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一种用于从 Drosophila 胚胎中分离蛋白质复合物的 in vivo 交联方法

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DOI：

10.3791/51387

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2014年4月23日

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1Department of Biological Sciences, Murray State University

本文内容

摘要

多组分蛋白质复合物在细胞功能与发育过程中发挥着关键作用。本文介绍一种用于分离天然蛋白质复合物的方法 黑腹果蝇 胚胎发育后 体内 交联后纯化交联复合物，用于后续的结构-功能分析。

摘要

许多细胞过程由多亚基蛋白质复合物调控。这些复合物通常为短暂形成，且需要天然环境才能组装。因此，为了鉴定这些功能性蛋白质复合物，稳定其结构至关重要。 体内 在细胞裂解及后续纯化之前。本文描述了一种用于分离大量 真正有效的 蛋白质复合物从 果蝇 胚胎。该方法基于胚胎的通透化处理，并通过稳定复合物在胚胎内部的结构来实现 体内 使用低浓度甲醛进行交联，该试剂可轻易穿过细胞膜。随后对目标蛋白质复合物进行免疫纯化，再经凝胶纯化后通过质谱分析。我们以纯化Tudor蛋白复合物为例说明该方法，该复合物对生殖系发育至关重要。Tudor是一种大型蛋白，含有多个Tudor结构域——这类小型模块可与靶蛋白上甲基化的精氨酸或赖氨酸相互作用。该方法可适用于从不同生物体和组织中分离天然蛋白质复合物。

引言

分离多亚基蛋白质复合物以及DNA-或RNA-蛋白质复合物，旨在鉴定蛋白质复合物、DNA结合调控蛋白识别的基因组位点，或RNA结合蛋白所靶向的RNA序列。不同的方法可用于全基因组范围内鉴定转录因子或染色质蛋白识别的DNA位点（ChIP-seq）1，以及与特定RNA结合蛋白相关的RNA靶标（CLIP-seq）2。随后对来源于RNA的cDNA文库或DNA靶标文库进行深度测序。这些方法利用化学交联或紫外光诱导交联来稳定复合物，然后使用针对目标复合物中某一蛋白质组分的抗体进行免疫沉淀（IP）。

在生物体发育过程中，许多蛋白质复合物会 transiently（短暂地）形成。因此，为了理解调控发育的分子机制，对这些复合物的组成和功能进行 in vivo（体内）分析至关重要。这种 in vivo 分析优于 in vitro（体外）方法，因为在 in vitro 条件下几乎无法重现相互作用组分的天然浓度以及细胞内的生化环境。本文中，我们展示了一种 in vivo 方法，已成功用于从 Drosophila（果蝇）胚胎中分离大型蛋白质复合物。该方法中，活胚胎内的蛋白质复合物首先用低浓度甲醛进行交联，随后通过针对复合物中已知组分的抗体进行免疫沉淀（IP）来富集目标复合物，再经凝胶纯化后进行质谱分析，以鉴定未知的复合物组分。由于甲醛能够穿透细胞膜，且其交联距离为 2.3–2.7 Å3，因此可在 in vivo 条件下实现蛋白质复合物的交联，且复合物组分之间很可能彼此靠近。本文以图多尔（Tudor, Tud）蛋白复合物的分离为例，介绍该方法。Tud 是一种生殖系蛋白，对生殖系发育至关重要4-7。该蛋白包含 11 个 Tud 结构域，已知可与其他多肽的甲基化精氨酸或赖氨酸相互作用8-10。

此前，我们已构建了一种转基因小鼠模型 果蝇 表达HA标签功能性Tud的细胞系5 因此，交联后使用特异性抗HA抗体来沉淀Tud复合物。

除了蛋白质-蛋白质交联外，甲醛还可产生核酸-蛋白质交联，因此被用于ChIP-seq实验中。此外，在Drosophila中，利用甲醛进行in vivo交联已实现了对Vasa RNA解旋酶蛋白的RNA靶标的鉴定11。

虽然本文描述了一种方法 体内 蛋白质复合物的交联与纯化 果蝇 胚胎，该方法也可适用于其他生物体和组织。

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方案

1. 制备大尺寸苹果汁琼脂平板

  1. 制备4个培养皿，将375 ml H2O、11.25 g 果蝇琼脂和一个搅拌子加入1,000 ml 锥形瓶中。此为A液。将锥形瓶盖松松盖上，对A液进行高压灭菌，使用液体物品的30分钟灭菌程序。
  2. 将125 ml 苹果汁、12.5 g 食用糖和一个搅拌子加入500 ml 烧杯中。此为B液。在加热平台上边搅拌边加热B液，并保持温度约70 °C，直至A液高压灭菌完成。
  3. A液高压灭菌完成后，将B液转移至A液中。继续轻轻搅拌混合液，并静置冷却15分钟。在加入防腐剂前，避免过度冷却导致琼脂凝固。
  4. 用乙醇配制10%（质量/体积）的对羟基苯甲酸甲酯溶液，作为防腐剂。向上述苹果汁-琼脂混合液中加入3.75 ml 该溶液，继续搅拌5分钟。
  5. 将含防腐剂的苹果汁-琼脂混合液各125 ml 倒入每个300 cm2 的塑料或泡沫塑料培养皿中。静置于室温下冷却并凝固。倾倒时避免产生气泡。
    注意： 苹果汁-琼脂培养皿可立即使用。未使用的培养皿用透明膜封盖，于4 °C 保存，最长可保存一周。

