促进微生物在造纸厂废液流中生长的方法及培养微生物降解潜力的表征

摘要

可收集并处理工业废弃物，以分析微生物的生长情况。木质纤维素提取技术可提供用于分析特定生物降解能力的组分。气相色谱-质谱联用技术可用于鉴定在制浆废料上培养的微生物的发酵产物。这些方法可用于确定微生物降解制浆废料的代谢能力。

摘要

硫酸盐法制浆工艺用于处理木片，以分离木质纤维素中的木质素和多糖，从而生产高质量纸浆。黑液是该工艺产生的制浆废液，具有进一步生物转化的潜力。然而，木质纤维素原料的顽抗性、构成黑液中大部分可利用有机碳的化学衍生物，以及其碱性pH值，均使其微生物降解面临挑战。针对黑液的收集与改性方法旨在利用此类制浆废料，将木质素、有机酸及多糖降解副产物转化为有价值的化学品。所介绍的木质纤维素提取技术为制备木质纤维素生长基质提供了可重复的方法，有助于理解培养微生物的代谢能力。采用气相色谱-质谱联用技术可鉴定并定量微生物在制浆废料上生长所产生的发酵产物。综合运用这些方法，有助于确定具有产生高价值发酵产物潜力的微生物的代谢活性，从而提升制浆系统的经济价值，减少废水排放，增加造纸厂的潜在利润，并拓展黑液的其他应用途径。

引言

木材制浆是一个化学过程密集型工艺，经过多年优化，已形成一个废物最少化的系统。然而，该工艺的某些副产物可用于生产更高价值的产品。黑液便是这样一个例子。它来源于硫酸盐法制浆工艺，该工艺是主流的化学制浆方法，占全球木质素产量的85%¹。硫酸盐法工艺（图1）利用高温（160–200 °C）、高压（120 psig）以及白液中的化学物质（氢氧化钠和硫化钠）将木质素从木材纤维中溶解出来^2,3。黑液中含有木质素、有机酸以及多糖降解副产物⁴。目前黑液通常在回收锅炉中焚烧，以产生蒸汽并回收化学品，为后续造纸和制浆过程提供热能。然而，制浆过程中产生的黑液量可能超过回收锅炉的有效处理能力。将黑液作为废水排放会对水生植物和动物产生负面影响，因此不可行。若能利用可代谢黑液的微生物进行生长，将有助于提高化学品回收率，并生成高附加值产品，从而改善整个制浆系统的生命周期分析。已有研究成功通过化学和生物转化木质素衍生的单体，生产出香草醛和肉桂酸（用作食品甜味剂和香料添加剂）、用于塑料和树脂生产的苯酚，以及可用作燃料的环己烷⁵。

以往关于此类制浆废料生物降解的研究主要集中在木质素的解聚上。国际木质素协会（International Lignin Institute, ILI）报告指出，每年产生约4000万至5000万吨木质素（http://www.ili-lignin.com/aboutlignin.php）。其中仅有1.5%被用于商业化的工业过程⁶。由Phanerochaete和Trametes属白腐真菌产生的漆酶和过氧化物酶对木质素进行解聚的研究已十分深入⁷。已知能够降解芳香族化合物的土壤细菌，如Nocardia 和Rhodococcus⁸、Pseudomonas putida mt-2⁹以及Streptomyces viridosporus T7A¹⁰，也被证实具有降解木质素的能力。细菌降解制浆废料具有广阔前景，因为某些细菌能够在制浆废液所特有的高盐和强碱性（pH 10–14）环境中良好生长¹¹。尽管木质素是黑液的主要成分，但微生物也可能降解构成黑液的其他组分。这些技术并非专门用于鉴定仅能降解木质素的微生物，而是用于识别可直接应用于制浆废液黑液处理的微生物，而非其进一步加工后的组分。

通过中和及滤膜除菌处理收集并改造黑液，以促进微生物生长。利用一种新型木质纤维素提取方法所获得的组分，通过最小培养基生长实验，确定了一种环境微生物分离株的生长需求。采用气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）分析培养基，以明确该环境微生物分离株以黑液为唯一碳源时产生的代谢产物。上述技术的结合提供了一种评估工具，可用于判断微生物在以黑液等造纸厂废料为生长基质时的代谢能力。此类技术的应用还可揭示特定微生物在造纸厂废料处理中用于副产物生成的潜在价值。

