采用双链RNA干扰（dsRNAi）技术下调玉米肉桂酰辅酶A还原酶（ZmCCR1）基因，以降低植株木质素含量。通过显微分析观察细胞壁中木质素的下调情况，并采用克拉森法进行定量测定。同时分析半纤维素和结晶纤维素的组分变化。
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摘要
摘要
为了促进木质纤维素生物质作为替代性生物能源资源的利用，在生物转化过程中需要进行预处理步骤，以打开植物细胞壁的结构，增加细胞壁碳水化合物的可及性。木质素是一种存在于多种细胞壁中的多酚类物质，已知会显著阻碍酶的进入。将木质素含量降低至不影响植物结构完整性和防御系统的水平，可能是降低生物乙醇生产成本的有效策略。在本研究中，我们利用双链RNA干扰技术，对木质素生物合成相关基因之一——肉桂酰辅酶A还原酶（ZmCCR1）进行了遗传上的下调。通过粒子轰击法将ZmCCR1_RNAi表达载体整合到玉米基因组中。与野生型对照植株相比，转基因玉米植株生长正常，未干扰生物量的积累或防御机制，仅在转基因植株的叶片中脉、苞叶和茎秆中表现出褐色着色现象。显微结构分析结合组织化学检测结果显示，转基因植株叶片的厚壁组织纤维变薄，但其他主要维管系统组分的结构和大小未发生改变。转基因玉米中的木质素含量降低了7–8.7%，结晶纤维素含量随木质素减少而增加，而半纤维素含量保持不变。这些分析结果可能表明，碳流向已从木质素生物合成途径转向纤维素生物合成途径。本文详细描述了利用RNA干扰技术在玉米中下调木质素含量的操作步骤，以及用于验证这些修饰对细胞壁结构影响的细胞壁组分分析方法。
引言
利用木质纤维素生物质生产生物燃料具有很高的吸引力，因为这类原料在美国储量丰富1，并且在农业和林业残余物可持续采收的情况下，不会与用于粮食和动物饲料生产的耕地直接竞争。然而，与目前美国主要的生物燃料原料——玉米籽粒不同，木质纤维素材料的结构更为复杂，难以降解。除了纤维素和半纤维素这两种长链碳水化合物（它们是木质纤维素材料发酵过程中糖的主要来源）之外，许多植物细胞壁还含有木质素，这是一种苯基丙烷类聚合物，可为细胞壁提供机械强度、抵御病原体侵袭的防御能力以及疏水性。尽管木质素对植物的生长和存活至关重要，但它也显著阻碍了纤维素和半纤维素被酶有效转化为可溶性糖的过程。由于高木质素含量会对加工性能和产品质量产生不利影响，这类材料通常不被生物燃料（通过生物转化途径）以及造纸和纸浆行业所青睐。因此，对植物材料进行遗传改造，以降低其木质素含量至不影响作物结构强度和防御系统的程度，可能对降低木质纤维素生物燃料及纸浆造纸行业的生产成本具有重要意义。
在玉米（Zea mays）中，木质素通过阿魏酸和二阿魏酸桥与初生细胞壁中的半纤维素共价交联2。木质素-半纤维素复合物通过氢键与纤维素微纤丝结合，形成赋予次生细胞壁完整性和强度的复杂基质。植物细胞壁的机械强度在很大程度上取决于木质素结构单元的类型3-5。在以往的研究中，改变木质素结构单元的比例对酶解消化性的影响未表现出明确的趋势6-11。然而，降低木质素含量通常可提高转化率12,13，并可能是增强水解酶（包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶）对植物材料消化能力的关键14。
通过基因工程调控转录本表达水平已被广泛用于改良作物性状。先进技 术包括反义15 和共抑制16 技术，可实现靶基因的有效下调。此外，利用编码具有发夹结构的内含子剪接RNA的基因构建体，已实现基因的完全敲除。17此外，还采用双链RNA干扰（dsRNAi）技术， 即 一种强大且高效的基因表达调控因子，通过靶向转录本降解或抑制翻译，可有效诱导对目标 mRNA 的多种抑制效应18基因沉默技术存在若干局限性。这些技术无法精确调控转录水平，且可能对其他同源基因产生意外的沉默效应。
