在植物无细胞系统中检测蛋白酶体降解

摘要

靶向蛋白质降解是细胞功能调控的重要机制。它发生于 通过 一个保守的泛素-蛋白酶体通路，该通路将多聚泛素链连接至靶蛋白，从而为26S蛋白酶体提供分子“标签”。本文中，我们描述了一种简单且可靠的无细胞体系，用于检测蛋白质的蛋白酶体降解。

摘要

泛素-蛋白酶体途径作为蛋白质降解机制，已成为几乎所有真核生物中调控细胞多种功能的最重要机制之一。特别是在植物中，泛素/26S蛋白酶体系统（UPS）调控蛋白质降解，显著参与免疫反应、发育过程以及程序性细胞死亡等多种生物学过程的调控。此外，越来越多的证据表明，许多植物病原体（如农杆菌 Agrobacterium）会利用宿主的UPS实现高效侵染，凸显了UPS在植物-病原体相互作用中的重要性。

泛素-蛋白酶体系统（UPS）的底物特异性由E3泛素连接酶实现，该酶与E1和E2连接酶协同作用，识别特定的靶蛋白分子，并通过在其上连接泛素分子链来标记这些蛋白，使其被降解。E3连接酶中的一类是SCF（Skp1/Cullin/F-box蛋白）复合物，它通过其F-box蛋白组分特异性识别UPS底物，并将其靶向进行泛素化via。为了研究UPS在特定生物学过程中的潜在作用，设计一种简单且可靠的检测UPS介导蛋白降解的方法至关重要。本文描述了一种利用植物无细胞体系的此类检测方法。该方法可适用于研究调控性蛋白降解在多种细胞过程中的作用，尤其聚焦于F-box蛋白与底物之间的相互作用。

引言

泛素/26S蛋白酶体通路正逐渐被认识到是一种广泛存在的调控多种生物反应的机制，包括转录调控、细胞周期进程、信号转导、受体下调或内吞等其他过程^1-4在此通路中，靶蛋白被泛素分子标记，泛素首先被连接到靶蛋白上 通过 硫酯键与泛素激活酶E1结合，随后转移至泛素结合酶E2的半胱氨酸氨基酸残基上；最终，E2与泛素连接酶E3相互作用，导致底物蛋白的多聚泛素化。多聚泛素化的蛋白最终被26S蛋白酶体识别并降解。在此机制中，E3酶负责识别底物，并作为泛素/26S蛋白酶体系统（UPS）的关键调控组分。E3连接酶可独立发挥作用，如RING结构域连接酶，或作为多亚基SCF（Skp1/Cullin/F-box蛋白）复合物的一部分发挥作用，如F-box结构域连接酶。由SCF介导的蛋白酶体降解通路参与转录调控、细胞周期及信号转导的调节。^5-10 以及其他许多重要的细胞功能。

除了在调控细胞过程中的关键作用外，泛素-蛋白酶体系统（UPS）还在多种植物-病原体互作中占据核心地位。例如，越来越多的证据表明，包括 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）， 依赖宿主泛素-蛋白酶体系统（UPS）以促进感染过程¹¹农杆菌会在其天然宿主植物上引发肿瘤性生长，并且还能够转化多种其他真核生物，从真菌开始^1,2 对人类细胞^12,13在感染过程中，农杆菌会将一段D....

方案

1. 蛋白质表达

1. 表达系统的选择
   选择最适合在特定模式生物/细胞中表达目标蛋白的系统，即载体及载体递送方法。请注意，本实验要求目标蛋白在细胞中表达至易于检测的水平，这通常通过大量细胞的瞬时转化来实现。例如在植物中，最佳方法是使用双元质粒作为表达载体，并以农杆菌作为递送系统。
2. 双元表达载体的构建
   将目标蛋白的编码序列单独或以与表位标签融合的形式克隆至表达载体中。使用适用于所选表达系统的载体，并采用标准分子生物学方法进行基因克隆。对于农杆菌介导的基因递送，应使用双元载体，并通过标准实验流程将其导入农杆菌菌株（如EHA105），以便后续接种植物组织。
3. 植物物种的选择
   选择用于表达目标蛋白的植物物种。需注意，尽管任何可被农杆菌介导遗传转化的植物物种均可使用，但我们首选的植物物种为Nicotiana benthamiana，该物种易于培养，对农杆菌高度敏感，且具有较大的叶片，便于接种操作。
4. 植物培养
   将一株植物在环境可控的条件下（例如生长室中），使用Pro-Mix BX培养基质，种植于20 cm × 20 cm × 20 cm的花盆中，光照周期为长日照（即每日16小时、130–150 µE m⁻² s⁻¹光照、23°C，随后8小时黑暗、20°C），相对....

结果

图1，改编自 Zaltsman 等¹⁷，展示了在无细胞系统中检测蛋白酶体降解的代表性实验。具体而言，我们演示了VBF F-box蛋白介导的植物防御相关蛋白VIP1的不稳定化 通过 SCF^VBF 通路在 N. benthamiana. 在本实验中，瞬时共表达拟南芥VBF和HA标签VIP1（HA-VIP1）蛋白，并通过蛋白质印迹法分析表达叶片提取物中HA-VIP1的蛋白含量。结果表明，当HA-VIP1与VBF共表达时，VIP1蛋白量显著降低；而在无VBF共表达的情况下，VIP1蛋白量则相对稳定图1A）。需要注意的是，在没有VBF的情况下VIP1含量的轻微减少可能是由于内源性烟草VBF活性较低所致。VBF介导VIP1不稳定性的蛋白酶体降解机制是通过MG132抑制该过程而推断得出的图1A). 结果的定量分析 图1A 通过VBF检测显示VIP1几乎完全（≥90±5%）被降解，该过程可被MG132阻断图.......

讨论

该实验依赖于受试蛋白质在植物组织中的表达；因此，潜在的蛋白酶体降解过程显然已在活体组织内发生。然而，我们仅在提取物中检测蛋白质的稳定性变化，并以时间零点的样品作为初始参照点。因此，我们将该方法定义为无细胞实验体系。

成功实施本实验的一个重要方面是正确选择用于表达待测蛋白的表达载体。除非有针对待测蛋白的特异性抗体可用，否则应为该蛋白添加表位标签，以便通过蛋白质印迹法进行检测。标签蛋白应由一个 农杆菌 双元载体。尽管已有多种此类载体可供使用²⁶我们建议使用源自模块化 pSAT 质粒系统的载体²⁴，可实现将表达盒一步插入pPZP-RCS2双元质粒中^24-25pSAT系统的另一个优势在于其能够从同一载体上表达多个基因²⁵，这对于检测多种蛋白酶体底物或研究被测底物相互作用分子的影响特别有用；例如共表达被测底物与 农杆菌 VirD5蛋白与蛋白酶体底物VirF相互作用，从而保护VirF免受蛋白酶体降解²²重要的是，不断扩展的pSAT系列载体中已经包含了.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白质检测试剂盒	Bio-Rad	500-0001
蛋白酶抑制剂混合物	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean 电泳系统	Bio-Rad	165-8000
半干式转膜仪（Semi-dry western blotting SD 电转移系统）	Bio-Rad	170-3940
亲和纯化兔抗Ha抗体	ICL Lab	RHGT-45A-Z
辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG	Thermo Scientific	31460
BioTrace NT 硝酸纤维素转印膜	Pall Corporation	27377-000
Immobilon Western 化学发光HRP底物	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
乳胞素（Lactacystin）	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce 快速Western Blot试剂盒，ECL底物	Pierce	35055