方案

1. 黑液的收集及用于培养生长的黑液制备

1. 从硫酸盐蒸煮器连接的出口阀处采集黑液样品，装入无菌玻璃瓶中，并使其冷却至室温，然后进行以下步骤。
   中和
2. 将100 ml黑液样品加入装有搅拌子的500 ml烧杯中。
3. 将烧杯置于搅拌器上，调节搅拌速度至中等。
4. 缓慢滴加磷酸，直至黑液变得黏稠（黏度类似于甘油）。
5. 将全部黑液溶液缓慢分装至50 ml锥形管中，在9,300 × g条件下离心30分钟。
6. 将上清液转移至烧杯中，使用pH试纸测定pH值。沉淀的木质素沉淀物可丢弃，并作为非危险性固体废物处理。
7. 继续添加磷酸并对溶液进行离心，直至pH试纸显示上清液呈中性pH值。
   灭菌
8. 将溶液通过0.22 µm滤膜过滤，以去除任何污染的细菌，并将滤后溶液置于无菌容器中储存。于室温保存。

2. 木质纤维素提取

碳水化合物分离

1. 将5 g芒草、松木或百慕大草（研磨至1 mm或更小粒径）放入500 ml锥形瓶中。然后向瓶中加入200 ml蒸馏水或去离子水、7.5 g NaClO₂、2.5 ml冰醋酸 以及一个搅拌子。
2. 将锥形瓶置于置于搅拌器上的油浴中，80 °C条件下搅拌1小时。调节搅拌器速度至中等。
3. 向锥形瓶中再加入7.5 g NaClO₂ 和2.5 ml冰醋酸。继续在80 °C油浴中搅拌30分钟。
4. 重复上一步操作两次（注意：总共向含有木质纤维素生物质的锥形瓶中加入30 g NaClO₂和10 ml冰醋酸）。将溶液冷却至室温。
5. 将一张滤纸放入布氏漏斗中。将漏斗置于抽滤瓶上，并连接真空泵。
6. 缓慢将溶液倒入漏斗中。
7. 用100 ml蒸馏水或去离子水洗涤固体物质3次。洗涤完成后弃去滤液。
8. 保留1 g固体物质，并将其置于一张干净的滤纸上。
9. 将该固体物质在50 °C烘箱中过夜干燥。从烘箱中取出样品后，转移至标记为“综纤维素”的储存瓶中。
10. 将剩余的固体物质加入500 ml锥形瓶中的250 ml 10% NaOH（v/v）溶液中。用塞子密封瓶口。
11. 将溶液置于70 °C恒温摇床中，以250 rpm振荡反应1小时。
12. 在室温下冷却30分钟 。
13. 使用连接于抽滤瓶的滤纸和布氏漏斗回收固体物质。
14. 将固体物质转移至一张干净的滤纸上，放入50 °C烘箱中过夜干燥。
15. 待残渣完全干燥后，将其放入储存瓶中并标记为“纤维素”。
16. 将步骤2.13所得滤液转移至500 ml锥形瓶中，加入30 ml乙酸和250 ml异丙醇。盖紧瓶盖，将溶液在室温下静置于实验台至少8小时。
17. 将全部溶液转移至50 ml离心管中，在9,300 × g条件下离心30分钟。小心用移液器吸出上清液并弃去。
18. 通过涡旋振荡，用30 ml蒸馏水或去离子水重悬沉淀。
19. 重复步骤2.17–2.18共15次，以充分洗涤沉淀。
20. 去除上清液，保留沉淀用于冷冻干燥。冷冻干燥完成后，收集样品并放入标记为“半纤维素”的样品瓶中。
    木质素分离
    木质素分离方案基于Karaaslan et al.¹²
21. 将5 g芒草、松木或百慕大草（研磨至1 mm或更小粒径）加入500 ml含0.25 M NaOH和 30%乙醇的溶液中。将混合物置于75 °C恒温摇床中，以250 rpm振荡反应2小时。
22. 将溶液冷却至室温。
23. 在抽滤瓶上的布氏漏斗中放置一张滤纸。连接真空泵，缓慢将溶液倒入漏斗中。
24. 弃去固体物质。
25. 向含有滤液的锥形瓶中加入一个搅拌子，并将锥形瓶置于调至中等转速的搅拌器上。逐滴加入浓盐酸，直至溶液pH达到2.0（约20 ml）。
26. 将酸化后的溶液在室温下静置过夜。
27. 将溶液在锥形管中以9,300 × g离心30分钟 。小心用移液器吸出上清液并弃去。
28. 通过涡旋振荡，用30 ml蒸馏水或去离子水重悬沉淀。
29. 重复步骤2.27–2.28共15次，以充分洗涤沉淀。
30. 离心后，去除上清液，保留沉淀用于冷冻干燥。冷冻干燥完成后，将样品放入标记为“木质素”的样品瓶中。