本方法中，我们采用粒子轰击法将dsRNAi载体导入玉米基因组。迄今为止，已有大量植物物种通过粒子轰击法成功实现转化。 农杆菌 介导转化、电穿孔和显微注射方法。在玉米遗传转化中，基因枪轰击法相较于其他所有方法具有优势，因其效率最高。基因枪轰击不依赖于细菌，因此不受诸如基因大小、基因来源物种或植物基因型等生物学限制。这种物理介导的外源基因递送系统能够高效地将高分子量DNA和多个基因导入植物基因组，在某些情况下还可导入叶绿体。19通过扫描电子显微镜（SEM）可观察叶片中脉维管系统中木质素的减少，该方法有助于分析样品的表面形貌和组成。
在玉米植株中，玉米基因组中发现了两个肉桂酰辅酶A还原酶基因（ZmCCR1：X98083 和 ZmCCR2：Y15069）20。肉桂酰辅酶A还原酶催化羟基肉桂酰辅酶A酯转化为肉桂醛。我们选择下调 ZmCCR1 基因以抑制该酶的活性，因为该基因在所有木质化组织中均有表达。选择 ZmCCR1 基因3’末端的523个核苷酸构建dsRNAi载体，因其序列相较于 ZmCCR2 更具差异性。因此，该dsRNAi构建体将特异性结合于 ZmCCR1，避免脱靶沉默效应21。将 ZmCCR1_RNAi 构建体插入含有绿色组织特异性启动子——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）的细胞质表达系统ImpactVector1.1-tag（IV 1.1）中。
为了研究 dsRNAi 结构对转基因植物的影响，对木质素含量进行了定量分析。与酸性洗涤木质素定量方法相比，Klason（酸不溶性）木质素测定方法更为准确，因为后者会溶解部分木质素22。因此，本研究测定了转基因玉米茎秆中的 Klason 木质素含量。该方法包括两步酸水解过程，可将聚合碳水化合物转化为可溶性单糖23。水解后的生物质被分离为酸可溶性和酸不溶性组分，其中酸不溶性木质素的测定依据先前的研究方法进行23,24。理想情况下，木质素分析应在水解步骤之前先用水和乙醇进行提取，以去除可能干扰结果的可溶性物质；并在水解后对木质素残渣进行灼烧，以校正残渣中可能存在的灰分含量。若省略这些步骤，样品的木质素含量可能会被人为高估。本文列出了完整的分析方法，但在本实验中，由于可用于检测的样品量较少，无法完成上述两个步骤。
在木质素下调的转基因玉米品系中，还分析了另外两种细胞壁组分：纤维素和半纤维素。已有报道指出，苯丙氨酸解氨酶（PAL）25、4-香豆酸:辅酶A连接酶（4CL）26或肉桂醇脱氢酶（CAD）27表达下调的转基因植物，其细胞壁其他结构组分含量会增加。在本研究的第一步中，采用Updegraff法28测定结晶纤维素含量。该方法最初设计用于大量纤维素降解细菌和真菌中纤维素的测定。简而言之，将磨碎的玉米茎秆用Updegraff试剂（冰乙酸：硝酸：水）处理，以去除半纤维素、木质素和木聚糖。然后通过加入H2SO4进行Saeman水解，将结晶纤维素完全水解为葡萄糖。再采用比色蒽酮法29测定结晶纤维素含量。为了验证半纤维素含量是否发生变化，将磨碎茎秆中的单糖提取物用三氟乙酸水解，采用醛醇乙酸酯法衍生化后，通过气相色谱法（GC）30进行分析。结晶纤维素含量及基质多糖组成分析的详细步骤见Foster et al.（2010）31。
本文介绍了利用RNAi技术、基因枪介导转化以及木质素分析，对玉米进行木质素下调的方法，以加速玉米木质纤维素生物质的解构，从而转化为可发酵糖类用于生物燃料生产。
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方案
1. 用于下调ZmCCR1的dsRNAi载体的制备
