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方法文章

内皮细胞管形成实验用于 体外 血管生成研究

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DOI：

10.3791/51312

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2014年9月1日

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1Department of Biology, American University, 2Laboratory of Cancer Biology and Genetics, National Cancer Institute, NIH

本文内容

摘要

管腔形成实验是一种快速、可量化的测量方法，用于评估 体外 血管生成。将内皮细胞与条件培养基混合后接种于基底膜提取物上。数小时内形成管状结构，新形成的管状结构易于定量分析。

摘要

血管生成是正常组织发育和伤口愈合的关键过程，但也与多种病理状态相关。通过本方案，可对血管生成进行测量 体外 以快速且可量化的方式进行。将原代或永生化的内皮细胞与条件培养基混合，接种于基底膜基质上。内皮细胞在条件培养基中的促血管生成信号刺激下，形成类似毛细血管的结构。管腔形成过程迅速，内皮细胞通常在1小时内即开始相互排列对齐 2 小时内开始出现管状结构并形成管腔。可通过相差倒置显微镜观察管状结构，或在检测前用 calcein AM 处理细胞，再通过荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。可对形成的分支位点/节点、环状结构/网状结构的数量，或管状结构的数量或长度进行定量分析，作为评估指标 体外 血管生成。总之，该检测方法可用于快速、可重复且定量地鉴定参与促进或抑制血管生成的基因和信号通路。

引言

血管生成是指从已有的血管中形成新血管的过程，对多种生理过程至关重要，包括器官生长、胚胎发育和伤口愈合1-3。由内皮细胞衬里的新生血管向组织输送氧气和营养物质，促进造血细胞的免疫监视，并清除代谢废物2,4。在胚胎和胎儿发育过程中，血管生成具有关键作用。然而，在成体中该过程通常处于静息状态，仅在伤口愈合、骨骼生长、妊娠或月经周期期间被激活1-3。

在过去的二十年中，调控血管生成的关键分子机制逐渐被揭示。血管生成是一个受到严密调控的过程，由促血管生成和抗血管生成信号共同维持平衡，这些信号包括整合素、趋化因子、血管生成素、氧感应因子、连接分子以及内源性抑制剂5。当碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板源性生长因子（PDGF）和表皮生长因子（EGF）等促血管生成信号激活内皮细胞受体后，内皮细胞会释放蛋白酶以降解基底膜。随后，内皮细胞开始增殖并迁移，以每天数毫米的速度形成新生血管芽6,7。

血管生成与多种病理状态相关，包括癌症、银屑病、糖尿病性视网膜病变、关节炎、哮喘、自身免疫性疾病、感染性疾病以及动脉粥样硬化8-10。鉴于血管生成在多种疾病中的重要性，深入了解调控该过程的基因与信号通路，对于开发更有效的治疗策略至关重要。

管形成实验是一种快速且定量的方法，用于确定参与血管生成的基因或信号通路。该实验最早于1988年被描述，其基本原理在于内皮细胞保留了在血管生成信号刺激下快速分裂和迁移的能力11-13。此外，当内皮细胞在基底膜提取物（BME）基质上培养时，会被诱导分化并形成管状结构。这些管状结构包含由通过连接复合体相互连接的内皮细胞所包围的管腔。管形成过程迅速，大多数管状结构在2-6小时内形成，具体时间取决于血管生成刺激因子的种类和数量。

可用于本实验的内皮细胞有多种类型，包括原代细胞和永生化细胞系14,15。 本文所使用的细胞系为小鼠3B-11细胞，但相同的方法也可应用于其他内皮细胞系，如SVEC4-10（小鼠）或原代内皮细胞，如HUVEC（人）细胞。根据所使用的细胞系以及内皮细胞是否经过转化，可能需要进行优化，以确定形成适当管状结构所需的最佳时间。

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方案

1. 收集条件培养基以检测其促血管生成潜力

  1. 在天然培养基或低血清培养基中培养待测具有促血管生成或抗血管生成潜能的原代细胞或永生化细胞，并收集条件培养基。
    1. 或者，可立即使用条件培养基，也可分装后于 -80 °C 保存数月。使用未条件处理的天然培养基或低血清培养基作为阴性对照，使用未条件处理的完全生长培养基（含 10% FBS 或适当浓度）作为阳性对照。或者，为检测潜在的血管生成刺激因子，可在去除生长因子的炭吸附培养基中添加已知浓度的特定目标蛋白，并与仅含生长因子缺失培养基的对照组进行比较。