3. 微生物生长培养物的制备

琼脂平板

1. 在倒平板前，向 M9 最小培养基琼脂中加入 0.2% (w/v) 的无菌木质纤维素提取产物¹³。
2. 用约 200 µl 在 M9 最小培养基中培养至 O.D. 约为 2.0 的细菌培养物划线接种已凝固的平板。
3. 在 37 °C 下培养平板，并监测菌落生长。
   液体培养
4. 向无菌的 125 ml 三角瓶中加入 50 ml 无菌 LB 培养基（Luria-Bertani 培养基）¹³ 或 M9 最小培养基¹³，再加入 10% (v/v) 的黑液或 0.2% (w/v) 的木质纤维素提取产物。
5. 以体积比 0.1% (v/v) 接种 O.D. 约为 2.0 的细菌培养物。
6. 在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养。
7. 在培养期间每 6 小时通过测定光密度（λ = 600 nm）评估一次生长情况。取 1 ml 培养液放入比色皿中，以未接种的培养基为空白对照测定培养液的光密度。
8. 在对数中期将细菌转移至厌氧血清瓶中。
   1. 厌氧血清瓶的准备：在有氧条件下用丁基橡胶塞和铝制压盖密封血清瓶，然后进行高压灭菌。灭菌后不得改变血清瓶内的顶空气体组成。
   2. 使用注射器将 125 ml 三角瓶中的全部 50 ml 培养液转移至已密封的无菌血清瓶中。
   3. 在 37 °C 下以 200 rpm 振荡培养。

4. 气相色谱-质谱样品制备

根据 Raj、Reddy 和 Chandra¹⁴ 的方法制备样品。用于对照的阴性对照组包含含 10% 黑液的 M9 最小培养基，也称为未接种样品。

1. 在培养450小时后，将未接种和已接种的细菌培养物（50 ml）在9,300 × g条件下离心30分钟 。
2. 将10 ml上清液转移至一支玻璃试管中。（注意：塑料材料与后续步骤中的化学试剂不兼容。）
3. 用浓盐酸将上清液酸化至pH 1–2。
4. 加入3倍体积的乙酸乙酯（30 ml），盖上试管盖，颠倒混匀4–6次。
5. 在一支洁净的玻璃试管中加入少量无水Na₂SO₄ （1–2 g）。
6. 用一次性玻璃巴斯德吸管小心吸取乙酸乙酯溶液中的有机层（上层）。
7. 将有机层转移至含有无水Na₂SO₄的试管中。
8. 通过轻轻敲击试管使其混合，利用无水Na₂SO₄对有机层进行脱水。逐步加入少量无水Na₂SO₄并混合，直至无明显大块结团。
9. 将一张滤纸放入布氏漏斗中，置于与真空泵相连的侧臂烧瓶上。
10. 将溶液倒入漏斗中。弃去固体残留物。
11. 将滤液转移至蒸发瓶中，并使用旋转蒸发仪蒸发溶剂。
12. 将3 mg乙酸乙酯提取残留物置于一支2 ml棕色色谱小瓶中。
13. 加入100 µl 1,4-二氧六环和10 µl吡啶，溶解残留物。
14. 加入50 µl含1%三甲基氯硅烷的N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺（BSTFA），然后在60 °C振荡孵育15分钟。
15. 将样品储存于4 °C，待用。

5. 气相色谱-质谱联用（GC-MS）

使用非极性毛细管柱，并以氦气为载气（流速为1 ml/min），配备与质谱仪（MS）联用的气相色谱仪（GC）。

1. 当 oven 温度在 50 °C 稳定后，以 1/50 的分流比进样 1 µl 样品。
2. 在 50 °C 下保持柱温 5 min ，然后以 5 °C/min 的速率升至 280 °C，最后在 280 °C 维持 20 min。
3. 保持气相色谱仪与质谱仪之间的传输线温度为 300 °C。
4. 设置溶剂延迟时间为 15 min。
5. 在电子能量为 70 eV 的条件下，记录 10–500 (m/z) 范围内的电子轰击电离质谱图。
6. 按上述方法对标准品进行衍生化和色谱分析，通过比对购买的标准品保留时间或美国国家标准与技术研究院（NIST）质谱数据库中的数据来鉴定化合物。

