细胞表面蛋白在生物学上具有重要意义，且普遍存在糖基化修饰。本文介绍一种糖肽富集方法，用于溶解、富集并去糖基化这些蛋白，从而便于进行基于液相色谱-质谱的蛋白质组学分析。
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本文内容
摘要
摘要
细胞表面蛋白（包括细胞外基质蛋白）参与细胞生长、分化和增殖等各种主要的细胞过程与功能。对这些蛋白进行全面表征，可为生物标志物发现、细胞类型鉴定和药物靶点筛选提供丰富信息，同时有助于深入理解细胞生物学与生理学。然而，由于表面蛋白本身丰度低、疏水性强且存在大量翻译后修饰，给分析带来显著挑战。我们利用表面蛋白普遍存在的糖基化特性，提出一种高通量糖肽富集方法，整合了多种现有N-糖蛋白质组学技术的优势。该方法可富集来源于表面蛋白的糖肽，并去除其糖链，从而便于通过液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）进行蛋白质组学分析。所解析的N-糖蛋白质组包含蛋白质的身份信息、表达量及其糖基化位点信息。该方法已成功应用于癌症、干细胞及药物毒性等多个领域的系列研究。该方法的局限性在于表面膜蛋白丰度较低，因此与以胞质蛋白为中心的研究相比，本分析需要相对更多的样本量。
引言
细胞表面蛋白与细胞外环境相互作用，并将细胞外信号传递至细胞内部。因此，这些蛋白 （包括细胞外基质蛋白） 在细胞生物学和生理学的各个方面发挥着关键作用，涵盖增殖、生长、迁移、分化以及衰老等过程。表面蛋白通过与其他细胞、蛋白以及小分子相互作用而发挥功能1-3。对细胞表面蛋白进行分子表征不仅受到生物学家的高度关注，也受到制药企业的重视，因为超过60%的药物靶向作用于细胞表面蛋白4。
串联质谱法（MS）因其在蛋白质和多肽鉴定中具有优异的灵敏度、准确性和通量，已成为全局蛋白质组学研究的有力工具5,6。然而，细胞表面蛋白对基于质谱的蛋白质组学分析构成了重大挑战，因为大多数表面蛋白含量较低且存在大量修饰。表面蛋白的跨膜区域使其具有疏水性，对于多次跨膜蛋白尤其如此。因此，在没有去垢剂的情况下，很难将膜蛋白溶解于水溶液中；然而，去垢剂的使用通常会抑制高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）在蛋白质鉴定中的性能1,7,8。因此，在直接基于液相色谱-质谱（LC-MS）的蛋白质组学分析中，膜蛋白的表征仍不充分。
糖基化是发生在细胞表面蛋白质中最重要且最丰富的翻译后修饰之一9。糖链结构的高度复杂性和异质性会干扰肽段的质谱信号10。尽管如此，已有多种蛋白质组学方法利用这一独特修饰来富集表面蛋白，并在液相色谱-质谱（LC-MS）分析前去除蛋白质上的糖基。这些方法包括基于凝集素的亲和捕获11、基于肼化学或硼酸化学的捕获方法12，以及亲水相互作用色谱分离技术8,13。去除糖链可将膜蛋白转化为常规蛋白质，从而显著简化质谱表征过程。由于糖基化也存在于与膜蛋白相比具有更高溶解度的分泌蛋白中，许多糖蛋白质组学方法均针对可溶性蛋白进行了优化，因此在应用于膜蛋白时往往表现出较低的糖肽选择性和灵敏度8,14。此外，还存在其他专门用于富集细胞表面蛋白的方法，例如超速离心法15和标记策略16。最近一项研究对本方法与其他现有膜蛋白表征方法进行了详细比较17，结果表明，本方法在操作更简便的同时，性能至少与所比较的其他膜蛋白质组学方法相当，甚至更优。