2. Drosophila 胚胎收集与预交联处理

  1. 将约 40,000 至 50,000 只果蝇放入群体培养笼中，用于收集胚胎。
  2. 制备两块平板，每块含 125 ml 标准玉米粉-糖蜜培养基12，并在每块平板上撒约 4 g 干燥的酿酒酵母。将这些平板放入 25 °C 培养箱中的群体培养笼内，持续 48 小时 以使果蝇增肥。
  3. 将两块苹果汁-琼脂平板预热至 25 °C，并在每块平板上撒约 1 g 干燥的酿酒酵母。将这两块平板放入群体培养笼中，开始收集 0–1 小时龄的胚胎。
  4. 在 1 小时收集结束后取出平板。如需进行下一轮收集，则更换为两块新平板。
  5. 加入足量水浸没平板，并用细毛画笔轻轻重悬胚胎。将重悬的胚胎倒入由两层不锈钢丝网制成的筛子中过滤。
    注意： 上层筛网为中等孔径（850 μm），可截留较大的果蝇组织碎片，允许胚胎通过；下层筛网为细密网孔（75 μm），可截留胚胎，同时使酵母和水通过。
  6. 使用细毛画笔将收集的胚胎转移至由 50 ml 离心管和细尼龙网制成的收集篮中。用少量水快速冲洗胚胎，然后将网膜在纸巾上轻压以吸去水分。
  7. 将胚胎浸入 50% 次氯酸钠溶液中，轻轻摇晃处理 3 分钟。用大量水彻底冲洗以去除残留的次氯酸钠。将网膜在纸巾上轻压至干燥。
  8. 将去壳的胚胎浸入异丙醇中，轻轻振荡 15 秒，或直至多胚胎聚集体完全分散（不应超过 30 秒）。将网膜在纸巾上轻压至完全干燥。
  9. 将胚胎浸入庚烷中 5 分钟，同时用移液器将庚烷持续流过胚胎表面，以保持其悬浮状态。将网膜在纸巾上轻压至干燥。
  10. 用含 0.1% Triton X-100 的磷酸盐缓冲液（pH 7.4，PBS）（PBST）持续冲洗胚胎 3 分钟。
  11. 拆解收集篮，将胚胎连同尼龙网一起转移至含有 10 ml PBST 的 15 ml 离心管中。轻轻倒置离心管，使胚胎从网膜上洗脱下来。
  12. 从离心管中取出尼龙网。将离心管垂直放置，依靠重力使胚胎自然沉降至管底。
    注意： 一次培养笼中 1 小时的胚胎收集量通常为 100–300 μl。
  13. 吸除 PBST 液体，并立即继续进行交联反应。

3. 收集胚胎的体内 交联

  1. 使用前立即配制0.2%多聚甲醛PBST溶液。向胚胎中加入10 ml多聚甲醛固定液，在旋转摇床上于25 °C轻柔振荡孵育10分钟。未用完的固定液应在当天结束前丢弃。
  2. 终止交联反应
    1. 交联完成后，让胚胎沉降至管底。
    2. 移除多聚甲醛溶液，立即加入10 ml含0.25 M甘氨酸的PBST溶液以终止交联反应。在旋转摇床上于25 °C轻柔振荡孵育5分钟。
    3. 让胚胎沉降至管底，移除终止液。用10 ml PBST溶液洗涤胚胎三次。
    4. 用移液器彻底吸除PBST洗涤液。将胚胎储存于-80 °C，直至使用。

4. 蛋白质样品制备与 免疫沉淀

  1. 使用Dounce匀浆器在2 ml裂解缓冲液（含0.5 M尿素、0.01% SDS、2% Triton-X 100、2 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]及蛋白酶抑制剂混合物的PBS溶液）中匀浆500 μl交联胚胎。
    注意：除非另有说明，本步骤及后续步骤均在室温下进行。
  2. 将裂解液转移至1.5 ml离心管中，在旋转平台上轻轻摇动15分钟，以确保充分裂解。在16,000 × g离心5分钟以沉淀细胞碎片。将上清液收集至洁净的15 ml离心管中。
  3. 向上清液中加入40 μl抗HA琼脂糖珠悬液，在旋转平台上孵育2.5小时。
  4. 在2,500 × g离心5分钟使珠子沉淀，弃去上清液，但保留约250 μl液体于管中。将珠子用残留的上清液重悬，并转移至带有10 μm孔径滤膜的1.5 ml离心柱中。
  5. 以12,000 × g离心10秒，弃去穿流液。
  6. 加入200 μl洗涤缓冲液（含0.1 M甘氨酸、1 M NaCl、1% IGEPAL CA-630、0.1% Tween-20的PBS溶液）洗涤珠子，以12,000 × g离心10秒后弃去洗涤液。重复洗涤两次。
  7. 向珠子中加入40 μl洗脱缓冲液（含2 mg/ml HA肽的PBS溶液），在37 °C孵育15分钟，每5分钟轻轻振荡一次。以12,000 × g离心10秒，收集洗脱液。
  8. 使用抗HA抗体通过Western印迹分析确认复合物的洗脱13。

