核苷三磷酸——从合成到生化表征

摘要

本文所述方案旨在阐明并简化通向修饰核苷三磷酸的复杂路径中的诸多障碍。因此，该方案有助于这些活化结构单元的合成及其在实际应用中的可及性。

摘要

传统引入化学功能基团的策略是通过固相合成法，将经过适当修饰的亚磷酰胺前体添加到新生链上。然而，该方法在合成过程中所使用的条件以及对较短序列的限制，阻碍了其广泛应用。另一方面，修饰的核苷三磷酸是已活化的结构单元，已被用于在温和条件下将多种功能基团引入核酸分子中，这一策略为修饰核酸在诸多实际应用中的使用开辟了道路，例如功能标记以及核酶和脱氧核酶的构建。其中主要挑战之一在于该方法本身的复杂性，导致这些核苷类似物的分离与表征过程困难。

在本视频文章中，我们详细介绍了一种使用基于磷(III)试剂合成这些修饰类似物的实验方案。此外，还公开了其生物化学表征的具体步骤，特别着重于引物延伸反应和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）加尾聚合反应。该详细的实验方案将有助于修饰型脱氧核苷三磷酸（dNTP）的制备及其在化学生物学中的进一步应用。

引言

5'-核苷三磷酸（(d)NTP）是一类重要的生物分子，参与了从作为通用能量货币到细胞代谢调控等多种过程与功能。除了在这些基本生物学转化中的作用外，其修饰衍生物已发展成为一种多功能且温和的平台，可用于将功能基团引入寡核苷酸中，该方法很好地补充了通常采用的自动化固相合成技术^1,2。事实上，只要（d）NTPs能够作为RNA和DNA聚合酶的底物³，就可以将多种功能基团引入寡核苷酸，包括氨基酸^4-13、硼酸^14,15、降冰片烯¹⁶、类金刚烷残基¹⁷、有机催化侧链¹⁸、胆汁酸¹⁹，甚至寡核苷酸本身²⁰。

除了作为核酸功能化的便捷载体外，修饰的dNTP还可用于SELEX及其他相关的组合方法中 体外 修饰型催化核酸生成的筛选方法^21-30 以及适用于多种实际应用的适配体^10,31-36通过修饰的脱氧核苷三磷酸（dNTPs）聚合引入的额外侧链被认为能够扩大筛选实验中可探索的化学空间，并弥补核酸本身功能基团相对贫乏的不足³⁷然而，尽管这些特性颇具吸引力，且在合成与分析方法的开发方面已取得近期进展，但目前仍不存在一种普适且高产率的制备修饰核苷三磷酸的方法。^2,38.

方案

1. 修饰核苷三磷酸的合成

所选用的合成方法遵循Ludwig和Eckstein开发的方案，因为该方法通常可靠，且产生的副产物极少（图1A）³⁹。

1. 共蒸发适当保护的3’-OAc核苷（ 通常 用无水吡啶（2 ml）清洗0.1 mmol样品两次，然后在真空下干燥过夜。同时，将四丁基铵焦磷酸盐（0.13 mmol）在真空下干燥过夜。
2. 将核苷溶于最少体积的干燥吡啶（0.2 ml）中，加入干燥二氧六环（0.4 ml）作为共溶剂。最后加入2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮（0.11 mmol），室温下反应45分钟。
   注意：需特别注意2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one试剂的处理。事实上，即使将该试剂保存在惰性气体氛围中，也不足以完全防止其分解。因此，分解过程中形成的白色固体可在使用前刮除。
3. 在干燥的DMF（0.17 ml）中配制焦磷酸三丁基铵溶液，并加入新鲜蒸馏的三丁胺（58 µl；切勿加入分子筛）。将所得溶液加入反应混合物中（会出现白色沉淀，但迅速消失），室温下反应45分钟。
4. 将碘（0.16 mmol）溶于吡啶（0.98 ml）中，制备溶液₂O (20 µl）并加入反应混合物中，以氧化Pα(III) 中心。将所得....