- 设计基因特异性引物，包含用于构建dsRNAi载体以敲除ZmCCR1基因所需的限制性内切酶位点。设计两对引物以扩增ZmCCR1 cDNA的两个片段：一个是从核苷酸748至1271的523 bp片段，另一个是从核苷酸986至1271的285 bp片段。ZmCCR1 cDNA由亚利桑那基因组研究所（AGI）提供。更多细节见图1。
- 使用引物ZmCCR1_748F_BglII（5’-AGATCTACATCCTCAAGTACCTGGAC-3’）和ZmCCR1_1271R_NcoI（5’-CCATGGTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3’），以ZmCCR1 cDNA为模板，通过聚合酶链式反应（PCR）扩增大片段。使用引物ZmCCR1_986F_BglII（5’-AGATCTGGAAGCAGCCGTACAAGTTC-3’）和ZmCCR1_1271R_SacI（5’-GAGCTCTTTACACAGCAGGGGAAGGT-3’）扩增较小片段（285 bp）。
- 按照制造商说明，将两个片段分别连接至pGEM-T Easy载体中。
- 使用商业质粒小提试剂盒，对各自含有pGEM-T构建体的单个转化子进行质粒DNA小量提取。
- 用BglII和NcoI双酶切pGEM-T::ZmCCR1（523 bp）和ImpactVector（IV）-1.1（细胞质表达载体）。
- 将经酶切并凝胶纯化的大片段ZmCCR1（523 bp）连接至经同样酶切并凝胶纯化的IV-1.1载体中。
- 用BglII和SacI双酶切pGEM-T::ZmCCR1（285 bp）和IV-1.1::ZmCCR1（523 bp），以便将小片段插入至IV-1.1::ZmCCR1（523 bp）中。
- 将经酶切并凝胶纯化的小片段ZmCCR1（285 bp）连接至经酶切并凝胶纯化的IV-1.1::ZmCCR1（523 bp）中。
- 将523 bp和285 bp两个片段均克隆至IV-1.1载体中，构建ZmCCR1 RNAi载体，该载体包含一个中间含有238 bp间隔区的285 bp反向重复序列（见图1）。
- 将该构建体转入Escherichia coli (E. coli)中，培养细菌并进行中量质粒DNA提取，以获得足够量的质粒DNA用于玉米遗传转化。
2. 玉米遗传转化
- 钨颗粒的制备
- 将60 mg钨珠（M10）置于1.5 ml离心管中，加入1 ml 70%乙醇，涡旋振荡2分钟进行清洗。在23 °C孵育10分钟，然后以18,894 × g离心2分钟，弃去上清液。
- 用1 ml 100%乙醇洗涤3次，每次离心2分钟并弃去上清液。加入1 ml无菌50%甘油，使微粒浓度达到60 mg/ml。
- 基因枪轰击用DNA的制备
- 将50 μl（3 mg）用50%甘油配制的钨珠加入1.5 ml离心管中。依次加入5 μl（1 μg）的IV-1.1::ZmCCR1 RNAi质粒DNA、50 μl 2.5 M CaCl2和20 μl 0.1 M亚精胺。每加入一种试剂后短暂涡旋混匀。
- 短暂涡旋钨珠-DNA混合物，然后以18,894 × g离心30秒。倒去上清液，将沉淀重悬于140 μl 70%乙醇中。去除液体并弃去。加入140 μl 100%乙醇，去除液体并弃去。
- 加入48 μl 100%乙醇。立即使用，或在冰上保存不超过4小时后进行轰击。
- 基因枪轰击
- 将直径3-5 cm的Hi-II胚性玉米愈伤组织（来自爱荷华州立大学玉米转化中心）放置于含N6OSM培养基（作为渗透压调节剂）的100 mm培养皿中央，在轰击前至少放置4小时。
- 按照制造商说明准备PSD-1000/He粒子递送系统32。
- 用70%乙醇对轰击室壁进行消毒。将无菌的650 psi破裂盘装入无菌固定帽中。取5-6 μl M10-DNA溶液均匀涂布于宏载体表面，短暂干燥。将宏载体和阻挡筛装入微载体发射组件中。