2. 检测前内皮细胞的准备

  1. 在实验前两天，将3B-11细胞传代至新的T-75培养瓶中。细胞的传代次数至关重要。该实验最适合使用处于第二至第六代之间的细胞。若内皮细胞在第二代之前或第十代之后使用，则实验效果不佳。
  2. 将细胞在DMEM培养基中培养24小时，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素。
  3. 在实验前一天，对3B-11细胞进行血清饥饿处理，步骤如下：
    1. 吸除3B-11细胞中的培养基。
    2. 加入低血清培养基，即含0.2% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM培养基。
    3. 继续培养细胞24小时。

3. 检测前试剂的准备

注意：BME 的浓度因批次不同而有很大差异。如果 BME 浓度低于 10 mg/ml，则效果不佳，因此在购买前应联系 BME 生产商，以确保获得浓度足够的批次。

  1. 将低生长因子BME在冰箱中解冻。BME在温度升高时会凝固，因此使用前必须保持低温。BME可在冷藏条件下保存数周，或分装后于-80 °C冷冻保存。
  2. 相比传统BME，优先选用低生长因子BME。由于该BME中不含促血管生成因子，因此更易于观察条件培养基中的因子对成管形成的影响。
  3. 将待测培养基解冻。

4. 检测前内皮细胞的即时制备

  1. 用DPBS洗涤3B-11细胞。
    1. 若需进行荧光或共聚焦显微镜观察，在洗涤3B-11细胞前，将钙黄绿素AM（calcein AM）加入内皮细胞培养基中，终浓度为2 µg/ml。将标记钙黄绿素的细胞置于37 °C、5% CO2条件下避光孵育，直至开始实验。将钙黄绿素AM储备液溶于DMSO中，稀释至培养基后，DMSO的终浓度不得超过0.1%。孵育30–45分钟后，按上述步骤4.1洗去钙黄绿素AM，随后继续实验操作。
  2. 向T-75培养瓶中加入1 ml胰蛋白酶-EDTA溶液进行消化。
  3. 胰蛋白酶消化完成后，用DMEM培养基（含10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）将细胞重悬至终体积10 ml，以中和胰蛋白酶。
  4. 通过100 μm细胞滤网过滤细胞，去除细胞团块。
  5. 计数细胞，并用DMEM培养基（含10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素）将细胞重悬至终浓度为7.5 × 106 个细胞/ml。

5. 管腔形成实验

  1. 在加样前20-30分钟，将24孔板和1 ml吸头置于冰箱或冰上预冷，以防止基底膜提取物（BME）过早凝固。
  2. 用移液器将250 µl低生长因子BME加入24孔板的每个孔中。加样时避免将移液器按压至最后一档，以防产生气泡。当液面形成弯月面时，注意确保孔中心区域留有足够量的BME；若基质过薄，细胞将仅形成单层结构。
  3. 将24孔板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育30分钟，使BME完全凝固。
  4. 待BME凝固后，将约300 µl条件培养基与10 µl重悬的3B-11细胞（约75,000个细胞）混合。
    1. 根据所使用的内皮细胞类型调整条件培养基体积和接种细胞数量，并通过测试条件培养基的系列稀释浓度来验证其活性。若比较在不同条件下培养的细胞，应将条件培养基体积归一化至用于制备该培养基的细胞数量。
  5. 管状结构通常在2-4小时内开始形成。根据条件培养基中促血管生成因子的浓度不同，管状结构形成的高峰可能出现在3至12小时之间，因此实验时间需进行优化。若使用原代内皮细胞而非永生化细胞，初始管状结构的形成可能延迟数小时。
    1. 管状结构常在18小时内开始退化，内皮细胞将发生凋亡。
  6. 在管状结构形成的高峰期，小心吸除孔内培养基，避免破坏BME表面的管状网络。
    1. 每孔加入1 ml DPBS洗涤一次，随后吸除。
      1. 如需立即观察，每孔加入1 ml新鲜DPBS，使用连接数字相机的倒置显微镜，或在细胞经钙黄绿素AM染色（如步骤4.1.1所述）时使用荧光/共聚焦显微镜观察管状网络。
      2. 如需固定管状结构以供后续观察，向吸除培养基后的各孔加入4%多聚甲醛，在室温下孵育15分钟。
        1. 去除多聚甲醛，用DPBS洗涤两次，然后每孔加入1 mL新鲜DPBS。
        2. 建议在固定前先进行显微成像，因部分管状结构可能在固定过程中断裂。