结果

修饰核苷三磷酸是一类极具吸引力的合成目标，因为它们能够方便地将多种功能基团引入核酸中⁴¹。然而，这些活化结构单元的分离与表征往往被证明是困难的。因此，本文所示结果被认为有助于指导上述合成与生物化学步骤中的各个操作过程（图1B）。

特别是 图3 显示典型的粗提物 ³¹修饰核苷三磷酸（本例中为 dU）的磷-核磁共振谱^BpuTP（4)¹⁸, 图2），其中可观察到磷中心的特征信号（即 -5.02 处的一个二重峰（P_γ），在 -10.44 处的一个双峰（P_α）以及在 -20.55 处的三重峰（P_β）ppm）。此外，此阶段始终可观察到焦磷酸盐（-4.84 和 -10.63 ppm 处的两个双峰）和单磷酸盐（-0.18 ppm 处的单峰）副产物，以及多磷酸盐（-21.02 和 -23.19 p.......

讨论

将修饰引入核酸在多种实际应用中具有重要意义，包括反义和抗基因试剂的开发^42,43、寡核苷酸的标记与功能标记⁴¹，以及扩展遗传字母表的研究^44-46。化学修饰和功能基团通常通过标准或自动化的固相合成方法引入核酸中。然而，磷酰胺单体必须能够耐受该方法所施加的较为剧烈的条件，这反过来对化学功能基团的性质造成了严重限制⁴⁷。相比之下，通过酶促聚合修饰的脱氧核苷三磷酸，可引入更广泛的功能基团，因为其唯一限制是这些修饰核苷酸需能作为聚合酶的底物^1,2。尽管目前仍明显缺乏普适性的方法，但针对修饰dNTP的合成，已有可靠且稳健的合成与分析方法被建立。此外，由于其固有性质，修饰的三磷酸化合物对不同的外界条件（例如 pH、温度）较为敏感，因此，提供详细的合成与表征操作流程具有重要意义。

本文所述的工作流程包括修饰脱氧核苷三磷酸（dNTP）的化学合成、反相高效液相色谱（RP-HPLC）纯化、核磁共振（NMR）分析，以及用于这些核苷类似物生化表征的酶学实验。修饰dNTP成功合成与.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
三丁基铵焦磷酸盐	Sigma Aldrich	P8533	易吸湿固体，需在氩气下保存
2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环-4-酮	Sigma Aldrich	324124	对湿气敏感
吡啶	Sigma Aldrich	82704	在分子筛条件下
二噁烷	Sigma Aldrich	296309	在分子筛下
二甲基甲酰胺（DMF）	Sigma Aldrich	40248	在分子筛下
乙腈	Fisher Scientific		HPLC 级
三乙胺	Sigma Aldrich	90342
三丁胺	Sigma Aldrich	90781
ddH2O	Milli-Q		经二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理并高压灭菌的去离子纯化水
焦碳酸二乙酯（DEPC）	Sigma Aldrich	159220
D2O	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-25
γ-[32P]-ATP	Hartmann Analytics	FP-301
天然 dNTP	Promega	U1420
Vent (exo--DNA聚合酶	NEB	M0257S
DNA聚合酶I大（Klenow）片段	NEB	MO210S
9°Nm DNA聚合酶	NEB	MO260S
末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）	Promega	M828A
Pwo DNA聚合酶	Peqlab	01 01 5010
T4 PNK	Thermo Scientific	EK0032
丙烯酰胺/双丙烯酰胺（19:1，40%）	Serva	10679.01
琼脂糖	Apollo Scientific	BIA1177
G10 Sephadex	Sigma	G10120
尿素	Apollo Scientific	BIU4110
Jupiter半制备型反相高效液相色谱柱（5μ C18 300 Å)	Phenomenex
Gene Q热循环仪	生物概念	BYQ6042E
PCR 管	生物概念	3220-00
高效液相色谱系统	Amersham Pharmacia Biotech		Äkta basic 10/100
所有寡核苷酸均购自Microsynth，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行纯化
5'-CAAGGACAAAATAC CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA CATCGCCTCTGGGCTA ATAGGACTACTTCTAAT CTGTAAGAGCAGATCC CTGGACAGGCAAGGAA TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
有关实验步骤和设备的更多信息可在以下文章中找到： Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330 有机与生物分子化学 2013，DOI: 10.1039/C3OB40842F