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使用无标记光学生物传感器检测G蛋白偶联受体对钾通道的调节作用

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DOI：

10.3791/51307

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2014年2月10日

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1Department of Pharmacology, Yale School of Medicine, 2Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale School of Medicine, 3X-BODY Biosciences

本文内容

摘要

光学生物传感器技术可检测活细胞质膜附近的质量变化，从而能够追踪单个细胞及细胞群体的细胞反应。本方案将介绍利用该方法在完整细胞中检测G蛋白偶联受体对钾离子通道的调控作用。

摘要

离子通道通过选择性允许离子跨质膜流动，调控神经元及其他可兴奋细胞类型的电学特性1。为了调节神经元的兴奋性，信号蛋白和分子会改变离子通道的生物物理特性，这些蛋白和分子通常直接结合到通道上，形成异源多聚体通道复合物2,3。传统检测通道与调节蛋白相互作用的方法依赖外源性标记物，这些标记物可能改变蛋白的行为，降低靶标的生理相关性，且无法提供活细胞中相互作用时间进程的信息。光学生物传感器（例如 X-BODY Biosciences BIND Scanner 系统）采用一种新型的无标记技术——共振波长光栅（RWG）光学生物传感器，用于检测生物传感器附近共振反射光的变化。该检测方法可监测贴壁于生物传感器表面的活细胞底部质量的相对变化，这些变化源于配体诱导的细胞黏附与铺展、毒性、增殖以及细胞质膜附近蛋白-蛋白相互作用的改变。RWG 光学生物传感器已被用于检测 G 蛋白偶联受体（GPCRs）、受体酪氨酸激酶及其他细胞表面受体激活后，细胞质膜附近质量的变化。该方法也可用于研究配体诱导的离子通道-蛋白相互作用的变化。本文中，我们将描述利用该检测方法探测 G 蛋白偶联受体对 Slack-B 钠激活钾（KNa）通道调节作用的实验流程。

引言

在生理相关环境中研究活细胞对于理解细胞靶标的生物学功能至关重要。然而，检测通道蛋白与调控性胞质蛋白之间相互作用的实验方法（如共免疫沉淀实验）通常难以提供有关活细胞内相互作用时间进程的信息。目前大多数基于细胞的检测方法仅测量特定的细胞事件，例如荧光标记的目标蛋白的转位过程。这类实验需要对目标蛋白进行修饰，可能改变蛋白的行为，从而降低其生理相关性。非侵入性的基于细胞的检测方法无需对系统进行干预，可连续测量细胞活性，使研究者能够在最接近生理状态的条件下开展细胞研究4。

光学生物传感器旨在产生一种可测量的光信号变化，该变化与耦合到传感器表面的光特性相关。利用隐逝波的光学生物传感器，包括表面等离子共振（SPR）和共振波长光栅（RWG）技术，主要用于检测分子与其固定在传感器表面的生物受体结合时的亲和力和动力学特性。近年来，已开发出商业化的RWG生物传感器，能够以高空间分辨率（高达3.75 µm/像素）检测贴附于传感器表面的细胞底部区域的质量相对变化5。这些生物传感器可检测活细胞近质膜区域因刺激引起的质量变化，例如细胞黏附与铺展、毒性、增殖 以及由多种细胞表面受体（包括G蛋白偶联受体（GPCRs））激活的信号通路6。RWG生物传感器通过检测生物传感器表面150 nm范围内折射率的相对变化，反映质量的相对变化7。当细胞接种至生物传感器表面时，折射率的变化反映了细胞因与传感器黏附状态改变而引起的近质膜区域质量变化。本实验方案将讨论利用RWG生物传感器检测通道蛋白相互作用的方法。

RWG 数据采集系统由多个组件构成。由于本实验使用了 X-BODY Biosciences 公司的 BIND 扫描仪，因此我们将以该特定系统的组件为例进行说明，该系统包括微孔板读取仪、相关生物传感器、BIND Scan 数据采集软件以及 BIND View 分析软件8。此处所述的光子晶体生物传感器（下文简称为光学生物传感器）由介电材料在二维或三维空间中周期性排列构成，能够阻止特定波长和方向的光传播。光子晶体结构基于一种称为伍德异常（Wood's anomaly）的现象。伍德于 1902 年首次发现此类异常，表现为光学衍射光栅反射光谱中某些窄频带范围内特定衍射级次的光强发生急剧变化。1962 年，Hessel 和 Oliner 提出了关于伍德异常的新理论，指出有限周期光栅可产生一个驻波共振波长9。在本文所述的光学生物传感器中，利用伍德异常实现 RWG 生物传感器，当受到白光激发时，仅反射非常窄的波长范围（通常在 850–855 nm 之间）。