- 将微载体发射组件和玉米愈伤组织放入轰击室，置于距阻挡筛一定距离的位置（L2 = 6 cm），关闭舱门。在27 psi真空条件下，利用氦气推动微粒撞击金属网筛。
- 按下发射按钮，直至破裂盘爆裂且氦气压力表读数降至零，松开按钮。
- 将轰击后的愈伤组织置于含N6OSM（渗透压培养基）的培养皿中，在27 °C黑暗条件下孵育16小时。将愈伤组织分割成约十块，转移至N6E培养基（愈伤组织诱导培养基）的培养皿中，在27 °C黑暗条件下继续孵育5天。
- 筛选
- 在N6E培养基上培养5天后，将愈伤组织转移至N6S培养基（筛选培养基）。每30天将所有愈伤组织在筛选培养基上继代一次，持续8-12周，期间避免破坏愈伤组织结构。
- 约8-10周后，白色、快速生长的组织区域将从不增殖且部分坏死的母体愈伤组织中长出。切下白色快速生长的组织，转移到新鲜筛选培养基（N6S）上继代培养，并按上述条件继续孵育。
- 再生
- 将白色且快速生长的胚性愈伤组织转移至再生培养基，按上述条件孵育1周。将正在再生的胚性愈伤组织转入16小时光照/8小时黑暗的光周期条件下，温度保持在25-27 °C。
- 3-4周后，将再生出的芽转移到玻璃试管中的生根培养基上，继续按上述条件孵育。当出现明显的根系发育后，小心在自来水下冲洗根部，然后将小植株移栽至盛有土壤的4”花盆中。用塑料袋覆盖花盆以保持湿度。2天后在塑料袋上打小孔。5-6天后移除塑料袋。再继续按上述条件孵育5-6天。
- 温室培养
- 将幼苗移栽至盛有土壤的18”花盆中，在夏季全日照或温室光照条件下培养。最初再生的植株称为T0代，其产生的第一批种子属于T1代。
3. 组织学检测
-
- 用 5 ml 的 10% 中性缓冲福尔马林固定玉米叶片中脉。
- 使用组织处理机对组织进行处理，并在组织处理机上进行真空浸蜡。
- 使用 HistoCentre III 包埋仪将组织包埋于石蜡中。
- 待蜡块冷却后，去除边缘多余的石蜡。
- 使用切片机以 4–5 μm 厚度对样品进行切片。
- 将切片置于载玻片上，并在 56 °C 的培养箱中干燥 2–24 小时。确保切片完全贴附于载玻片上。
- 在 23 °C 下，用两次更换的二甲苯处理切片各 5 分钟，以脱蜡。
- 在 23 °C 下，通过两次更换 100% 乙醇各 2 分钟，以及两次更换 95% 乙醇各 2 分钟，对载玻片进行水化。
- 用流动的自来水冲洗切片 2 分钟。
- 用 0.05% 甲苯胺蓝 O 染色 1–2 分钟，并用 ddH2O 短暂冲洗。
- 在样品上滴加浸油，加盖盖玻片，并通过光学显微镜观察。
- 扫描电子显微镜（SEM）
- 在 4 °C 下，用 4% 戊二醛和 0.1 M 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）固定横切的玉米叶片中脉，固定时间为 1–2 小时。
- 用缓冲液短暂冲洗样品，然后在乙醇梯度溶液（25%、50%、75% 和 95%）中各脱水 10–15 分钟，并在 100% 乙醇中脱水 10 分钟，重复 3 次。
- 使用液态二氧化碳作为过渡流体，在临界点干燥器中干燥已脱水的玉米叶片中脉横切样品。
- 使用高真空碳导电胶将干燥的样品固定在铝制载样台上。
- 在氩气吹扫的溅射镀膜仪中，对固定于铝制载样台上的玉米叶片中脉进行金镀膜（厚度约为 20 nm）。
- 在 JEOL JSM-6400V（六硼化镧电子发射源）扫描电子显微镜中观察镀膜后的样品。
- 使用 analySIS Pro 软件（版本 3.2）采集数字图像。
4. 克拉森木质素测定
- 将样品通过2 mm筛网进行研磨。
- 使用水分分析仪测定每个样品的含水量，并记录数值。
