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激光诱导击穿光谱：一种用于组织中纳米颗粒成像与定量的新方法

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DOI：

10.3791/51353

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2014年6月18日

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1ILM-FENNEC UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 2ILM-PUBLI UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1, 3ILM-SOPRANO UMR 5306, CNRS - Université Lyon 1

本文内容

摘要

在薄层器官和肿瘤组织上进行的激光诱导击穿光谱成功检测到了天然元素以及人工注入的钆（Gd），后者来源于基于钆的纳米颗粒。化学元素成像的空间分辨率达到100 μm，定量检测灵敏度达到亚毫摩尔浓度水平。该装置与标准光学显微镜的兼容性突显了其在同一生物组织上提供多种图像的潜力。

摘要

激光诱导等离子体发射光谱法应用于生物样品的元素分析。在啮齿类动物组织（肾脏和肿瘤）的薄切片上进行激光诱导击穿光谱（LIBS）分析，可检测到体内天然存在的无机元素，如（i）Na、Ca、Cu、Mg、P 和 Fe，以及在注射基于钆的纳米颗粒后检测到的元素，如（ii）Si 和 Gd。动物在实验结束后被实施安乐死 至24小时 静脉注射颗粒后，使用电动微米级三维载物台对样品进行二维扫描，使红外激光束以横向分辨率低于100的精度探测样品表面 μm. 获得了器官内钆元素的定量化学图像，检测灵敏度达到亚毫摩尔浓度水平。激光诱导击穿光谱法（LIBS）为研究无机材料的分布提供了一种简单且稳健的方法，无需进行特异性标记。此外，该装置与标准光学显微镜的兼容性突显了其潜力，可对同一样本生物组织获取多种响应类型的图像。 元素、分子或细胞。

引言

纳米颗粒在生物应用中的广泛应用推动了用于其在生物样品中定量和成像的分析技术的同步发展。通常，器官中纳米颗粒的检测与定位依赖于荧光或共聚焦显微镜技术。然而，这些方法需要使用近红外染料对纳米颗粒进行标记，而染料的疏水性可能改变纳米颗粒的生物分布，尤其是对于尺寸非常小的纳米颗粒。因此，标记后的纳米颗粒（特别是尺寸< 10 nm的纳米颗粒）的检测可能在整体动物、组织乃至细胞水平上干扰其生物分布。开发能够无需标记即可检测纳米颗粒的新设备，为研究其行为和动力学提供了新的可能性。此外，痕量元素（如铁和铜）在脑部疾病及神经退行性疾病（如阿尔茨海默病1、门克斯病2,3和威尔逊病4）中的作用，也提示了在组织中研究和定位这些元素的重要性。

已有多种技术被用于不同材料的元素分布图绘制或微区分析。在他们2006年发表的综述论文中，R. Lobinski 等 概述了生物环境中元素微分析可用的标准技术，生物环境是分析科学最具挑战性的研究对象之一5电子探针，即透射电子显微镜中的能量色散X射线微区分析，若元素浓度足够，可应用于多种研究>100–1,000 μg/g）。为了达到更低的检测限，已采用以下技术：

  • 利用粒子诱发X射线发射的离子束显微探针 μ-PIXE (1–10 μg/g)6
  • 同步辐射显微分析 μ-SXRF (0.1–1 μg/g)7
  • 二次离子质谱法 SIMS (0.1 μg/g)8
  • 激光剥蚀电感耦合等离子体质谱法 LA-ICP-MS (低至 0.01 μg/g)9,10

上述技术可提供微米级分辨率，如 Lobinski et al. 提取的表1所示。

对连续二维图像进行三维重建也可用于深部组织的重构11。然而，所有设备和系统均需要专业技术人员、中等到高成本的仪器，以及耗时较长的实验（通常对于µ-SXRF为100 µm × 100 µm、LA-ICP-MS为10 mm × 10 mm的区域，需耗时超过4小时 ）12。总体而言，这些要求使得元素微区分析技术的应用受到极大限制，且无法与常规光学成像系统、荧光显微镜或非线性显微镜兼容。另一个需要指出的问题是，目前定量测量能力仍然较为有限，且依赖于基体匹配的实验室标准物质的可获得性。元素微区分析在工业流程、地质学、生物学及其他应用领域的进一步推广，将带来重大的概念和技术突破。

本文旨在提出一种利用完全兼容常规光学显微镜的台式仪器，实现生物组织中元素定量成像（或元素微区分析）的解决方案。本方法基于激光诱导击穿光谱技术（LIBS 技术）。在 LIBS 中，将一束激光脉冲聚焦于待测样品表面，使材料发生击穿并产生火花。随后通过光谱仪分析等离子体发射的原子辐射，并结合预先进行的校准测量，即可获得各元素的浓度信息13,14。LIBS 技术的优点包括高灵敏度（几乎所有元素均可达到 µg/g 级别）、设备紧凑、样品前处理极为简单、无需与样品接触、响应迅速，以及可实现精确位置的（微区）表面分析。然而，将该技术应用于组织化学成像仍具挑战性，因为必须精确控制组织的激光烧蚀过程，以同时实现高空间分辨率的成像和 µg/g 级别的检测灵敏度15,16。