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结果

通过在3% - 7%的阶梯凝胶上进行SDS-PAGE（如图1所示），随后进行蛋白质印迹（图2），分析交联反应的有效性以及交联Tud蛋白复合物的纯化是否成功。

使用3% - 7%梯度胶的目的是为了有效分离交联的Tud蛋白复合物与未交联的游离Tud蛋白，并实现复合物的富集。在上述体内交联条件下，仍有大量Tud蛋白保持未交联状态。这种游离的Tud蛋白会在免疫沉淀（IP）过程中与交联的复合物共同纯化，直至通过SDS-PAGE分离。尽管分子量较大，未交联的Tud蛋白（285 kDa）在电泳中能够顺利穿过3% - 7%胶的界面，无明显滞留；而分子量更大的交联Tud蛋白复合物则难以穿过凝胶界面，导致其在界面处“被捕获”并富集，或在界面附近“拖尾”，从而实现与游离Tud蛋白的分离。

设置适当的对照对于验证该交联方案的特异性至关重要。因此，我们使用表达HA标签GFP蛋白的胚胎14来监测交联程度。我们对表达HA标签GFP的胚胎进行了不同浓度...

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讨论

甲醛常被用作交联试剂，以鉴定蛋白质-蛋白质及蛋白质-核酸相互作用。其良好的溶解性与细胞膜通透性，以及与后续质谱分析步骤的兼容性，使其成为细胞内交联应用的理想试剂。3,15-17特别是，该方法已成功用于鉴定与Vasa相关的mRNAs，Vasa是一种在生殖细胞中至关重要的RNA解旋酶 果蝇11此外，甲醛在市售交联剂中具有最短的间隔臂之一（2.3 – 2.7 Å），这意味着只有在空间上非常接近的分子才能在适当条件下发生交联，从而增强目标蛋白相互作用伙伴的特异性。基于上述原因，本实验方案选择甲醛作为交联剂。然而，这并不排除其他交联剂在特定应用中的实用性 体内 应用 果蝇 胚胎。然而，我们尝试使用二硫代双（琥珀酰亚胺基丙酸酯）（DSP），这是一种N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯类交联剂，常在ChIP实验中与甲醛联合使用17,18，以替代本研究中的甲醛，但使用该交联剂未能获得明显的Tud复合物。另一方面，DSP可能对其他蛋白质复合物有效，但其适用性需根据具体情况逐一确定。此外 体内 交联方法， 体外

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢Jordan Davis、Yanyan Lin、Eric Schadler和Jimiao Zheng在本研究中提供的技术帮助。本工作由美国国家科学基金会职业奖（NSF CAREER grant MCB-1054962）资助，授予A.L.A.。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Drosophila 琼脂Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1水和琼脂混合物切勿长时间高压灭菌，否则会导致苹果汁平板变得脆弱
对羟基苯甲酸甲酯Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501别名：TEGOSEPT
群体培养笼Flystuff (http://www.flystuff.com/)59-104
细尼龙网Flystuff (http://www.flystuff.com/)57-102制作收集篮时，应将尼龙网裁剪得略大于 Falcon 管盖开口，以确保密封紧密
达恩斯匀浆器Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SET使用前将匀浆器置于冰上预冷，并用预冷的裂解缓冲液预冲洗，以防止蛋白质降解
蛋白酶抑制剂混合物 Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001可使用 PBS 配制高浓度蛋白酶抑制剂储备液
抗 HA 琼脂糖微珠MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8试剂盒还包含 HA 肽段和离心柱
HA 肽段MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8用 PBS 配制成 2 mg/ml 溶液 
离心柱MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8离心柱作为试剂盒的一部分提供
异丙醇Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP26324
吐温 X-100Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP151-500
正庚烷Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625使用前用纳米纯水将 10X 溶液稀释至 1X
甲醛Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
甘氨酸BioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDSBioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0301
尿素BioRad (www.bio-rad.com/‎)161-0730
苯甲基磺酰氟Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1G用异丙醇配制 200 mM 储备液，然后在裂解缓冲液中稀释至工作浓度 2 mM
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
吐温 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
15 ml 离心管USA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
漂白剂Clorox 品牌与等体积纳米纯水混合，配制成 50% 漂白剂溶液
50 ml 离心管BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
上层筛网Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
下层筛网Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA

参考文献

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