木质素下调 Zea mays 通过dsRNAi和Klason木质素分析

摘要

采用双链RNA干扰（dsRNAi）技术下调玉米肉桂酰辅酶A还原酶（ZmCCR1）基因，以降低植株木质素含量。通过显微分析观察细胞壁中木质素的下调情况，并采用克拉森法进行定量测定。同时分析半纤维素和结晶纤维素的组分变化。

摘要

为了促进木质纤维素生物质作为替代性生物能源资源的利用，在生物转化过程中需要进行预处理步骤，以打开植物细胞壁的结构，增加细胞壁碳水化合物的可及性。木质素是一种存在于多种细胞壁中的多酚类物质，已知会显著阻碍酶的进入。将木质素含量降低至不影响植物结构完整性和防御系统的水平，可能是降低生物乙醇生产成本的有效策略。在本研究中，我们利用双链RNA干扰技术，对木质素生物合成相关基因之一——肉桂酰辅酶A还原酶（ZmCCR1）进行了遗传上的下调。通过粒子轰击法将ZmCCR1_RNAi表达载体整合到玉米基因组中。与野生型对照植株相比，转基因玉米植株生长正常，未干扰生物量的积累或防御机制，仅在转基因植株的叶片中脉、苞叶和茎秆中表现出褐色着色现象。显微结构分析结合组织化学检测结果显示，转基因植株叶片的厚壁组织纤维变薄，但其他主要维管系统组分的结构和大小未发生改变。转基因玉米中的木质素含量降低了7–8.7%，结晶纤维素含量随木质素减少而增加，而半纤维素含量保持不变。这些分析结果可能表明，碳流向已从木质素生物合成途径转向纤维素生物合成途径。本文详细描述了利用RNA干扰技术在玉米中下调木质素含量的操作步骤，以及用于验证这些修饰对细胞壁结构影响的细胞壁组分分析方法。

引言

利用木质纤维素生物质生产生物燃料具有很高的吸引力，因为这类原料在美国储量丰富¹，并且在农业和林业残余物可持续采收的情况下，不会与用于粮食和动物饲料生产的耕地直接竞争。然而，与目前美国主要的生物燃料原料——玉米籽粒不同，木质纤维素材料的结构更为复杂，难以降解。除了纤维素和半纤维素这两种长链碳水化合物（它们是木质纤维素材料发酵过程中糖的主要来源）之外，许多植物细胞壁还含有木质素，这是一种苯基丙烷类聚合物，可为细胞壁提供机械强度、抵御病原体侵袭的防御能力以及疏水性。尽管木质素对植物的生长和存活至关重要，但它也显著阻碍了纤维素和半纤维素被酶有效转化为可溶性糖的过程。由于高木质素含量会对加工性能和产品质量产生不利影响，这类材料通常不被生物燃料（通过生物转化途径）以及造纸和纸浆行业所青睐。因此，对植物材料进行遗传改造，以降低其木质素含量至不影响作物结构强度和防御系统的程度，可能对降低木质纤维素生物燃料及纸浆造纸行业的生产成本具有重要意义。

在玉米（Zea mays）中，木质素通过阿魏酸和二阿魏酸桥与初生细胞壁中的半纤维素共价交联²。木质素-半纤维素复合物通过氢键与纤维素微纤丝结合，形成赋予次生细胞壁完整性和强度的复杂基质。植物细胞壁的机械强度在很大程度上取决于木质素结构单元的类型^3-5。在以往的研究中，改变木质素结构单元的比例对酶解消化性的影响未表现出明确的趋势^6-11。然而，降低木....

方案

1. 用于下调ZmCCR1的dsRNAi载体的制备

1. 设计基因特异性引物，包含用于构建dsRNAi载体以敲除ZmCCR1基因所需的限制性内切酶位点。设计两对引物以扩增ZmCCR1 cDNA的两个片段：一个是从核苷酸748至1271的523 bp片段，另一个是从核苷酸986至1271的285 bp片段。ZmCCR1 cDNA由亚利桑那基因组研究所（AGI）提供。更多细节见图1。
2. 使用引物ZmCCR1_748F_BglII（5’-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3’）和ZmCCR1_1271R_NcoI（5’-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3’），以ZmCCR1 cDNA为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增大片段。使用引物ZmCCR1_986F_BglII（5’-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3’）和ZmCCR1_1271R_SacI（5’-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3’）扩增较小片段（285 bp）。
3. 按照制造商说明，将两个片段分别连接至pGEM-T Easy载体中。
4. 使用商业质粒小提试剂盒，对各自含有pGEM-T构建体的单个转化子进行质粒DNA小量提取。
5. 用BglII和NcoI

