靶向蛋白质降解是细胞功能调控的重要机制。它发生于 通过 一个保守的泛素-蛋白酶体通路，该通路将多聚泛素链连接至靶蛋白，从而为26S蛋白酶体提供分子“标签”。本文中，我们描述了一种简单且可靠的无细胞体系，用于检测蛋白质的蛋白酶体降解。
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摘要
摘要
泛素-蛋白酶体途径作为蛋白质降解机制，已成为几乎所有真核生物中调控细胞多种功能的最重要机制之一。特别是在植物中，泛素/26S蛋白酶体系统（UPS）调控蛋白质降解，显著参与免疫反应、发育过程以及程序性细胞死亡等多种生物学过程的调控。此外，越来越多的证据表明，许多植物病原体（如农杆菌 Agrobacterium）会利用宿主的UPS实现高效侵染，凸显了UPS在植物-病原体相互作用中的重要性。
泛素-蛋白酶体系统（UPS）的底物特异性由E3泛素连接酶实现，该酶与E1和E2连接酶协同作用，识别特定的靶蛋白分子，并通过在其上连接泛素分子链来标记这些蛋白，使其被降解。E3连接酶中的一类是SCF（Skp1/Cullin/F-box蛋白）复合物，它通过其F-box蛋白组分特异性识别UPS底物，并将其靶向进行泛素化via。为了研究UPS在特定生物学过程中的潜在作用，设计一种简单且可靠的检测UPS介导蛋白降解的方法至关重要。本文描述了一种利用植物无细胞体系的此类检测方法。该方法可适用于研究调控性蛋白降解在多种细胞过程中的作用，尤其聚焦于F-box蛋白与底物之间的相互作用。
引言
泛素/26S蛋白酶体通路正逐渐被认识到是一种广泛存在的调控多种生物反应的机制，包括转录调控、细胞周期进程、信号转导、受体下调或内吞等其他过程1-4在此通路中，靶蛋白被泛素分子标记，泛素首先被连接到靶蛋白上 通过 硫酯键与泛素激活酶E1结合，随后转移至泛素结合酶E2的半胱氨酸氨基酸残基上；最终，E2与泛素连接酶E3相互作用，导致底物蛋白的多聚泛素化。多聚泛素化的蛋白最终被26S蛋白酶体识别并降解。在此机制中，E3酶负责识别底物，并作为泛素/26S蛋白酶体系统（UPS）的关键调控组分。E3连接酶可独立发挥作用，如RING结构域连接酶，或作为多亚基SCF（Skp1/Cullin/F-box蛋白）复合物的一部分发挥作用，如F-box结构域连接酶。由SCF介导的蛋白酶体降解通路参与转录调控、细胞周期及信号转导的调节。5-10 以及其他许多重要的细胞功能。
除了在调控细胞过程中的关键作用外，泛素-蛋白酶体系统（UPS）还在多种植物-病原体互作中占据核心地位。例如，越来越多的证据表明，包括 农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）， 依赖宿主泛素-蛋白酶体系统（UPS）以促进感染过程11农杆菌会在其天然宿主植物上引发肿瘤性生长，并且还能够转化多种其他真核生物，从真菌开始1,2 对人类细胞12,13在感染过程中，农杆菌会将一段DNA（T-DNA）以及多种毒力（Vir）蛋白导入宿主细胞内12-13其中一个蛋白是VirF，这是首个被发现由原核生物基因组编码的F-box蛋白。14作为SCF泛素连接酶复合物的一部分，VirF及其功能上的人类宿主同源蛋白VBF15，促进农杆菌感染 通过 由UPS介导的蛋白质降解，该过程可能有助于将入侵细菌的T-DNA从其伴随的细菌蛋白VirE2和宿主蛋白VIP1中解离16,17有趣的是，许多F-box蛋白（包括VirF）由于自身的蛋白水解作用而本质上不稳定，这种蛋白水解由自泛素化活性介导。18,19 或其他可能以F-box蛋白为底物的E3连接酶20-23.