单个生物传感器由一种低折射率的塑料材料制成，其表面具有周期性结构，并涂覆有一层高折射率的介电材料二氧化钛（TiO2）。当使用宽波长光源照射生物传感器时，光子晶体的光学光栅会反射出窄波长范围的光，该反射光由BIND扫描仪中的分光光度计测量。反射光波长的峰值强度（即峰值波长值，PWV）由信号计算得出。当传感器表面附近（约150 nm范围内）的质量增加或减少引起折射率变化时，反射光的PWV会发生偏移。在本实验所用的检测中，光学生物传感器被集成于标准的生物分子科学学会（SBS）384孔微孔板中。

RWV 生物传感器用于检测活细胞中加入外源信号后发生的变化10。细胞直接培养在RWG生物传感器表面，当施加特定刺激时，监测局部折射率的变化。由于生物传感器附近质量增加会导致局部折射率升高，并表现为PWV的增加，因此可以确定生物传感器处质量变化的方向 ；相反，质量减少则导致PWV降低。检测到的PWV变化可能源于多种细胞事件，包括细胞黏附变化、蛋白质募集/释放、内吞与再循环、外排作用、细胞凋亡以及细胞骨架重排。例如，该检测方法可检测钾离子通道与其他细胞质或细胞骨架组分之间的通道蛋白相互作用的变化。然而，此类事件必须发生在生物传感器附近约150 nm的检测区域内，对于贴壁细胞而言，即靠近质膜的区域。细胞反应的采集通过BIND Scan软件完成，并生成SBS板中每个384孔的图像表示。该系统的分辨率达3.75 µm/像素，能够检测单个细胞内的事件，既可用于细胞系（如HEK293或CHO细胞），也可用于生理相关性更强的原代细胞。利用BIND View软件进行图像分析，可检测单个细胞及细胞群体的反应。由于生物传感器集成于标准SBS 384孔微孔板中，该系统易于适用于高通量筛选（HTS）。

共振波长光栅光学生物传感器此前已被用于检测细胞激活G蛋白偶联受体（GPCR）后细胞质膜附近质量的变化11。本实验室已克隆了两种钠激活的（KNa）钾通道，即Slack-B和Slick12。研究表明，Slack-B和Slick通道的活性均受到蛋白激酶C（PKC）直接激活的强烈调控13。Gαq蛋白偶联受体（如M1毒蕈碱受体和代谢型谷氨酸受体mGluR1）的激活可通过PKC通路强有力地调节这些通道的活性。这些KNa通道在持续刺激过程中参与神经元的适应性反应，并调控动作电位的时间精确性14。已知Slack通道可与多种胞质信号分子相互作用，包括脆性X智力低下蛋白（FMRP）15,16。Slack基因的突变可导致婴儿期多灶性部分性癫痫（MMPSI），这是一种早发性癫痫，可引起严重的发育迟缓17。

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方案

1. 细胞培养（改编自 Fleming 和 Kaczmarek18）

  1. 在用于本实验前，将细胞在适当的培养基中培养，传代次数应大于2代但少于10代。未转染的HEK-293细胞及稳定表达大鼠Slack-B蛋白的HEK-293细胞，培养于含10%热灭活胎牛血清和抗生素的DMEM/F12（1:1）混合培养基中。在稳定表达Slack-B的HEK-293细胞培养基中加入500 µg/ml 遗传霉素（G418），以筛选Slack通道的表达。当细胞融合度达到70–90%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化，进行传代。