结果

我们通过RNAi技术实现了玉米植株中木质素含量的降低。采用基因枪轰击法进行遗传转化，转化效率约为30%。在T0至T2代植株中均持续观察到ZmCCR1基因的沉默效应。与野生型玉米植株相比，木质素降低的转基因植株生长情况相似，仅在叶片中脉、苞叶和茎秆部位表现出褐色着色现象。组织学检测显示，突变株系玉米叶片中脉的厚壁组织纤维细胞壁厚度显著降低¹⁸。尽管细胞壁厚度有所减少，但包括导管、筛管和维管束鞘细胞在内的其他主要维管系统结构与野生型对照相比未发现明显差异（图2A）¹⁸。这表明，在ZmCCR1_RNAi突变株系中，水分运输、养分转运以及茎秆的机械强度均未受到不利影响。

采用克拉森木质素测定法测定木质素含量。图3展示了野生型玉米和ZmCCR1_RNAi转基因株系（T1）中酸不溶性克拉森木质素（g/kg 干玉米秸秆）的含量。三个转基因株系（1c-4、-5 和 -6）与野生型玉米植株相比，木质素含量分别显著降低了8.1%、7.0%.......

讨论

微生物纤维素酶对植物细胞壁多糖的可及性在很大程度上取决于这些多糖与酚类聚合物结合的程度²³。木质纤维素生物质转化为可发酵糖的速率与沉积在植物次生细胞壁中的木质素含量呈负相关。这种相关性归因于木质素的物理化学特性，例如疏水性²⁴、化学结构的异质性以及缺乏规则的可水解单体间连接键²⁵。

本研究中，dsRNAi 技术在不同遗传靶标上诱导了不同程度的基因下调。由 ZmCCR1_RNAi 构建体介导的木质素下调导致 T1 代转基因植株出现褐色表型。褐中脉（bm）表型是一种自然发生的现象，由木质素含量降低及木质素组分改变所致。与其他仅在叶片中脉表现出褐色表型的天然 bm 突变体不同，ZmCCR1_RNAi 突变体植株在植株的其他部位（包括茎秆和苞叶）也表现出该表型。组织学检测还表明，ZmCCR1 下调植株叶片的厚壁组织细胞壁厚度显著低于野生型对照植株（图 2A）。然而，主要维管系统（包括导管、韧皮部或维管束.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
N6OSM（渗透压培养基）			实验室自制
N6E（愈伤组织诱导培养基）			实验室自制
N6S 培养基（筛选培养基）			实验室自制
再生培养基			实验室自制
生根培养基			实验室自制
10% 中性缓冲福尔马林（1 L）			实验室自制
Bio-Rad PSD-1000/He 基因枪系统	Hercules, CA, 美国
Zeiss PASCAL 共聚焦激光扫描显微镜	Carl Zeiss, Jena, 德国		用于明场显微镜观察，图像使用配备 488 nm 激发镜、560 nm 发射滤光片和 505–530 nm 发射滤光片的 Zeiss（Jena, 德国）PASCAL 共聚焦激光扫描显微镜采集。图像分析采用 Laser scanning microscope PASCAL LSM 版本 3.0 SP3 软件进行。
Excelsior ES 组织处理仪	Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, 美国
HistoCentre III 包埋工作站	Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, 美国
Reichert 2030 型切片机	Reichert, Depew, NY, 美国
Emscope SC 500 型溅射镀膜仪	Ashford, Kent, 英格兰
JEOL JSM-6400V 扫描电子显微镜	JEOL Ltd., Tokyo, 日本
Fitzpatrick JT-6 Homoloid 磨粉机	Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL, 美国
MA35 水分分析仪	Sartorius
临界点干燥仪，Balzers CPD	Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, 美国
螺口高压管	Ace Glass, Vineland, NJ, 美国	#8648-27
螺口高压管塞	Ace Glass, Vineland, NJ, 美国	#5845-47