利用Caspase多重检测法确定下丘脑细胞模型中的凋亡

摘要

多重检测可为细胞基本机制提供有益信息 并减少试剂浪费和不必要的重复实验。本文介绍一种多重caspase-3/7活性检测方法，采用基于荧光和发光的技术，用于测定细胞活力 体外 棕榈酸氧化应激后的下丘脑模型。

摘要

多重检测技术在复杂细胞机制研究中的应用能够避免重复实验，提供内部对照，并减少成本与试剂的浪费。本文介绍了一种多重检测方法的优化过程，用于评估棕榈酸（PA）刺激后细胞的凋亡情况。 体外 下丘脑模型，采用基于荧光和发光的检测方法，在96孔微孔板体系中测量活细胞数量和caspase-3/7活性。经棕榈酸（PA）处理后，通过基于刃天青的荧光法测定活细胞数量。随后使用发光底物DEVD检测caspase-3/7活性，并根据细胞数量进行归一化处理。该多重检测方法可用于评估在凋亡刺激（如饱和脂肪酸处理）后caspase活性的变化。饱和脂肪酸PA可增加下丘脑的氧化应激和细胞凋亡，提示此类检测方法在研究饱和脂肪酸与神经元功能关系中的潜在重要性。

引言

富含饱和脂肪酸（如棕榈酸，PA）的饮食与肥胖及其他共病（包括心血管疾病和糖尿病）相关联^1,2高脂饮食还被证明会增加下丘脑的氧化应激、细胞凋亡和神经元变性，而下丘脑是食欲和能量消耗的重要调节中枢^3-7因此，了解高脂饮食暴露诱导下丘脑功能紊乱的机制，对于开发治疗肥胖的药物疗法具有重要意义。然而，饮食脂肪影响神经元功能的细胞机制仍不明确。深入理解棕榈酸（PA）等脂肪如何触发下丘脑凋亡通路的启动，是实现这一目标的必要第一步。本文旨在介绍一种多重检测方法，用于 体外 用于下丘脑神经退行性变研究的神经元对PA暴露反应的检测方法。我们提供了一种详细的描述 体外 96孔多重检测法用于测定经棕榈酸氧化应激处理后分化永生化成年小鼠下丘脑细胞系（A12）中caspase 3/7活性与总细胞数的比值⁸.

简而言之，细胞活力通过基于刃天青（resazurin）的检测方法在PA刺激后进行测定。刃天青是一种可渗透细胞的化合物，可在代谢活跃的细胞内发生酶促还原反应，该过程被认为主要通过线粒体完成⁹。活细胞持续将刃天青转化为试卤灵（resorufin），产生与活细胞数量成正比的荧光信号。随后使用基于DEVD的发光法检测caspase-3/7活性。DEVD是一种氨基酸序列（Asp-Glu-Val-Asp），可被caspase-3切割。当该序列与发光物质偶联时，细胞内caspase-3/7被激活并切割DEVD底物后，便会释放出发光产物。该反应的发光强度与caspase活性成正比，因而可反映细胞凋亡的诱导程度。由于死亡细胞无法产生caspase，caspase-3/7活性本质上是短暂的；因此，检测应在刺激后30分钟至4小时之间完成，具体时间取决于细胞应激原的有效性。细胞活力与caspase-3/7活性呈负相关，可用于判断细胞死亡机制。例如，此前已有研究利用该方法证明，预先使用神经肽类激素食欲素（orexin）处理，可减少过氧化氢刺激下下丘脑细胞的凋亡，提示该处理所影响的机制在抵御氧化损伤中具有重要作用¹⁰。需要注意的是，这些检测方法依赖于线粒体活性以还原检测试剂，因此其结果具有细胞系和组织特异性。本方案已针对成年小鼠下丘脑（A12）细胞优化，但所述方法可根据类似研究的需求进行调整。

从单个培养孔中进行多重检测，相较于传统的逐一开展单个检测方法具有多项优势。除了节省时间、细胞样本和培养试剂外，多重检测还能提供有关细胞存活与死亡的信息，提供内部对照，并避免重复实验的需要^11,12。

传统方法依赖于Western印迹或ELISA，这些方法虽然是可靠的检测手段，但成本较高且耗时较长（1-2天），尤其是在使用96孔板格式时。除去细胞培养所需时间，多重检测的总耗时不到3小时。尽管本实验方案已针对A12细胞进行了优化，但也可根据其他模型进行调整，同时需考虑可能影响细胞完整性的因素。该方案是否适用于一系列实验，取决于样本数量或实验条件的数量以及计划进行的下游实验。