2. 使用纤连蛋白和卵清蛋白对 TiO2 384 孔光学生物传感器板进行细胞外基质（ECM）包被

  1. 纤连蛋白细胞外基质混合物和卵清蛋白封闭液的制备
    1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制纤连蛋白工作液，终浓度为 5 µg/ml ，总体积为 20.0 ml 。从 1.0 mg/ml 的储备液中取 100 µl 加入 20.0 ml PBS 中，实现 200 倍稀释。纤连蛋白工作液可分装后于 -20 °C 保存。
    2. 在无菌水中配制 5% 的热灭活卵清蛋白储备液。将卵清蛋白溶于无菌细胞培养级水中制成 5% 溶液，并在 60 °C 下加热灭活 30 分钟。冷却至室温后，用无菌滤膜过滤溶液。将 5% 卵清蛋白溶液分装，于 4 °C 保存。
    3. 将 5% 储备液用 PBS 稀释，配制 2% 的卵清蛋白工作液。例如，将 12.0 ml 的 5% 卵清蛋白储备液加入 18.0 ml 的 PBS 中，总体积为 30.0 ml。
  2. 384 孔光学生物传感器板的包被
    1. 用 20.0 µl/孔的无菌细胞培养级水对 TiO2 板进行水化处理，孵育 15 分钟。后续步骤应使用 16 通道移液器操作。
    2. 每孔加入 50.0 µl PBS，洗涤 1 次。
    3. 每孔加入 20.0 µl 纤连蛋白工作液，在室温下孵育 2 小时，以形成细胞外基质（ECM）。
    4. 每孔加入 50.0 µl PBS，洗涤 1 次。
    5. 每孔加入 40.0 µl 卵清蛋白工作液，在 4 °C 下过夜孵育以封闭板面。
    6. 每孔加入 50.0 µl PBS，洗涤 3 次。包被有 ECM 的板可在 4 °C 下保存最多 48 小时。

3. 将细胞接种至384孔光学生物传感器板

  1. 从细胞中移除培养基，加入胰蛋白酶使细胞从培养板上脱落。收集细胞并在 1,000 × g 离心 1 分钟。去除胰蛋白酶培养基，将细胞重悬于新鲜培养基中。
  2. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪测定细胞浓度。
  3. 为尽量减少孵育过程中蒸发的影响，每孔将使用 50.0 µl 培养基。应将细胞稀释至所需浓度，使每孔细胞数量达到目标值，且体积为 50.0 µl 培养基。在本实验中，每孔接种 1,000 个细胞至生物传感器上。
  4. 将接种后的细胞在 37 °C、含 5% CO2 的空气环境中于培养基中孵育过夜。

4. RWG光学生物传感器检测中生物传感器和化合物板的制备

  1. 从培养箱中取出培养板，移除细胞的培养基。用Hanks平衡盐溶液（HBSS）清洗细胞1次。每孔加入25.0 µl HBSS。
  2. 将生物传感器板置于BIND扫描仪上，使细胞在室温下平衡1–2小时。
  3. 另准备一块化合物板，用于在检测过程中向生物传感器板中添加感兴趣的配体。在本检测中，向生物传感器板的每孔加入25.0 µl含化合物的溶液，终体积为50.0 µl。因此，溶液中的化合物浓度应配制为所需终浓度的2倍。

5. 进行RWG光学生物传感器实验

  1. 使用 BIND Scan 软件，通过扫描仪系统对 A1-P12 孔（SBS 384 孔板的一半）进行基线测量，每个孔中心 1.5 mm 区域采用最高分辨率为 3.75 µm/像素。该基线扫描约需 30 分钟。
  2. 向A1-P12孔中的每个孔加入25.0 µl化合物溶液。
  3. 对 A13-P24 孔进行基线测量。
  4. 向 A13 至 P24 列各孔中每孔加入 25.0 µl 化合物溶液。
  5. 取一个帖子 向 A1-P12 孔加入化合物并进行检测，随后对 A13-P24 孔重复相同操作。