- 称取约1.5 g的每个样品，并记录质量。首先用水进行第一次提取，随后用乙醇进行第二次提取，可使用自动溶剂提取器（每次提取3个循环，每个循环约14分钟）或索氏提取装置（每次提取8小时）。（注意：此步骤可去除在酸水解过程中可能缩合并干扰木质素准确测定的提取物，从而避免凯氏木质素含量的假性升高。）
- 将提取后的样品在45 °C下干燥过夜，然后在干燥器中冷却，再次称重。
- 将恒温振荡器设定为30 °C。将0.3 g干燥提取后的样品分别加入带螺口盖的高压管中（建议每个样品设三个重复），并精确记录质量至0.1 mg。向每根高压管中加入3 ml 72% H2SO4。
- 使用玻璃或聚四氟乙烯（Teflon）搅拌棒混匀样品。搅拌棒保留在管中，直至孵育后加水时再取出。
- 将试管置于设定为30 °C、150 rpm的恒温振荡器中孵育60分钟。1小时后，向每管中加入84 ml去离子水，将酸浓度稀释至4%，并用搅拌棒混匀。注意避免样品残留在液面以上的管壁上。
- 将所有试管盖紧塞子后放入金属架或大烧杯中。在121 °C下使用液体灭菌程序进行高压灭菌1小时。待其冷却至室温后再打开。
- 将过滤坩埚在575 °C马弗炉中预灼烧至少4小时。将坩埚在干燥器中冷却至少1小时。
- 使用真空抽滤装置，通过橡胶接头将每根试管中的溶液分别抽滤至单独的坩埚中。用去离子水冲洗试管内残留的颗粒物。
- 将木质素残渣在105 °C下干燥至少4小时。记录干燥后坩埚与残渣的总重量。
- 若使用575 °C马弗炉，需先用本生灯对样品进行预灼烧，直至无烟或灰化完全，然后放入炉中灼烧24小时；若使用程序控温马弗炉，则无需预灼烧，采用以下程序：
- 从室温以升温速率升至105 °C，并保持12分钟。
- 以10 °C/min的速率升至250 °C，并保持30分钟。
- 以20 °C/min的速率升至575 °C，并至少保持180分钟。
- 从马弗炉中取出坩埚，在干燥器中冷却。称量坩埚与灰分的总重量。
- 使用以下公式计算酸不溶残渣含量：
MPRE = 提取前生物质的质量
MPOST = 提取后生物质的质量
MVIAL = 加入小瓶中的提取后生物质的质量
MRESIDUE = 坩埚与木质素残渣的质量
MASH = 坩埚与灰分的质量
MC = 提取前生物质的水分含量（以总重量为基础）
5. 碳水化合物分析
- 根据Foster et al. (2010) 的方案31进行细胞壁碳水化合物分析。简而言之，从冻干的植物材料中制备醇不溶性残渣，随后用三氟乙酸水解材料，并将溶解释放的单糖衍生物与其相应的醛糖醇乙酸酯进行比对。通过与四极杆质谱仪联用的气相色谱（GC）分析这些挥发性衍生物。
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结果
我们通过RNAi技术实现了玉米植株中木质素含量的降低。采用基因枪轰击法进行遗传转化，转化效率约为30%。在T0至T2代植株中均持续观察到ZmCCR1基因的沉默效应。与野生型玉米植株相比，木质素降低的转基因植株生长情况相似，仅在叶片中脉、苞叶和茎秆部位表现出褐色着色现象。组织学检测显示，突变株系玉米叶片中脉的厚壁组织纤维细胞壁厚度显著降低18。尽管细胞壁厚度有所减少，但包括导管、筛管和维管束鞘细胞在内的其他主要维管系统结构与野生型对照相比未发现明显差异（图2A）18。这表明，在ZmCCR1_RNAi突变株系中，水分运输、养分转运以及茎秆的机械强度均未受到不利影响。
采用克拉森木质素测定法测定木质素含量。图3展示了野生型玉米和ZmCCR1_RNAi转基因株系（T1）中酸不溶性克拉森木质素（g/kg 干玉米秸秆）的含量。三个转基因株系（1c-4、-5 和 -6）与野生型玉米植株相比，木质素含量分别显著降低了8.1%、7.0%...
