激光诱导击穿光谱：一种用于组织中纳米颗粒成像与定量的新方法

摘要

在薄层器官和肿瘤组织上进行的激光诱导击穿光谱成功检测到了天然元素以及人工注入的钆（Gd），后者来源于基于钆的纳米颗粒。化学元素成像的空间分辨率达到100 μm，定量检测灵敏度达到亚毫摩尔浓度水平。该装置与标准光学显微镜的兼容性突显了其在同一生物组织上提供多种图像的潜力。

摘要

激光诱导等离子体发射光谱法应用于生物样品的元素分析。在啮齿类动物组织（肾脏和肿瘤）的薄切片上进行激光诱导击穿光谱（LIBS）分析，可检测到体内天然存在的无机元素，如（i）Na、Ca、Cu、Mg、P 和 Fe，以及在注射基于钆的纳米颗粒后检测到的元素，如（ii）Si 和 Gd。动物在实验结束后被实施安乐死 至24小时 静脉注射颗粒后，使用电动微米级三维载物台对样品进行二维扫描，使红外激光束以横向分辨率低于100的精度探测样品表面 μm. 获得了器官内钆元素的定量化学图像，检测灵敏度达到亚毫摩尔浓度水平。激光诱导击穿光谱法（LIBS）为研究无机材料的分布提供了一种简单且稳健的方法，无需进行特异性标记。此外，该装置与标准光学显微镜的兼容性突显了其潜力，可对同一样本生物组织获取多种响应类型的图像。 元素、分子或细胞。

引言

纳米颗粒在生物应用中的广泛应用推动了用于其在生物样品中定量和成像的分析技术的同步发展。通常，器官中纳米颗粒的检测与定位依赖于荧光或共聚焦显微镜技术。然而，这些方法需要使用近红外染料对纳米颗粒进行标记，而染料的疏水性可能改变纳米颗粒的生物分布，尤其是对于尺寸非常小的纳米颗粒。因此，标记后的纳米颗粒（特别是尺寸< 10 nm的纳米颗粒）的检测可能在整体动物、组织乃至细胞水平上干扰其生物分布。开发能够无需标记即可检测纳米颗粒的新设备，为研究其行为和动力学提供了新的可能性。此外，痕量元素（如铁和铜）在脑部疾病及神经退行性疾病（如阿尔茨海默病¹、门克斯病^2,3和威尔逊病⁴）中的作用，也提示了在组织中研究和定位这些元素的重要性。

已有多种技术被用于不同材料的元素分布图绘制或微区分析。在他们2006年发表的综述论文中，R. Lobinski 等 概述了生物环境中元素微分析可用的标准技术，生物环境是分析科学最具挑战性的研究对象之一⁵电子探针，即透射电子显微镜中的能量色散X射线微区分析，若元素浓度足够，可应用于多种研究>100–1,000 μg/g）。为了达到更低的检测限，已采用以下技术：

• 利用粒子诱发X射线发射的离子束显微探针 μ-PIXE (1–10 μg/g)⁶
• 同步辐射显微分析 μ-SXRF (0....

方案

1. 生物样本制备

本研究中描述的所有实验均经法国里昂动物护理与使用委员会（CECCAPP，法国里昂）批准（许可号：LYONSUD_2012_004），实验在授权人员（L. Sancey，DDPP 授权号：38 05 32）的监督下进行。

1. 加入1 ml H₂O 至 100 µmol 钆（Gd）基纳米颗粒，静置15分钟，加入20 µl 50 mM HEPES， NaCl 1.325 M CaCl₂ 20 mM 至 100 µl 的 H₂O 和 80 µl 钆基纳米颗粒的初级溶液，以获得 200 µl 浓度为 40 mM 的即用型注射溶液（地点：Villeurbanne，实验室）。
2. 静脉注射200 µl钆基纳米颗粒溶液 进入麻醉的荷瘤啮齿类动物体内（城市：里昂南区（乌兰），距离实验室15公里）
3. 注射后1-24小时处死小鼠，将生物样本置于液氮冷却的异戊烷中。于-80 °C保存样本（地点：里昂南区（乌兰），距实验室15公里）。
4. 将样本（通常来自格勒诺布尔市，距实验室100公里；我将尝试使用里昂南部的设备）切成100 µm厚的切片，并将生物切片置于专用塑料培养皿（Petri dish）中。于-80 °C保存。
   注意：塑料培养皿本质上是一种纯度很高的聚合....