使用该方法无需添加示踪剂或标记试剂，可直接在生物组织的原始环境中检测无机元素。本实验室开发的激光诱导击穿光谱（LIBS）仪器空间分辨率优于100 µm，对钆（Gd）的检测灵敏度估计低于35 µg/g，相当于0.1 mM 16，可实现对大样本的成像 mapping>1 cm230分钟内完成。此外，自制软件有助于数据的采集与分析。该仪器用于检测、定位和定量分析基于钆（Gd）的纳米颗粒在组织中的分布17-18 在小型动物的肾脏和肿瘤样本中，1至24小时 静脉注射颗粒后（大小 <5 nm）。生物组织中固有的无机元素，如 Fe、Ca、Na 和 P，也已被检测并成像。

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方案

1. 生物样本制备

本研究中描述的所有实验均经法国里昂动物护理与使用委员会（CECCAPP，法国里昂）批准（许可号：LYONSUD_2012_004），实验在授权人员（L. Sancey，DDPP 授权号：38 05 32）的监督下进行。

  1. 加入1 ml H2O 至 100 µmol 钆（Gd）基纳米颗粒，静置15分钟，加入20 µl 50 mM HEPES， NaCl 1.325 M CaCl2 20 mM 至 100 µl 的 H2O 和 80 µl 钆基纳米颗粒的初级溶液，以获得 200 µl 浓度为 40 mM 的即用型注射溶液（地点：Villeurbanne，实验室）。
  2. 静脉注射200 µl钆基纳米颗粒溶液 进入麻醉的荷瘤啮齿类动物体内（城市：里昂南区（乌兰），距离实验室15公里）
  3. 注射后1-24小时处死小鼠，将生物样本置于液氮冷却的异戊烷中。于-80 °C保存样本（地点：里昂南区（乌兰），距实验室15公里）。
  4. 将样本（通常来自格勒诺布尔市，距实验室100公里；我将尝试使用里昂南部的设备）切成100 µm厚的切片，并将生物切片置于专用塑料培养皿（Petri dish）中。于-80 °C保存。
    注意：塑料培养皿本质上是一种纯度很高的聚合物样品，用于避免组织中所含元素的干扰。

2. 校准样品的制备

  1. 准备含有不同浓度钆（Gd）基纳米颗粒的水溶液小瓶（0 nM、100 nM、500 nM、1 µM、5 µM、10 µM、50 µM、100 µM、500 µM、1 mM 和 5 mM）。
  2. 在培养皿上以 3 mm 间隔均匀放置每种溶液 5 µl 的液滴。
  3. 室温下干燥 20 分钟。

3. LIBS 实验

  1. 初始化 LIBS 装置
    1. 激光器设置。开启仪器后，等待 10–20 分钟，使激光脉冲能量稳定，并将 ICCD 相机冷却至 -20 °C。使用衰减器调节脉冲能量。
      注意：用于组织成像的最优激光参数为 5 nsec 脉冲持续时间、1,064 nm 波长，以及约 4 mJ 的脉冲能量。所用激光器为典型的 Nd:YAG 纳秒激光器。
    2. LIBS 设置。调节激光聚焦位置（相对于样品表面），以获得最小的凹坑直径（约 50 µm 或更小）。
      注意：这对应于激光脉冲聚焦在样品表面下方 100 µm 处。
    3. 光谱仪设置。使用配备 1,200 线/mm 光栅和高时间分辨率 ICCD 相机的切尔尼-特纳光谱仪。通过计算机控制所有这些设备。将入射狭缝值设为 40 µm。根据待分析元素设定光谱范围。使用覆盖 325 至 355 nm 的光谱范围，以高灵敏度检测 Gd，以及 Na、Cu 和 Ca。将 ICCD 参数设置为延迟 300 nsec、门宽 2 µsec、增益 200。
  2. 成像测量
    1. 将生物样品放置在 LIBS 电动样品台上。
    2. 根据激光聚焦位置调节样品高度。
    3. 拍摄样品切片的高分辨率照片。
    4. 设置 LIBS 采集软件中的成像模块，通常以约 100 µm 的分辨率，进行包含 100 × 100 个测量点的成像扫描。
    5. 开始采集。此后所有步骤自动进行，包括移动序列、光谱记录与保存。完成 10,000 个点的成像（相当于分辨率为 100 µm 时的 1 cm2 ）需要 40 分钟。将所有记录的光谱整合到同一个文件中。
    6. 完成后，再次拍摄样品切片的照片
  3. 校准测量