为了帮助研究人员使用该方法，本文详细描述了一种通用实验方案。该方法整合了现有糖蛋白质组学策略的多项优势，并专门针对膜糖蛋白设计，但同样适用于分泌蛋白。本方法的特点包括：1）膜蛋白的完全溶解；2）富集糖肽而非糖蛋白，以避免使用固相捕获基质时可能产生的空间位阻；3）利用肼化学法在糖肽与捕获基质之间形成共价键，使结合的糖肽能够耐受严格洗涤，从而实现高糖选择性；4）整个捕获过程可在单管中完成，减少样品损失并缩短操作时间。在将该方法应用于多种生物样品（包括细胞和组织）的研究后，我们观察到对糖蛋白具有高选择性（> 90%）8,17,18。
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方案
1. 收集膜
- 将低渗缓冲液（10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, pH 8.0）加入细胞沉淀（约108个细胞）中，并在冰上孵育15-30分钟。通过注射器针头反复吹打（5-10次）或使用Dounce匀浆器匀浆（15-30次）裂解细胞。使用血细胞计数板和台盼蓝染色检测裂解效率。
- 通过差速离心法从裂解物中获取微粒体组分：先在3,000 g条件下离心15分钟，随后在100,000 g条件下离心2小时。第一次离心所得沉淀为细胞核组分，将上清液进一步离心后获得的第二次沉淀即为微粒体组分，其中包含质膜及膜结合细胞器8。最终的上清液为胞质组分。将微粒体组分储存于-80 °C冰箱中，以供后续分析使用。
2. 溶解、变性及消化膜蛋白
- 将微粒体组分溶解于变性缓冲液（40 mM Tris，10 mM EDTA，10 mM TCEP，0.5% Rapigest，pH 8）中，然后在100 °C孵育10分钟。
- 将加热后的溶液冷却至室温，加入超纯尿素粉末至终浓度为8 M，于37 °C孵育30分钟。
- 向样品中加入碘乙酰胺贮存液，使其终浓度为15 mM，在室温下避光孵育30分钟，以烷基化样品中的游离巯基。随后向样品中加入DTT贮存液，使其终浓度为10 mM，在室温下继续孵育10分钟，以淬灭过量的碘乙酰胺。
- 将所得溶液稀释10倍 用 pH 8 的 40 mM Tris 缓冲液重悬样品，随后按胰蛋白酶与总蛋白 1:20 的比例加入胰蛋白酶。将消化反应置于 37 °C 培养箱中过夜，以确保反应完全。
- 用 HCl 将样品溶液酸化至 pH 1 以终止消化，此条件同时可降解去垢剂。 即 Rapigest。在37 °C下孵育1小时以降解Rapigest，然后通过离心去除生成的沉淀。
- 使用C-18固相萃取（SPE）小柱纯化含有样本肽的上清液，并通过真空离心浓缩仪将所得样本干燥。
- 对胰蛋白酶消化前后的样品进行SDS-PAGE分析，以确认消化效率。
3. 糖肽富集
- 将清洗后的肽段溶解于偶联缓冲液（100 mM 醋酸钠，pH 5.5）中。在避光、室温条件下，向肽段溶液中加入高碘酸钠，使其终浓度为 10 mM，反应 30 分钟。此步骤可将糖链中的顺式二醇基团氧化为醛基，从而使糖链可通过肼化学与树脂偶联。加入亚硫酸钠至终浓度 20 mM，并调节 pH 至 5，室温反应 10 分钟，以淬灭过量的高碘酸盐。
- 将酰肼衍生化树脂以1:4（树脂与溶液）的比例加入肽溶液中，使糖肽与树脂偶联。在37 °C下孵育反应体系1-2天，并进行末端旋转混匀，以确保完全偶联。
- 用以下每种1 ml溶液各洗涤树脂两次，以去除未结合的肽：去离子水 水、1.5 M NaCl、甲醇和80%乙腈。最后，用以下溶剂将树脂洗涤3次 用1 ml 100 mM NH4HCO3 在 pH 8 条件下进行缓冲液置换，使体系缓冲液变为 100 mM NH4HCO3.