结果

如图1所示，波长为1,064 nm的Nd:YAG激光器基频光束通过焦距为50 mm的石英透镜垂直聚焦到组织切片上。脉冲能量为4 mJ，重复频率为10 Hz。为避免空气中产生等离子体，激光束聚焦于样品表面下方约100 µm处。在此条件下未观察到空气等离子体。实验过程中，通过步进电机移动样品，使每次激光脉冲仅在样品的单一位置产生一次等离子体（单脉冲）。对基底上形成的凹坑进行显微观察，结果显示凹坑直径小于50 µm。所产生的等离子体通过一组透镜成像至一根光纤的入射端，该光纤连接至一台配备每毫米1,200条刻线（闪耀波长300 nm）光栅的切尔尼-特纳光谱仪。在光谱仪的输出焦平面上安装一个ICCD相机以记录光谱。测量过程中，利用三角测量法监测样品表面高度（相对于激光焦点位置）：将一束低功率连续波激光二极管以倾斜角度照射样品表面，并通过CCD监控相机进行观测。ICCD由激光Q开关触发，延迟和门宽参数分别设定为400 nsec和2 µsec。在进行 Mapping 测量时，每次激光脉冲后样品移动100 µm的偏移量。每次激光脉冲记录一条光谱。在LabVIEW环境中开发的自主软件控制整套设备，实现对组织样品感兴趣区域.......

讨论

应用于生物样品时，该技术可实现化学成像， 即 对注射的基于钆的纳米颗粒在不同器官中的钆（Gd）和硅（Si）进行定位与定量分析。在主要关键参数中，激光特性（波长、脉冲能量、聚焦和稳定性）的控制对于实现精确而精细的组织消融至关重要（即 空间分辨率和灵敏度。高能量工作可提供更好的灵敏度，但会降低空间分辨率。此外，必须仔细选择所使用的光谱仪类型。通常情况下，宽带检测（例如使用埃歇尔光谱仪）可实现多种元素的选择，但灵敏度较低；而使用切尔尼-特纳光谱仪（配备ICCD或PMT）则可检测的元素种类较少，但灵敏度显著更高。所选的探测波长范围及其各项参数设置均应根据具体研究目的进行调整。

关于生物样本本身，其厚度和硬度也可能影响质谱信号的质量。若样本过薄，会完全被喷雾化，导致样本载体也被激光脉冲攻击；而若样本过厚，则可能因其内部结构的不均一性，导致喷雾物质数量的不均一（如大血管的存在） 等等。）。根据元素分析，可预判支撑材料的选择；例如，若研究的元素为 Si，则样品应置于纯塑料上，而应避免使用玻璃，因为玻璃含有大量 Si。同样，样品的制备和固定需在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
纳秒激光器 Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 纳秒脉冲宽度，波长 1,064 nm
光谱仪	Andor Technology	Shamrock 303	配备 1,200 线/毫米、闪耀波长 300 nm 的光栅
ICCD 探测器	Andor Technology	Istar	时间分辨率为 2 纳秒
LIBS 装置	ILM		自制仪器
基于钆的纳米颗粒	Nano-H		颗粒
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	用于颗粒稀释
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	用于颗粒稀释
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	用于颗粒稀释
小鼠	Charles River	根据动物繁殖情况而定
异氟烷	Coveto / Virbac		用于麻醉 — Isofluranum
异戊烷	Sigma-Aldrich	59060	用于缓慢冷冻样品
液氮	Air Liquide		用于冷却异戊烷
冷冻切片机	Leica	CM-3050S	用于切片样品
培养皿	Dutscher	353004	用于固定样品