使用α-银环蛇毒素结合位点标签研究GABA A受体的膜定位与转运

摘要

本文展示了使用荧光Alexa染料标记的α-银环蛇毒素来检测海马神经元中GABA A受体在细胞表面的定位及其内吞作用。通过使用带有可结合α-银环蛇毒素的短细胞外标签的构建体，可实现对质膜蛋白内吞运输过程的分析。

摘要

越来越多的证据表明，神经递质受体（包括离子型 γ-氨基丁酸 A 受体（GABAAR））表现出高度动态的转运和细胞表面移动性^1-7。为了研究受体在细胞表面的定位和内吞作用，本文所述技术结合使用荧光标记的α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）与表达含α-银环蛇毒素（Bgt）结合位点（BBS）构建体的细胞。该BBS序列（WRYYESSLEPYPD）基于肌肉型烟碱性乙酰胆碱受体的α亚基，可高亲和力地结合Bgt^8,9。引入BBS位点后，可通过外源性荧光Bgt的应用来实现受体在细胞表面的定位，并检测受体的插入或移除，此前已在GABAA受体和代谢型GABAB受体的追踪研究中应用此方法^2,10。除BBS位点外，我们还通过标准分子生物学与PCR克隆策略，在成熟GABAAR亚基第4和第5个氨基酸之间插入了一个pH敏感型绿色荧光蛋白（pHGFP¹¹）（见图1）¹²。BBS位于pH敏感型GFP报告基因的3'端，两者之间由一段含13个氨基酸的丙氨酸/脯氨酸连接肽隔开。在本研究中基于固定样本的转运实验中，pHGFP可作为总标记GABAAR亚基蛋白水平的报告分子，使Bgt标记的受体群体可相对于总受体群体进行归一化处理，从而最小化因不同细胞中标签标记的GABAAR亚基基础表达水平高低不一所导致的Bgt染色信号差异。此外，pHGFP标签还可便于在活细胞或固定样本的成像实验中快速识别出表达该构建体的细胞。

引言

利用荧光标记的α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）研究受体定位与动态特性的方法最初应用于其内源性靶点——烟碱型乙酰胆碱受体的研究中^13-15。随后，该方法通过引入最小Bgt结合肽（BBS），被广泛用于兴奋性和抑制性配体门控离子通道以及G蛋白偶联受体的转运研究^2,10,16-21。基于BBS的技术相较于其他用于转运研究的方法具有多项优势，例如细胞表面生物素化、利用针对细胞外表位的抗体对活细胞进行标记，以及光漂白后荧光恢复（FRAP）等技术。在细胞表面生物素化过程中，游离胺基会发生共价修饰，可能影响细胞活性；基于抗体的研究常受到表面抗原聚集或帽状分布的限制，这可能改变转运过程；而FRAP实验由于涉及光漂白步骤，一个重要顾虑是可能损伤细胞内部结构。此外，BBS标记的构建体还可与生物素偶联的银环蛇毒素结合，用于生化方法检测受体转运，进一步拓展了该技术的应用价值。该技术可广泛适用于细胞系和原代细胞。对于表达烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）的细胞，在整个实验流程中必须按照说明使用nAChR拮抗剂筒箭毒碱（tubocurarine）。在未转染的细胞中，在不添加筒箭毒碱的情况下进行简单的表面Bgt标记（相当于内吞实验中T=0时间点），可作为内源性nAChR存在的证据。

使用该技术时需考虑的一个重要因素是 BBS 的适当插入位置，以确保目的蛋白被递送至质膜时，BBS 位于细胞外区域。例如，GABAAR 亚基的 N 末端结构域在运输过程中位于囊泡腔内，当受体插入质膜后则转变为胞外区域，从而可实现对细胞表面受体的特异性标记，并评估内吞事件介导的受体从细胞表面的移除。我们先前已证实，在 GABAAR 亚基的该结构域上添加 GFP、myc 或 BBS 表位不会影响其功能。应进行标准对照实验，以确保标记蛋白的表达水平与未标记构建体相似，定位正确，且不影响受体功能。对转染构建体的这一表征 也将有助于解决过表达相关问题。

方案

以下所述所有方案均符合匹兹堡大学医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）及机构审查委员会（IRB）的规定。

1. 在组织培养罩中制备海马神经元培养物

注意：整个实验方案中均需使用无菌技术和无菌试剂 1.

