利用三维喷墨打印技术制备人类软骨组织

摘要

本文所述方法展示了如何将商用喷墨打印机改装为具有同步紫外光聚合功能的生物打印机。该打印机能够利用细胞和生物材料构建三维组织结构。本研究成功构建了三维新生软骨。

摘要

基于热喷墨打印技术的生物打印是组织工程与再生医学领域最具吸引力的关键技术之一。通过数字控制 ，细胞、支架材料和生长因子可被快速、精确地沉积至目标二维（2D）和三维（3D）位置。因此，该技术是构建模拟天然解剖结构组织的理想方法。为了构建具有天然分区结构、细胞外基质成分（ECM）及力学性能的软骨，我们开发了一种基于商用喷墨打印机并结合同步光聚合技术的生物打印平台，用于3D软骨组织工程。将悬浮于聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）中的人软骨细胞通过逐层组装方式打印，构建3D新生软骨。在同步光聚合过程中，打印的细胞由周围支架固定于其初始沉积位置。所打印组织的力学性能与天然软骨相似。与传统组织构建方法相比，后者需要更长的紫外光照射时间，而采用同步光聚合的打印细胞存活率显著提高。打印所得新生软骨表现出优异的糖胺聚糖（GAG）和II型胶原蛋白生成能力，且与相关基因表达水平一致。因此，该平台非常适用于实现解剖学组织工程中细胞的精确分布与排列。

引言

基于热喷墨打印技术的生物打印是组织工程与再生医学领域中最具前景的关键技术之一。通过数字控制和高通量打印头 ，细胞、支架材料和生长因子能够被快速、精确地沉积到目标二维（2D）和三维（3D）位置。该技术已在组织工程与再生医学领域取得多项成功应用^1-9。本文建立了一种生物打印平台，采用改装的惠普（HP）Deskjet 500热喷墨打印机，并结合同步光聚合系统。由聚乙二醇（PEG）配制的合成水凝胶已显示出维持软骨细胞活性并促进软骨形成细胞外基质（ECM）生成的能力^10,11。此外，可光交联的PEG在水中溶解度高、黏度低，非常适合在3D生物打印过程中实现同步聚合。在本研究中，将悬浮于聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA；分子量3,400）中的人软骨细胞以1,400 dpi的3D分辨率精确打印，逐层构建新生软骨组织。观察到细胞在3D支架中分布均匀，所形成的软骨组织具有优异的力学性能和增强的ECM分泌。相比之下，在手工制备过程中，由于支架聚合速度较慢，细胞会沉降至凝胶底部，而非保持在初始沉积位置，导致培养后形成不均匀的软骨组织^2,3。

方案

1. 生物打印平台的建立

打印机的改装基于惠普 Deskjet 500 热喷墨打印机和惠普 51626a 黑色墨盒。

1. 取下打印机顶部的塑料盖，并小心地将控制面板从盖子上拆下。
2. 断开打印机上部与底座之间的 3 个电缆连接。将打印机上部从底座上移除。
3. 在打印机上部，取下墨盒下方右侧的小型塑料和橡胶配件（打印头清洁系统）。
4. 拆下带弹簧的纸盒底座。
5. 取下覆盖在塑料进纸杆上的金属板。
6. 使用手锯或其他切割工具，在中间进纸轮位置切断塑料进纸杆。
7. 移除上一步骤中暴露出来的 2 个进纸轮。该轮塑料材质非常坚硬，建议使用电锯辅助。
8. 使用压缩空气罐和乙醇擦拭纸清除灰尘和碎屑。
9. 将打印机上部重新安装到底座上。
10. 在使用前，将改装后的打印机置于超净工作台中，用紫外线灭菌至少 2 小时。
11. 使用手锯或其他切割工具切下 HP 51626a 墨盒的帽盖。
12. 倒空墨水，并移除覆盖在墨盒底部储液腔上的滤膜。
13. 用流动的自来水彻底冲洗墨盒。
14. 将墨盒置于去离子水（DI 水）中进行超声处理 10 分钟，以去除残留墨水。
15. 检查墨盒，确保所有墨水已被清除。用 70% 乙醇彻底冲洗或喷洒墨盒以进行灭菌，随后用无菌去离子水冲洗。
16. 在打印平台上方安装长波长紫外灯，以提供同步光聚合能力。
17. 使用紫外光强度计测量打印平台处的紫外光强度。调节紫外灯与打印机平台之间的距离，使打印区域的光强保持在 4–8 mW/cm² 之间（灯与打印平台距离约为 25 cm）。

2. 生物墨水制备

1. 单层软骨细胞扩增
   1. 将500万个原代人软骨细胞接种至每个T175组织培养瓶中，使用添加了10%小牛血清和1×青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）进行细胞扩增。在37 °C、含5% CO₂的湿润空气中培养细胞，每3天更换一次培养基，直至培养瓶中细胞融合度达到85%。使用相同代次的细胞。
2. 将PEGDA溶于PBS中，配制成终浓度为10%（w/v）的溶液。加入光引发剂I-2959，使其终浓度为0.05%（w/v）。对溶液进行过滤除菌。
3. 将体外培养的人软骨细胞以5 × 10⁶ 个细胞/毫升的密度重悬于已配制的PEGDA溶液中。