方案

1. 细胞培养的铺板与维持

1. 将杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）培养液（DMEM + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素/链霉素/新霉素）预热至 37 °C。
2. 从 -80 °C 取出冻存的 A12 细胞储备液。
3. 在 37 °C 水浴中快速解冻细胞；解冻后，轻轻吹打混匀，将细胞转移至一个 75 cm² 透气培养瓶中，并加入 10 ml 培养液。
4. 将培养瓶置于 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养。24 小时后吸除旧培养液，更换新鲜培养液。继续培养细胞，直至细胞融合度达到 70–80%（培养 2–3 天）。

2. 细胞计数与接种

1. 将DMEM和1×胰蛋白酶-EDTA溶液预热至37 °C。
2. 吸除细胞培养基，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次。
3. 加入500 μl胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育2–5分钟。
4. 使用细胞刮刀将细胞从培养瓶上刮下，并将细胞悬液转移至5 ml培养基中。将细胞悬液通过滤网过滤，并收集至一个洁净的50 ml离心管中。可根据需要多次过滤细胞，但重复次数不得超过三次。
5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，以确定接种密度，使每孔最终含有6,000个细胞，接种于96孔透明底、黑色或白色侧壁的培养板中，每孔培养基终体积为100 μl。将培养板置于含5% CO₂的环境中，于37 °C孵育24小时。

3. 确定细胞活力和Caspase-3/7活性

1. 将棕榈酸（PA）转移至无菌的5 ml玻璃小瓶中，用100%二甲基亚砜（DMSO）溶解。用DMSO将PA储备液按1:10稀释，然后加入预热的DMEM培养基中，得到终工作浓度为0.1 mM的PA。对照组培养基中加入与含PA培养基相同浓度的DMSO。
2. 吸除每个孔中的培养基，更换为50 μl含或不含PA的培养基。在37 °C、5% CO₂条件下孵育2小时。然后加入5 μl刃天青（resazurin）试剂，在室温下孵育10分钟。
3. 使用多功能微孔板读板仪记录荧光（激发波长560_EX/发射波长590_EM），以检测细胞活力。结果以相对荧光单位（RFU）表示。
4. 向同一块板中加入55 μl半胱天冬酶（caspase）检测试剂，在室温下孵育2小时。
5. 再次使用微孔板读板仪记录发光值，以检测caspase-3/7活性。结果以相对发光单位（RLU）表示，发光信号强度与caspase-3/7活性成正比。
6. 为将caspase-3/7活性标准化为细胞数量，用细胞活力（RFU）除以caspase-3/7活性（RLU）。

结果

上述方案描述了通过多重检测两种独立实验来确定细胞死亡机制的结果。图1展示了用于测定细胞活力和caspase-3/7活性的方案概览。在用PA处理2小时后，细胞中的caspase活性显著升高（图2A和表1）。细胞膜完整性的丧失是细胞凋亡诱导相关的形态学变化，在PA暴露2小时后的细胞中可明显观察到（图2B）。图3概述了PA诱导细胞凋亡的潜在通路，并说明了优化DEVD试剂孵育时间的重要性。

讨论

多重检测是一种广为接受的技术，已被科学家广泛应用于多种领域，如PCR微阵列、免疫检测及其他基于蛋白质的检测方法^13,14近年来，多重检测技术在 体外 基于培养板的实验，并已被验证为评估细胞毒性和细胞活力的准确方法¹²在上述方案中，我们展示了联合使用荧光和发光检测方法在棕榈酸（PA）刺激后测定A12细胞中caspase-3/7活性和细胞活力的有效性。细胞活力在PA初始损伤后10分钟内测定，从而快速、可靠地反映活细胞数量。需要注意的是，基于刃天青（resazurin）的试剂是一种活细胞检测方法，允许后续进行其他终点检测；然而，优化孵育时间以测定caspase-3/7活性对于获得可用结果至关重要。¹⁵.

细胞凋亡可由外部刺激、细胞内信号以及表面受体激活，从而引发一系列特定的形态学和生化事件。caspase 3 活性升高、DNA 片段化、细胞膜完整性丧失、染色质浓缩以及多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）的切割等，均为可检测的细胞凋亡特异性标志物^16<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
成年小鼠下丘脑细胞系 mHypoA-1/2	Cellutions Biosystems Inc.	CLU172
Dulbecco’s 修饰 Eagle’s 培养基	Invitrogen	10313-039
胎牛血清	PAA Labs	A15-751
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070-063
棕榈酸	Sigma-Aldrich	P0500
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650
PrestoBlue 细胞活力检测试剂	Invitrogen	A13262
Caspase-Glo 3/7 检测试剂盒	Promega	G8091
96 孔光学底板，黑色聚苯乙烯，细胞培养处理，带盖，无菌	Thermo Fisher Scientific	165305
SpectraMax M5 多功能微孔板读板仪	Molecular Devices