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讨论
微生物纤维素酶对植物细胞壁多糖的可及性在很大程度上取决于这些多糖与酚类聚合物结合的程度23。木质纤维素生物质转化为可发酵糖的速率与沉积在植物次生细胞壁中的木质素含量呈负相关。这种相关性归因于木质素的物理化学特性，例如疏水性24、化学结构的异质性以及缺乏规则的可水解单体间连接键25。
本研究中，dsRNAi 技术在不同遗传靶标上诱导了不同程度的基因下调。由 ZmCCR1_RNAi 构建体介导的木质素下调导致 T1 代转基因植株出现褐色表型。褐中脉（bm）表型是一种自然发生的现象，由木质素含量降低及木质素组分改变所致。与其他仅在叶片中脉表现出褐色表型的天然 bm 突变体不同，ZmCCR1_RNAi 突变体植株在植株的其他部位（包括茎秆和苞叶）也表现出该表型。组织学检测还表明，ZmCCR1 下调植株叶片的厚壁组织细胞壁厚度显著低于野生型对照植株（图 2A）。然而，主要维管系统（包括导管、韧皮部或维管束...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
显微成像工作由密歇根州立大学先进显微中心提供技术支持。玉米愈伤组织购自爱荷华州立大学玉米转化中心。作者谨此感谢密歇根州立大学植物研究实验室的 Jeffrey R. Weatherhead 在碳水化合物分析方面的技术协助。本研究由密歇根玉米营销项目（CMPM）和植物生物技术研究联盟（CPBR）慷慨资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| N6OSM（渗透压培养基） | 实验室自制 | ||
| N6E（愈伤组织诱导培养基） | 实验室自制 | ||
| N6S 培养基（筛选培养基） | 实验室自制 | ||
| 再生培养基 | 实验室自制 | ||
| 生根培养基 | 实验室自制 | ||
| 10% 中性缓冲福尔马林（1 L） | 实验室自制 | ||
| Bio-Rad PSD-1000/He 基因枪系统 | Hercules, CA, 美国 | ||
| Zeiss PASCAL 共聚焦激光扫描显微镜 | Carl Zeiss, Jena, 德国 | 用于明场显微镜观察，图像使用配备 488 nm 激发镜、560 nm 发射滤光片和 505–530 nm 发射滤光片的 Zeiss（Jena, 德国）PASCAL 共聚焦激光扫描显微镜采集。图像分析采用 Laser scanning microscope PASCAL LSM 版本 3.0 SP3 软件进行。 | |
| Excelsior ES 组织处理仪 | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, 美国 | ||
| HistoCentre III 包埋工作站 | Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, 美国 | ||
| Reichert 2030 型切片机 | Reichert, Depew, NY, 美国 | ||
| Emscope SC 500 型溅射镀膜仪 | Ashford, Kent, 英格兰 | ||
| JEOL JSM-6400V 扫描电子显微镜 | JEOL Ltd., Tokyo, 日本 | ||
| Fitzpatrick JT-6 Homoloid 磨粉机 | Continental Process Systems, Inc., Westmont, IL, 美国 | ||
| MA35 水分分析仪 | Sartorius | ||
| 临界点干燥仪，Balzers CPD | Leica Microsysstems Inc, Buffalo Grove, IL, 美国 | ||
| 螺口高压管 | Ace Glass, Vineland, NJ, 美国 | #8648-27 | |
| 螺口高压管塞 | Ace Glass, Vineland, NJ, 美国 | #5845-47 |
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