6. 管状网络的定量分析

  1. 根据研究者的偏好，可通过多种方式对管状网络进行量化，已有若干计算机程序能够测量以下参数：管状结构数量、环/网格数量、分支位点/节点数量、管状结构长度。
  2. 可使用代表性计算机程序，如 Image J 配合 Angiogenesis Analyzer 插件16，对管状网络进行定量分析。

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结果

将小鼠3B-11内皮细胞接种于凝固的低生长因子BME（本实验中使用的产品为Matrigel）上，并随时间进行观察。如图1所示，小鼠角质形成细胞或成纤维细胞分泌的血管生成因子均能随时间诱导管状结构的形成。内皮细胞在接种后1–2小时内即开始迁移并形成细小分支。使用先前从小鼠角质形成细胞获得的条件培养基时，管状结构的形成在4–6小时内达到峰值。至24小时时，部分分支仍存在，但许多细胞已进入凋亡状态，管状结构开始断裂解体。

细胞数量对成管具有显著影响（图2）。当接种在基质上的细胞数量不足时，形成的管状结构较少，网络结构也极为有限。随着接种细胞数量的增加，管状网络变得更加广泛。然而，当细胞浓度过高时，细胞开始发生聚集或形成单层，导致不同处理组之间的差异被掩盖。

使用3B-11细胞进行管状结构形成实验时，最佳效果出现在第2至第6代细胞之间。超过第6代后，细胞形成的网络结构不再显著；到第10代之后，细胞将无法形成任何主要的网络结构。从液氮冻存复苏后的细胞，应至少传代两次以上...

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讨论

血管生成参与生理和病理过程。研究血管生成中涉及的机制需要使用能够重现血管生成主要步骤的检测方法。内皮细胞管形成检测相比其他检测方法具有多项优势：易于建立、相对经济、可在数小时内形成管状结构，且可进行定量分析。此外，该检测可在24孔或96孔板中完成，因此可用于高通量筛选，以鉴定促进或抑制血管生成的因子。尽管我们在实验中使用了3B-11小鼠内皮细胞，但该检测也可应用于多种人或小鼠内皮细胞系，包括HUVEC和SVEC。

进行内皮细胞成管实验时，将内皮细胞与含有促血管生成或抗血管生成因子的条件培养基混合，接种于生长因子减少的基底膜基质上。内皮细胞在1 小时内开始排列成线状，2 小时内开始形成含管腔的管状结构。可通过相差倒置显微镜观察成管情况，或在实验结束时加入钙黄绿素AM，利用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察管状结构。

可通过多种方式优化实验结果。首先，原代细胞的最佳传代次数应在第二代至第六代之间。使用第二代之前或第十代之后的细胞不利于获得最大程度的成管形成。其次，细胞数量需根据所用的细胞类型和细胞系进行优化。对于小鼠...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的院内研究计划以及NCI资助项目UA5CA152907资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Costar 24孔组织培养处理板Corning3524
BD Matrigel 基底膜基质，生长因子减量BD Biosciences354230
Gibco 0.05% 胰蛋白酶-EDTALife Technologies25300-054
Gibco L-谷氨酰胺 200 mM (100x)Life Technologies25030-081
Gibco 青霉素-链霉素溶液Life Technologies15140-122
Gibco DMEM (1x)Life Technologies11965-092
Gibco DPBS (1x)Life Technologies14190-144
胎牛血清Atlas BiologicalsF-0500-A
Calcein AMLife TechnologiesC3100MP
DMSOATCC4-X

参考文献

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