3. 软骨组织打印

1. 打开打印机和笔记本电脑。
2. 使用 Microsoft Word 或 Adobe Photoshop 创建一个直径为 4 mm 的实心圆打印图案。
   1. 调整图案的位置，确保其能够精确打印到塑料模具中。
   2. 计算达到所需支架厚度所需的打印次数。对于 4 mm 高的支架，需要打印 220 次以获得理想的支架。
3. 将生物墨水装入墨盒中。用铝箔覆盖墨盒，以防止打印过程中受到直接的紫外线照射。
4. 向打印机发送打印指令。当打印机开始打印时，拉动纸张传感器。对于直径和高度均为 4 mm 的支架，整个打印过程应少于 4 分钟。
5. 将打印好的类软骨组织转移至 24 孔板中，每孔加入 1.5 ml 培养基。

4. 三维支架中细胞活力的评估

1. 将打印的类新生软骨在室温下避光孵育于 LIVE/DEAD 活/死细胞染色工作液中 15 分钟。
2. 将负载细胞的水凝胶切开成两半，并对切面区域进行荧光成像。
3. 由一位盲法观察者在五个随机选取的视野中计数活细胞（绿色）和死细胞（红色）。通过将活细胞数量除以活细胞与死细胞总数，计算细胞存活率。

结果

经改造的热喷墨打印机能够以高通量和优异的细胞活性实现细胞和支架材料的沉积。结合同步光聚合技术与光敏生物材料，该技术可将细胞及其他打印物质固定在初始沉积位置。根据经改造的热喷墨打印机的特性，其二维打印分辨率为300 dpi，单个墨滴体积为130 pl。每个打印头包含50个喷射喷嘴，喷射频率为3.6 kHz^12,13。因此，对于一个直径和高度均为4 mm的代表性结构，在逐层构建过程中，每层打印层的体积和厚度分别为0.23 μl和18 µm。整个打印过程耗时不到4分钟即可构建出软骨组织（图 1）。

图2A显示了由于在细胞沉积过程中同时进行周围支架的光聚合，3D支架中打印的软骨细胞呈现出均匀的分布。相比之下，若不进行同步光聚合（即细胞接种后再聚合支架），沉积的细胞会因重力作用沉降至支架底部或区域界面，而非停留在初始沉积位置（图2B）。这种细胞聚集现象在此前关于人工构建软骨组织的研究中已有报道^14,15。在3D PEG水凝胶中打印的人软骨细胞恢复了...

讨论

该具备同步光聚合能力的3D生物打印系统，其打印分辨率显著高于此前报道的最佳方法 原位 使用注射器挤出无细胞海藻酸盐水凝胶打印骨软骨缺损¹⁶更高的打印分辨率对于软骨组织工程尤为关键，有助于恢复解剖学上软骨的分区结构。在逐层组装过程中同步进行光聚合，对于精确沉积细胞和生物材料支架以构建三维结构至关重要。每一层打印的微细加工还实现了各分区层之间的平滑过渡，最大限度地减少了因分层导致的降解风险。通过精确调控生物打印参数及生物墨水组分，我们将能够制造出修复多种不同类型软骨缺损所需的复杂三维结构。

在协同生长因子刺激下，生物打印的新生软骨表现出最佳的软骨形成表型和最高的细胞增殖水平³。因此，本研究中所采用的细胞接种密度虽适用于生物打印，但在配合适当生长因子处理时，也最有利于软骨再生。由于活检所获取的软骨细胞数量有限，临床上自体软骨细胞用于软骨修复的应用受到极大限制。将直接获取的自体软骨细胞或间充质干细胞（MSCs）与生物材料结合，无需单层扩增即用于软骨修复，具有极大的吸引力。因此，在细胞数量有限的情况下，将打印后的细胞扩增至软骨形成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
HP Deskjet 500 热喷墨打印机	Hewlett-Packard	C2106a	已停产，从互联网供应商处购买翻新产品。
HP 黑色墨盒	Hewlett-Packard	51626a
紫外线灯	UVP	B-100AP
紫外光强度计	General Tools	UV513AB
蔡司 LSM 510 激光扫描显微镜	Carl Zeiss	LSM 510
Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）	Mediatech	10-013
青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液（PSG）	Invitrogen	10378-016
Accutase 细胞解离试剂	Invitrogen	A11105-01
磷酸盐缓冲液（PBS）	Invitrogen	10010-023
活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒	Invitrogen	L-3224
聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）	Glycosan Biosystems	GS700
Irgacure 2959	Ciba Specialty Chemicals	I-2959
人关节软骨细胞	Lonza	CC-2550