1. 制备聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml，溶于H₂以O型涂层玻璃盖玻片作为神经元培养的基质。
   1. 在每个3.5 cm培养皿中放入4-5片圆形玻璃盖玻片 厘米组织培养皿
   2. 70号点样位 μ将聚-D-赖氨酸涂布于每个12 毫米盖玻片。注意：对于活体成像，可使用玻璃底的3.5厘米组织培养皿（点样200 μ将聚-D-赖氨酸涂覆于嵌入的14 毫米玻璃盖玻片
   3. 将制备好的培养皿放置于组织培养罩内过夜。为减少多聚-D-赖氨酸的蒸发并保持组织培养罩内表面无菌，需关闭罩窗并关闭吹风机过夜。注意：过夜孵育期间不使用紫外灯。
   4. 次日早晨，用 2 ml H 洗涤培养皿 3 次₂O.
   5. 去除最后一个H后₂O洗涤，向每个3.5 cm 培养皿，并将培养皿置于培养箱中孵育，直至准备进行步骤 1.4 的神经元接种。
2. 海马神经元取自胚胎第18-19天（E18-19）的大鼠（改良自 Goslin²²).
3. 在培养当天，将1-4转染至新分离的神经元 μ微克级大量制备的构建体DNA。
   注：通常为3 μ将 g 级别的 DNA 转染至 100–200 万神经元中，细胞存活率为 50%，转染效率为 60%（例如 从200万个神经元开始：((2 x 10⁶ 神经元 x 0.5）0.6）可提供约100万个神经元，其中约60万个被转染¹在排查过表达潜在问题时，可转染不同量的构建体DNA，随后对构建体的定位和功能进行适当的表征。
4. 将转染后的神经元接种到聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上，终密度约为每3.5 cm² 200,000个神经元 cm 培养皿。注意：对于玻璃底培养皿，将 40,000–50,000 个神经元接种于 14 毫米玻璃区域。
5. 更换培养基，4-24 小时 神经元培养制备完成后，将神经元置于培养箱中培养至第14-17天 体外 （体外培养天数）或目标阶段。

2. 胞吞作用检测

注意：关于α-银环蛇毒素和筒箭毒碱的废弃物处理与操作注意事项：

1. 建议在生物安全二级（BL-2）研究规程的指导下操作所有肽类神经毒素。必须穿戴适当的个人防护装备。冻干毒素粉末应按照生产商说明书进行重悬。毒素废弃物应根据所在机构的环境健康与安全指南进行处理。
2. 为去除在储存过程中可能形成的肽类聚集体，使用前应对α-银环蛇毒素（α-bungarotoxin）分装样品进行短暂离心，并取上清液用于实验。
3. α-银环蛇毒素（Bgt）储备液用无菌H₂O 重悬至浓度为1 mg/ml，分装为10 μl每份，于-20 °C保存。荧光标记的Bgt储备液使用浓度为3 μg/ml。筒箭毒碱（Tubocurarine）的终浓度为150 μM。

1. 在冷室中将台式加热块设置为 16 °C，并在其顶部放置薄铝板或不锈钢板。或者，如果有条件，可使用台式冷却/加热装置完成每个需要 16 °C 的步骤。
2. 将细胞外 HEPES 缓冲盐溶液（HBS，成分（单位：mM）：135 NaCl、4.7 KCl、10 HEPES、11 葡萄糖、1.2 MgCl₂ 和 2.5 CaCl₂，pH 7.4）在水浴中冷却至 16 °C。
3. 将神经元培养皿转移至 16 °C 的铝板上，冷却 5 分钟。
4. 移除培养基（保留条件培养基并置于培养箱中，用于步骤 2.8 的内吞实验时间点），并加入 1 ml 16 °C 的 HBS + 箭毒（150 μM），孵育 2 分钟。
5. 移除 HBS + 箭毒，更换为 1 ml 16 °C 的 HBS + 箭毒（150 μM）+ α-银环蛇毒素 Alexa 594 [3 μg/ml]，在 16 °C 下孵育 15 分钟。
6. 移除 HBS + 箭毒 + α-银环蛇毒素 Alexa 594 至标记的废液容器中，并用 2 ml 16 °C 的 HBS 洗涤培养皿 3 次（洗涤液可通过真空抽滤收集至含有 50 ml 50% 漂白液的真空瓶中）。
7. 对于使用玻璃底 3.5 cm 培养皿进行的受体内吞活细胞成像时间序列实验，执行步骤 2.1–2.6 后，将培养皿转移至显微镜的加热载物台（帕尔贴装置）上，并使用共聚焦或全内反射荧光（TIRF）显微镜系统开始成像。
8. 将 T = 0 时间点的盖玻片转移至含有室温（RT）4% 多聚甲醛 / 4% 蔗糖的培养皿中固定 20 分钟，同时继续将其他盖玻片进行至步骤 2.9。
9. 对于其他时间点，将 HBS 替换为已平衡的 37 °C 条件培养基（步骤 2.4 中保留的），并放回培养箱中在 37 °C 下进行内吞。注意：建议额外设置 T = 15、30 和 60 分钟的时间点。
10. 在所需时间点，从培养箱中取出培养皿，用 2 ml 室温 DPBS（无钙、镁的 DPBS）快速洗涤两次，然后在 4% 多聚甲醛 / 4% 蔗糖中固定 20 分钟。
11. 固定 20 分钟 后，将 4% 多聚甲醛 / 4% 蔗糖移至废液容器中，并用 2 ml 室温 DPBS 洗涤培养皿两次。
12. 在含有 0.2% Triton X-100 的免疫荧光封闭液（封闭液 = DPBS 中含 5% 马血清和 0.5% BSA）中室温孵育盖玻片 10 分钟，以通透神经元，便于对细胞内受体池进行抗-GFP 免疫染色和/或标记其他目标蛋白。
13. 移除含 0.2% Triton X-100 的封闭液，将盖玻片在不含 Triton X-100 的免疫荧光封闭液中室温孵育 20–30 分钟。
14. 在封闭液中进行一抗孵育，室温孵育数小时或 4 °C 过夜 。注意：盖玻片在 4 °C 过夜 孵育通常可获得更佳的免疫荧光结果。
15. 用 DPBS 洗涤盖玻片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。
16. 在封闭液中加入二抗，室温孵育盖玻片 1 小时。
17. 用 DPBS 洗涤盖玻片 3 次（每次洗涤 5 分钟）。
18. 逐个处理盖玻片进行封片：用实验纸巾吸去盖玻片背面多余液体，然后将其倒置在载玻片上 4 μl 封片介质中。
19. 将载玻片在室温下避光干燥 30 分钟，随后于 4 °C 保存，直至进行显微镜观察。
20. 使用共聚焦显微镜进行实验图像采集与分析（对实验条件设盲）。使用 60X 油镜 NA 1.49 浸油物镜，配备以下激光器：氩离子气体 488 nm、561 二极管、640 二极管。
    1. 使用相同的图像采集参数，获取神经元胞体及数个树突突起处于焦平面的单层 Z 轴图像。
    2. 对每个神经元的 3–4 个近端树突中 20 μm 长度范围内的 α-银环蛇毒素 Alexa 荧光信号和 GFP 免疫染色信号进行定量分析，所有内吞数据的分析使用相同的阈值。
    3. 对每个时间点的 10–12 个神经元进行数据分析，并使用多个独立的神经元培养重复实验。

