液体导致脑组织滑动。
2. 将脑组织切成250 µm厚的冠状切片。由于在离体神经组织中，营养物质、氧气和代谢废物需通过组织周围液体进行交换，而非通过血液供应，因此切片厚度不应超过400 µm，以确保充分的氧合和营养交换。
3. 将McIlwain切片机载物台旋转90°。
4. 将脑组织切成250 µm厚的矢状切片。本文中，这些脑切片（250 µm × 250 µm，长度因组织厚度而异）被称为微切片（microslices）。
5. 将微切片放入一个圆底试管中，加入10–15 ml 37 °C的Krebs缓冲液（所用Krebs缓冲液的体积取决于组织量）。

3. 微切片的平衡

1. 轻轻振荡，直至单个微切片悬浮，然后让其在重力作用下自然沉降。
2. 小心移除上清液（由于含有悬浮的细胞碎片，上清液会呈浑浊状），并向管中加入 10 ml 新鲜的 37 °C Krebs 缓冲液。
3. 重复此洗涤步骤四次，以去除大部分碎片。
4. 随后，在 37 °C 下轻轻振荡或翻转微切片以进行平衡，并在 1 小时内每 15 分钟更换一次 Krebs 缓冲液，共更换四次。
5. 此时，加入 2 ml 新鲜的 37 °C Krebs 缓冲液，使用带有平滑边缘的超宽孔径移液器吸头（可通过从 P1000 吸头末端剪去约 2 mm 制得），将 15–20 个微切片（150 µl 微切片悬液）转移至平底聚苯乙烯 5 ml 管中。将微切片均匀铺展在管底，形成单层，确保每个微切片距离含氧大气不超过几毫米。

4. 兴奋性毒性刺激

1. 将微切片在37 °C孵育，并使用位于微切片悬浮液表面正上方的供气管持续向150 µl微切片悬浮液表面通入碳氧混合气（避免机械扰动）。
2. 用150 µl含5 mM谷氨酸和100 µM甘氨酸的Krebs缓冲液（兴奋性毒性刺激：终浓度为2.5 mM谷氨酸和50 µM甘氨酸）或仅用150 µl Krebs缓冲液（对照未刺激组）处理微切片。此步骤可采用多种刺激方式（包括但不限于AMPA、NMDA+甘氨酸、KCl去极化以及氧糖剥夺）。
3. 在刺激后的不同时间点（0、30、60、90、120 和 300 秒）移除孵育液，并加入 300 µl 冰冷的匀浆缓冲液（30 mM Tris，pH 7.4，1 mM 乙二醇四乙酸，4 mM EDTA，100 µM 钼酸铵，5 mM 焦磷酸钠，25 mM 氟化钠，1 mM 正钒酸钠，1 mM 苯甲基磺酰氟，完全蛋白酶抑制剂混合物）。
4. 在冰上使用玻璃-聚四氟乙烯Dounce匀浆器匀浆微切片（20次；700 rpm）。
5. 将匀浆液在 -80 °C 下保存，并保存各种信号分子、死亡相关分子， 等等。 可通过蛋白质印迹法检测。

结果

采用本方案制备的微切片具有活性，可用于制备微切片的物种包括多种动物（例如大鼠、小鼠和鸡）。已采用三种独立指标评估活性：呼吸速率（图1）、腺苷酸核苷酸比值（图2）以及组织钾含量（图3）。通过这些指标证实，微切片在制备后至少2小时内仍保持活性。

脑微切片可用于在多种刺激后检测各种信号分子例如 KCl 去极化图4AMPA、NMDA、谷氨酸刺激¹⁰），也可用于比较不同脑区之间细胞信号分子的反应情况（图4）。此外，还可以检测各种抑制剂/药物处理对这些分子的影响（如激酶抑制剂¹⁰谷氨酸受体激动剂¹¹，喹唑酸¹²).

讨论

在此，一种 体外 一种用于制备微切片的技术，可用于研究兴奋性毒性及缺血介导的细胞死亡在完整成熟脑组织中的分子机制。该技术可产生具有活性的组织（图1-3），其代谢特征与较大的器官型脑片相似¹⁵此外，该微切片模型与兴奋性毒性介导的脑损伤后观察到的反应高度一致。 体内¹⁰90秒 体外 AMPA、NMDA 或谷氨酸对脑微片进行刺激，可在多种分子中诱导出相同的反应例如 CaMKII、GluN2B 和 GluA1）作为90秒的阻断期 体内¹⁰这进一步验证了本文所述的脑片模型是一种有效的方法，可用于研究缺血和兴奋性毒性介导的细胞死亡所涉及的分子机制。

与任何实验技术一样，该操作流程可以进行多种调整，而这些调整可能会影响也可能不会影响实验结果。根据经验，本文详述的方案代表了获得最高组织产量和微切片活性的最佳条件。该方案可适用于多种物种（已成功制备大鼠、小鼠和鸡的微切片），以及任何脑区（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
断头台			用于动物断头处死
外科手术器械			镊子、剪刀、镊子 等等。用于脑组织的取出与解剖
麦克尔文切片机	McIlwain切片机由多家公司生产或销售，包括Mickle Engineering、Harvard Apparatus、Campden Instruments和Ted Pella。		用于生成 100-400 µ脑切片
圆底塑料管	格雷纳
水浴锅			为了保持组织在37 °C
加湿器/通气装置			用于将微切片置于湿润且充氧的环境中保存
平底聚苯乙烯管	Nunc
杜恩斯匀浆器