在研究F-box蛋白、其他泛素连接酶和/或其底物的生化活性时，采用一种简单且可靠的蛋白酶体降解检测方法将非常有用。本文描述了一种在无细胞体系中分析蛋白质稳定性的实验方案。该方法通过在无细胞系统中，检测泛素-蛋白酶体系统（UPS）底物在关键组分（如F-box蛋白）存在或缺失条件下的稳定性，来评估其降解情况。通常，我们在植物组织中表达待测蛋白，制备这些组织的无细胞提取物，并通过蛋白质印迹法（western blotting）监测目标蛋白的含量变化。通过添加特异性蛋白酶体抑制剂和/或共表达SCF复合物组分Cullin的显性负性突变体，可验证蛋白降解过程对UPS的依赖性。尽管本实验以拟南芥VIP117蛋白被F-box蛋白VBF15介导的蛋白酶体降解为例进行说明，但该方法同样适用于研究其他任何蛋白酶体底物的稳定性。
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方案
1. 蛋白质表达
- 表达系统的选择
选择最适合在特定模式生物/细胞中表达目标蛋白的系统，即载体及载体递送方法。请注意，本实验要求目标蛋白在细胞中表达至易于检测的水平，这通常通过大量细胞的瞬时转化来实现。例如在植物中，最佳方法是使用双元质粒作为表达载体，并以农杆菌作为递送系统。 - 双元表达载体的构建
将目标蛋白的编码序列单独或以与表位标签融合的形式克隆至表达载体中。使用适用于所选表达系统的载体，并采用标准分子生物学方法进行基因克隆。对于农杆菌介导的基因递送，应使用双元载体，并通过标准实验流程将其导入农杆菌菌株（如EHA105），以便后续接种植物组织。 - 植物物种的选择
选择用于表达目标蛋白的植物物种。需注意，尽管任何可被农杆菌介导遗传转化的植物物种均可使用，但我们首选的植物物种为Nicotiana benthamiana，该物种易于培养，对农杆菌高度敏感，且具有较大的叶片，便于接种操作。 - 植物培养
将一株植物在环境可控的条件下（例如生长室中），使用Pro-Mix BX培养基质，种植于20 cm × 20 cm × 20 cm的花盆中，光照周期为长日照（即每日16小时、130–150 µE m⁻² s⁻¹光照、23°C，随后8小时黑暗、20°C），相对湿度保持在40–65%。
1.5.2 根据产品说明书，偶尔施用市售肥料。待植物生长后，选取叶片大小为50 mm × 70 mm或更大（长度测量不包括叶柄）的叶片用于农杆菌接种。 - 农杆菌接种
将携带表达目标蛋白双元构建体的农杆菌菌株（见步骤1.3）在YEP培养基（1%蛋白胨、1%酵母提取物、0.5% NaCl）中，于28°C过夜培养，并添加适当的抗生素（例如，对于基于pPZP-RSC2的载体，添加100 mg/L链霉素和10 mg/L利福平）24-25。
1.6.2 离心收集菌体，重悬于侵染缓冲液 [10 mM MgCl2、10 mM Mes（pH 5.6）、100 µM乙酰丁香酮] 中，使OD600 = 0.5，室温孵育2小时。使用1 mL无针注射器将菌液注入叶片的远轴面；注意叶片接种时仍附着于植株上。
1.6.3 侵染后，将植株在16小时130–150 µE m⁻² s⁻¹光照、23°C / 8小时黑暗、20°C的光照条件下继续培养72小时，随后进行收获。 - 蛋白酶体抑制剂的应用
为验证目标蛋白通过蛋白酶体途径降解，可使用特异性蛋白酶体抑制剂MG132和乳胞素28-29，以减少甚至阻断其降解。在收获前4小时（见步骤2.1），向已接种农杆菌的叶片区域分别注入10 μM MG132（EMD Millipore）或10 μM乳胞素（Sigma-Aldrich），或以相应溶剂作对照处理，即0.1% DMSO或蒸馏水。
2. 无细胞提取物的制备
- 叶片采集
采集叶片的接种区域，通常为约 200–400 mg 的鲜重，置于液氮中研磨成细粉。或者，可直接在降解缓冲液中使用珠磨法处理组织（例如，使用Biospec珠磨器或TPC Advanced Technologies牙科银汞合金振荡器）（见步骤2.2）。 - 蛋白质提取
将研磨后的组织加入500 μL降解缓冲液[50 mM Tris-HCl (pH 7.5)、100 mM NaCl、10 mM MgCl2、5 mM DTT、5 mM 腺苷5′-三磷酸和1×蛋白酶抑制剂混合物（Sigma-Aldrich）]中，制备总蛋白提取物。需注意，蛋白酶抑制剂混合物主要作用于丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶，不会干扰26S蛋白酶体。通过两次连续离心（12,000 × g，每次5分钟）澄清提取物。 - 蛋白质降解反应
取等体积的提取物（通常为20 μL）转移至微量离心管中，在室温下孵育不同时间。通常取0分钟，以及5、10、15、20和30分钟的时间点。通过在SDS凝胶加样缓冲液中煮沸终止反应，并通过蛋白质印迹法进行分析。
3. 通过免疫印迹检测蛋白质降解
- 凝胶电泳
3.1.1 按照标准方案30，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质样品，并将分离后的蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上。
3.1.2 使用Bradford法（Bio-Rad）测定蛋白质浓度，每道上样50–80 µg总蛋白。确保所有样品上样量相等。对于上样对照，可通过检测一种普遍存在的蛋白质（如迁移位置约为50 kDa的RuBisCo大亚基）的信号强度进行比较；该蛋白可在考马斯亮蓝染色的凝胶或经Ponceau S或荧光染料SYPRO Ruby染色的硝酸纤维素膜上观察到。 - 封闭