结果

收集和处理硫酸盐法制浆过程中产生的黑液（图1），可使研究者利用这种制浆废液评估单一细菌分离株或混合培养物的生物降解能力。图2展示了通过光密度测定的环境微生物分离株在LB培养基中单独培养，以及在添加10%中和黑液的LB培养基中的好氧生长情况。结果表明，该细菌在中和黑液存在条件下能够生长。在不含黑液的条件下，环境分离株初期生长较快（指数生长期代时为20小时），但生长无法持续超过62小时；而在含黑液的条件下，微生物环境分离株生长较慢（指数生长期代时为35小时），但其光密度持续增加，直至培养超过230小时。在黑液存在下培养的微生物环境分离株的生长曲线呈现出双相生长模式，提示黑液中含有多种可被该微生物利用的碳源，且该细菌表现出对营养物质利用的优先顺序。尚需进一步实验以确定其利用黑液满足生长需求的能力。此外，也可研究细菌在未中和黑液中的生长情况，或探究黑液浓度增加对生长的影响。

在证明了微生物在含有黑液的条件下能够生长后，可通过最小培养基生长实验来确定其对碳源的利用能力。构成木质纤维素组分的商品化底物可作为最小培养基中的碳源。...

讨论

本方案描述了一套组合技术，旨在鉴定能够降解制浆废料的微生物、在利用制浆废料生长过程中所利用的碳源，以及在制浆废料上生长时产生的微生物代谢产物。我们已通过一种微生物环境分离株验证了该方案的有效性：该菌株为兼性厌氧菌，可在含10%黑液的条件下生长，并以木质纤维素提取成分为唯一碳源进行生长。该方案可用于评估其他具有木质纤维素降解潜力的微生物或微生物群落降解制浆废料的能力。

每次大约收集1 L的黑液；然而，具体收集量应根据实验需求以及获取黑液的条件来确定。在收集黑液时，务必佩戴护目镜，并使用耐热手套持握收集瓶。在本实验方案中，对黑液进行了中和处理，以促进本实验所用微生物环境分离株的生长；但其他微生物可能在不同pH条件下生长更佳。此外，其他微生物也可能能够在更高比例的制浆废液中生长。由于该制浆废液颜色较深，在高浓度下会干扰光密度测定，因此应采用其他方法来测定细胞生长情况（如活细胞计数或显微镜技术）。

此处所述的提取过程可应用于其他具有不同粒径的生物质形式，但这些变化可能影响产率。本研究采用最小培养基琼脂实验，以定性评估该微生物环境分离株...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1,4-二噁烷（ACS认证级）	Fisher	D111	易燃、可预先氧化的化学品
黑液	北卡罗来纳州立大学森林生物材料系	N/A	pH 12.72，固体含量13.67%
乙醇（微生物学级）	Fisher	BP2818
乙酸乙酯（ACS试剂级）	EMD	EX0240-9	易燃
冰乙酸（ACS认证级）	EMD	AX0073	腐蚀性
愈创木酚	Sigma Aldrich	PHR1136	吞咽有害，具有腐蚀性
HP-5毛细管柱	Agilent	19091J-577	60 m × 0.18 mm 内径，0.18 μm 涂层厚度
盐酸（ACS认证级）	EMD	HX0603P
N,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺与三甲基氯硅烷 99:1%（BSTFA）	Fluka	15238	易燃，接触可引起皮肤灼伤和眼部损伤
Na2SO4 （FCC级）	VWR	BDH8026
NaClO2（80%）	Sigma Aldrich	244155	易燃，皮肤接触有毒
NaOH（ACS认证级）	EMD	1.06498.1000	腐蚀性
Alkacid pH试纸条	Fisher	A979
磷酸（ACS认证级）	Fisher	A242
Polaris Q 质谱仪	Thermo Electron Corporation
吡啶（99%）	Alfa Aesar	A12005	易燃，皮肤接触有毒
柳枝稷	北卡罗来纳州戈德斯伯勒樱桃研究农场	N/A	2011年8月收获
Thermo Finnigan 痕量气相色谱仪	Thermo Electron Corporation
Whatman no. 1 滤纸	Whatman	1001-150