结果

BBS标签构建体的表征包括若干重要对照，例如确定表达的蛋白是否正确组装（特别是由多个亚基组成的受体）、是否转运至细胞表面以及是否正确定位。抑制性突触由GABA A受体表面簇组成，这些受体簇与抑制性支架蛋白gephyrin共定位，并与突触前抑制性终末相对，后者可通过囊泡抑制性氨基酸转运体（VIAAT/VGAT）进行鉴定，该转运体负责将GABA和甘氨酸装载至突触囊泡中。如图所示 图2 表达 α2pHGFP+BBS 的神经元经 Bgt 标记表面 GABAAR 后，再使用抗 GFP 抗体对总受体群体进行免疫染色，并同时标记突触后抑制性支架蛋白 gephyrin（图2A）或 VIAAT（图 2B).

图3 显示了15天体外培养（DIV）海马神经元中含α2亚基的GABAA受体的内吞作用。各图中所示单个树突过程的Bgt荧光强度测量结果图3A通过GFP抗体染色对构建体表达水平进行归一化处理。如图所示，各时间点的最终比较通过归一化至...

讨论

本文所述基于BBS的固定和活细胞技术可用于追踪细胞系、神经元及其他原代细胞中受体或其他质膜蛋白的转运过程。该方法已成功用于研究配体门控离子通道和G蛋白偶联受体（GPCR）的膜插入与清除，并评估受体激动剂和调节剂存在时转运过程的变化。关键技术要点包括将标签准确定位于细胞外区域，以及进行对照实验，以确保BBS的添加（如同其他报告分子如GFP的标准操作）在功能上无干扰。对于表达烟碱型乙酰胆碱（nAChR）受体的细胞，在整个实验流程中必须按指示使用nAChR拮抗剂筒箭毒碱。若未使用额外的GFP标签，则可在固定和通透后，通过另一种荧光团偶联的α-银环蛇毒素染色来测定总BBS标记蛋白的水平。选择测定受体/目标蛋白内吞速率的时间点时，需结合对该受体/蛋白转运特性的现有认知，并在初期实验中设置较多的时间点进行探索。该技术也可方便地与常规免疫染色联合使用。我们还描述了一种通过活细胞共聚焦成像实验追踪受体内吞的替代方法。设备可用性、活细胞实验所需时间及其他实验限制条件将决定方法的选择，两种方法均为可行且已有文献报道。未来BBS技术的应用包括将活细胞或固定细胞成像与早期内体和溶酶体标记物结合，以追踪受体的命运，i.e. 受体向再循环内体的靶...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
P3 原代细胞 4D 试剂盒	Lonza	V4XP-3024
α-布加毒素，Alexa Fluor 647 标记物	Molecular Probes	B35450
α-布加毒素，Alexa Fluor 488 标记物	Molecular Probes	B13422
α-布加毒素，Alexa Fluor 594 标记物	Molecular Probes	B13423
(+)-筒箭毒碱氯化物	Tocris	2820
封片介质	DAKO	cS703
不含钙、镁的 DPBS	Invitrogen	14190-136
聚-D-赖氨酸	Sigma	P6407
突触后支架蛋白 gephyrin 抗体	Synaptic Systems	147 011	1:300
VIAAT/VGAT 抗体	Synaptic Systems	131 002	1:1,000
抗 GFP 抗体	Life Technologies	A6455	1:2,000
玻璃底组织培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C - Mattek 培养皿
盖玻片（圆形盖玻片），#1 厚度，12 mm	Warner Instruments	640-0702