6. 使用 BIND View 分析检测数据

  1. 打开 Windows 中基线测量的 BIND 检测数据，然后单击 "网格编辑器" 按钮以启用细胞选择。软件将计算用户定义的感兴趣指标。
  2. 打开 "插件"，包括 "细胞查找器" 和 "Baseliner" 功能。设置参数在 "细胞查找器" 使细胞能够与生物传感器的背景区分开来。
  3. 导出包含细胞图谱信息的文件 "细胞查找器" 基线测量的数据。
  4. 重复步骤 6.1–6.2 以获取后续样本 化合物添加数据
  5. 打开 "Baseliner" 插入并导入基线测量的细胞图。软件将计算背景与处理后之间PWV的偏移量 化合物数据
  6. 选择“Δ细胞均值”" 用于输出细胞PWV中均值偏移的结果。随后可将数据导出至Microsoft Excel进行进一步分析。

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结果

将稳定转染Slack-B的HEK-293细胞和未转染的对照HEK-293细胞以每孔1,000个细胞的密度接种于384孔ECM包被的RWG生物传感器板上。使用BIND Scan软件记录生物传感器中心1.5 mm2区域的图像，分辨率为3.75 µm/像素（图1）。在化合物加入前及加入后30分钟生成质量密度梯度图。采用BIND View软件通过将化合物加入后的PWV减去基线PWV，测定GPCR激动剂加入后PWV的变化。

内源性M1毒蕈碱受体激动剂氯化氨甲酰胆碱（carbachol）19作用于未转染的对照组HEK-293细胞以及稳定表达大鼠Slack-B的HEK-293细胞后，均引起PWV的正向增加（图2A）。在30分钟时间点进行测量，信号以仅添加缓冲液（HBSS）为对照进行归一化。与对照细胞相比，转染Slack-B的细胞在PWV峰值位移上的增加更为显著。SFLLR-NH2三氟乙酸盐（SFLLR）是一种N端TRAP五肽，可作为内源性G蛋白偶联受体——蛋白酶激...

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讨论

Z 值（Z' 因子）是一种常用的统计方法，用于量化高通量筛选实验的质量20。由于本实验中 GPCR 激动剂的筛选是在符合 SBS 标准的 384 孔板中进行的，因此 Z' 因子能够很好地反映该实验的稳健性和有效性21。Z' 值为 1 表示理论上理想的实验，其数据点数量无限且标准差为零。Z' 值在 0.5–1 之间被认为非常适合用于高通量筛选，而低于 0.5 的 Z' 值则表明实验的信息量有限。在本数据集中，以卡巴胆碱（carbachol）和 SFLLR 分别作为阳性对照计算得到的 Z' 值分别为 0.79 和 0.81，表明该实验具有很高的稳健性，所得结果具有高度显著性。

本实验中的384孔光学生物传感器板的细胞外基质包被、细胞接种以及化合物添加均使用16通道Finnpipette移液器（5-50 µl）手动完成。由于该检测在SBS板上进行，因此可在高通量筛选中使用更先进的自动化液体处理系统。然而，在将液体处理仪器系统进行适配时，需格外注意确保移液吸头不接触生物传感器表面，以免造成生物传感器的损坏。

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披露

Steven M. Shamah 是 X-BODY Biosciences 的员工。

致谢

作者感谢耶鲁大学Fred Sigworth博士实验室的杨杨 Yan博士慷慨提供了稳定表达大鼠Slack-B蛋白的HEK293细胞 。此外，作者感谢Sigworth博士在视频引言中提供的Slack蛋白的冷冻电子显微镜同源建模结构。 本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助L.K.K.的项目DH067517和NS073943的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM，高葡萄糖Life Technologies11965-092
Leibovitz L-15 培养基Life Technologies11415-064
青霉素-链霉素（10,000 U/ml）Life Technologies15140-122
遗传霉素 G-418 硫酸盐American BioanalyticalAB05057
HBSSLife Technologies14025-092
人血浆来源的纤维连接蛋白Sigma-AldrichF0895
鸡蛋清来源的白蛋白Sigma-AldrichA5378
DPBSLife Technologies14190-144
Hausser Bright-Line 相差血细胞计数板Fisher Scientific02-671-6
氯化卡巴胆碱Sigma-AldrichC4382
SFLLR-NH2 三氟乙酸盐Sigma-AldrichS8701
Finnpipette（5–50 µl）Thermo Scientific4662090
BIND 扫描系统X-BODY BiosciencesN/A
384 孔二氧化钛（TiO2）包被板X-BODY BiosciencesTiO-96-CM

参考文献

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GPCR Slack B HEK 293

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