- 收集上清液和洗涤液，用于分析未结合的肽段（可选）。
- 在37 °C下用PNGase F对树脂中的N-糖肽进行过夜孵育，并以端对端旋转方式释放N-糖肽。通过离心收集释放的肽段，并用80%乙腈洗涤。将所得溶液在真空浓缩仪中干燥，用于LC-MS分析。
4. 进一步分级分离（可选）
为进一步简化样品复杂性，对获得的N-糖肽进行分级分离。例如，将干燥的肽重新溶解于含20%乙腈的pH 3、10 mM甲酸铵缓冲液中，使用强 阳离子 交换（SCX）色谱法对肽进行分级分离。将所得洗脱液干燥后，通过反相液相色谱-质谱（LC-MS）分析获得的肽段组分8,17,18。
5. 释放的N-糖肽的纯化（可选）
如果担心肽段可能存在污染，可将干燥的肽段重新溶解于0.1%甲酸中，并使用MCX SPE柱在反相液相色谱-质谱分析前进一步纯化肽段。
注意：数据库搜索参数。
在选择性切割N-糖肽使其从树脂上释放的过程中，PNGase F会将与天冬酰胺相连的N-糖链转化为天冬氨酸。因此，释放出的N-糖肽会发生0.9840 Da的质量偏移。为了准确鉴定这些肽段，需在搜索参数中添加该修饰，同时加入半胱氨酸的羧甲基化和甲硫氨酸的氧化等常见修饰。
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结果
实验流程的代表性流程图见图1。标记及进一步分级步骤为可选步骤，相关细节已在近期一篇文献中描述18。另一种选择是分析未修饰的肽段，即未与树脂发生反应的肽段。分析未修饰肽段的优势包括可能鉴定出非糖基化肽段和蛋白质，例如紧密连接中的claudin蛋白；另一个优势是可实现更准确的定量。基于这些优势，我们将该方法命名为glycocapture-assisted-global quantitative proteomics（gagQP），并在近期的出版物中详细阐述了该分析方法18。
采用富集方法后获得的典型糖肽质谱图如图2所示。在获得的糖肽中，N-糖链已被去除，糖链连接的天冬酰胺（N）经PNGase F酶解转化为天冬氨酸（D）；因此，该质谱图可直接使用任何蛋白质组学搜索引擎，在常用蛋白质序列数据库中进行检索。
在将捕获方法应用于复杂且珍贵的生物样本之前，可使用...
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讨论
本文介绍了一种用于分析细胞表面蛋白质的糖肽捕获策略。该方法可应用于研究分泌蛋白，例如血液中的蛋白，以及其他体液或细胞培养基中的蛋白。
该方法的成功依赖于样品的完全消化，因此有必要对消化效率进行SDS-PAGE表征，尤其是首次分析某一样品时。膜蛋白的完全消化具有挑战性，只有在膜组分被充分溶解后才可能实现。溶解过程始于去垢剂的加入，并在尿素孵育后完成。因此，如果样品在加入尿素前出现浑浊，但在尿素孵育后浑浊消失，则表明溶解充分。如果膜组分难以溶解，可增加去垢剂的用量。对于富含膜结构的组织样品（如脑组织和脂肪组织），可使用5% Rapigest。有时，在胰蛋白酶消化前的样品稀释过程中会出现沉淀，这种情况在人血清样品中更为常见。产生沉淀的主要原因是尿素和去垢剂浓度的降低。这种沉淀通常会在消化过程中被胰蛋白酶降解，一般无需担忧。然而，一旦形成沉淀，在消化步骤中必须旋转样品管以确保充分混匀。糖捕获步骤的pH值至关重要，因为肽段中的伯胺基团（如N端和赖氨酸残基）会在高碘酸盐氧化后与新形成的醛基发生反应。因此，必须使用乙酸盐缓冲液将捕获溶液的pH调节至6.0以下，使这些胺基质子化，从而防止其干扰捕获...
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披露
作者声明不存在任何竞争性财务利益。
致谢
本研究得到了西蒙弗雷泽大学启动资金的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| 碘乙酰胺 | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| 高碘酸钠 | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz 肼化凝胶 | Bio-Rad | 153-6047 | |
| 胰蛋白酶 | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 小柱 | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX 小柱 | Waters | 186000252 | |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | P8340 | |
| 尿素 | Amersco | 568 | |
| 亚硫酸钠 | Caledon | 8360-1 | |
| 转化酶 | Sigma | I0408 | |
| α-1 胰蛋白酶 | Sigma | F2006 | |
| 核糖核酸酶 B | Sigma | R7884 | |
| 亲和素 | Sigma | A9275 | |
| 卵白蛋白 | Sigma | A5503 | |
| 伴清蛋白 | Sigma | C0755 |
参考文献
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