用含5%脱脂奶粉的TBST（10 mM Tris-HCl，140 mM NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.4）在室温下封闭膜1小时。 - 一抗孵育
将针对表位的一抗用含1%脱脂奶粉的TBST按制造商推荐浓度稀释，在室温下与封闭后的膜孵育1小时，或在4ºC轻柔振荡孵育过夜。 - 洗涤
用20 ml TBST在室温下轻轻振荡洗涤膜一次15分钟，再洗涤两次，每次5分钟。 - 二抗孵育
按制造商推荐方法，将辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（例如抗兔IgG）用含1%脱脂奶粉的TBST稀释，在室温下与膜轻柔振荡孵育1小时。 - 检测
再次按照步骤3.4所述方法洗涤膜。最后一次TBST洗涤后，使用HRP化学发光底物显色，最常用的是ECL试剂盒进行目标蛋白的检测。
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结果
图1，改编自 Zaltsman 等17，展示了在无细胞系统中检测蛋白酶体降解的代表性实验。具体而言，我们演示了VBF F-box蛋白介导的植物防御相关蛋白VIP1的不稳定化 通过 SCFVBF 通路在 N. benthamiana. 在本实验中，瞬时共表达拟南芥VBF和HA标签VIP1（HA-VIP1）蛋白，并通过蛋白质印迹法分析表达叶片提取物中HA-VIP1的蛋白含量。结果表明，当HA-VIP1与VBF共表达时，VIP1蛋白量显著降低；而在无VBF共表达的情况下，VIP1蛋白量则相对稳定图1A）。需要注意的是，在没有VBF的情况下VIP1含量的轻微减少可能是由于内源性烟草VBF活性较低所致。VBF介导VIP1不稳定性的蛋白酶体降解机制是通过MG132抑制该过程而推断得出的图1A). 结果的定量分析 图1A 通过VBF检测显示VIP1几乎完全（≥90±5%）被降解，该过程可被MG132阻断图...
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讨论
该实验依赖于受试蛋白质在植物组织中的表达；因此，潜在的蛋白酶体降解过程显然已在活体组织内发生。然而，我们仅在提取物中检测蛋白质的稳定性变化，并以时间零点的样品作为初始参照点。因此，我们将该方法定义为无细胞实验体系。
成功实施本实验的一个重要方面是正确选择用于表达待测蛋白的表达载体。除非有针对待测蛋白的特异性抗体可用，否则应为该蛋白添加表位标签，以便通过蛋白质印迹法进行检测。标签蛋白应由一个 农杆菌 双元载体。尽管已有多种此类载体可供使用26我们建议使用源自模块化 pSAT 质粒系统的载体24，可实现将表达盒一步插入pPZP-RCS2双元质粒中24-25pSAT系统的另一个优势在于其能够从同一载体上表达多个基因25，这对于检测多种蛋白酶体底物或研究被测底物相互作用分子的影响特别有用；例如共表达被测底物与 农杆菌 VirD5蛋白与蛋白酶体底物VirF相互作用，从而保护VirF免受蛋白酶体降解22重要的是，不断扩展的pSAT系列载体中已经包含了...
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致谢
此项工作获得玛丽·居里COFUND项目“U-Mobility”的资助，该项目由马拉加大学和欧盟共同资助th 第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号246550。本实验室的工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）、美国农业部/国家食品与农业研究所（USDA/NIFA）、美国国家科学基金会（NSF）、美以双边农业研究与发展基金（BARD）和美国-以色列双边科学基金会（BSF）向V.C.提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质检测试剂盒 | Bio-Rad | 500-0001 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | S8820 | |
| Mini-Protean 电泳系统 | Bio-Rad | 165-8000 | |
| 半干式转膜仪（Semi-dry western blotting SD 电转移系统） | Bio-Rad | 170-3940 | |
| 亲和纯化兔抗Ha抗体 | ICL Lab | RHGT-45A-Z | |
| 辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG | Thermo Scientific | 31460 | |
| BioTrace NT 硝酸纤维素转印膜 | Pall Corporation | 27377-000 | |
| Immobilon Western 化学发光HRP底物 | EMD Millipore | WBKL S0 050 | |
| MG132 | EMD Millipore | 474790-1MG | |
| 乳胞素（Lactacystin） | Sigma-Aldrich | L6785 | |
| Thermo Scientific Pierce 快速Western Blot试剂盒，ECL底物 | Pierce | 35055 |
参考文献
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