在相同的实验参数下，测量校准样品（制备细节见第2节）。在每个校准液滴中，进行映射或记录25个光谱（来自液滴中心区域的测量位点）。

4. LIBS 光谱分析：化学成像的构建

  1. 记录组织成像的所有激光诱导击穿光谱（LIBS）数据，并将其载入LIBS软件进行分析。对每条光谱进行基线校正，并使用伪彩色以相对强度尺度构建化学图像。
    注意：算法可提取特定谱线强度，例如钆（Gd）、铜（Cu）、钠（Na）或钙（Ca）。
  2. 对从校准样品测得的光谱执行相同操作，以获得校准曲线（强度与浓度之间的关系），并构建钆（Gd）或其他目标元素的定量分布图或图像。
  3. 对化学图像进行适当的处理，例如插值或平滑。将强度或浓度分布图以图像格式（位图）保存。

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结果

如图1所示，波长为1,064 nm的Nd:YAG激光器基频光束通过焦距为50 mm的石英透镜垂直聚焦到组织切片上。脉冲能量为4 mJ，重复频率为10 Hz。为避免空气中产生等离子体，激光束聚焦于样品表面下方约100 µm处。在此条件下未观察到空气等离子体。实验过程中，通过步进电机移动样品，使每次激光脉冲仅在样品的单一位置产生一次等离子体（单脉冲）。对基底上形成的凹坑进行显微观察，结果显示凹坑直径小于50 µm。所产生的等离子体通过一组透镜成像至一根光纤的入射端，该光纤连接至一台配备每毫米1,200条刻线（闪耀波长300 nm）光栅的切尔尼-特纳光谱仪。在光谱仪的输出焦平面上安装一个ICCD相机以记录光谱。测量过程中，利用三角测量法监测样品表面高度（相对于激光焦点位置）：将一束低功率连续波激光二极管以倾斜角度照射样品表面，并通过CCD监控相机进行观测。ICCD由激光Q开关触发，延迟和门宽参数分别设定为400 nsec和2 µsec。在进行 Mapping 测量时，每次激光脉冲后样品移动100 µm的偏移量。每次激光脉冲记录一条光谱。在LabVIEW环境中开发的自主软件控制整套设备，实现对组织样品感兴趣区域...

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讨论

应用于生物样品时，该技术可实现化学成像， 即 对注射的基于钆的纳米颗粒在不同器官中的钆（Gd）和硅（Si）进行定位与定量分析。在主要关键参数中，激光特性（波长、脉冲能量、聚焦和稳定性）的控制对于实现精确而精细的组织消融至关重要（即 空间分辨率和灵敏度。高能量工作可提供更好的灵敏度，但会降低空间分辨率。此外，必须仔细选择所使用的光谱仪类型。通常情况下，宽带检测（例如使用埃歇尔光谱仪）可实现多种元素的选择，但灵敏度较低；而使用切尔尼-特纳光谱仪（配备ICCD或PMT）则可检测的元素种类较少，但灵敏度显著更高。所选的探测波长范围及其各项参数设置均应根据具体研究目的进行调整。

关于生物样本本身，其厚度和硬度也可能影响质谱信号的质量。若样本过薄，会完全被喷雾化，导致样本载体也被激光脉冲攻击；而若样本过厚，则可能因其内部结构的不均一性，导致喷雾物质数量的不均一（如大血管的存在） 等等。）。根据元素分析，可预判支撑材料的选择；例如，若研究的元素为 Si，则样品应置于纯塑料上，而应避免使用玻璃，因为玻璃含有大量 Si。同样，样品的制备和固定需在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢 Labex-Imust 提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
纳秒激光器 Nd:YAGQuantelBrillant5 纳秒脉冲宽度，波长 1,064 nm
光谱仪Andor TechnologyShamrock 303配备 1,200 线/毫米、闪耀波长 300 nm 的光栅
ICCD 探测器Andor TechnologyIstar时间分辨率为 2 纳秒
LIBS 装置ILM自制仪器
基于钆的纳米颗粒Nano-H颗粒
HEPESSigma-AldrichH4034用于颗粒稀释
CaCl2Sigma-Aldrich21108用于颗粒稀释
NaClSigma-AldrichS5886用于颗粒稀释
小鼠Charles River根据动物繁殖情况而定
异氟烷Coveto / Virbac用于麻醉 — Isofluranum
异戊烷Sigma-Aldrich59060用于缓慢冷冻样品 
液氮Air Liquide用于冷却异戊烷
冷冻切片机LeicaCM-3050S用于切片样品
培养皿Dutscher353004用于固定样品

参考文献

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