长期活体免疫荧光成像技术用于观察组织基质成分：基于落射荧光与双光子显微镜的方法 落射荧光显微镜，双光子显微镜，活体成像，免疫荧光，细胞外基质，胶原蛋白，基底膜，组织重塑，肿瘤微环境，炎症，纤维化

摘要

在伤口愈合、炎症和肿瘤发生过程中，细胞外基质会发生显著的重塑。本文介绍一种新型的活体免疫荧光显微技术，可利用落射荧光或双光子显微镜，以高空间和时间分辨率可视化纤维状以及网状基质成分的动态变化。

摘要

细胞外基质（ECM）不仅是维持组织形态的物理支架，还积极参与调控细胞和组织在发育及器官稳态过程中的功能。它通过生化、生物力学和生物物理信号通路实现这一作用，例如释放具有生物活性的ECM蛋白片段、调节组织张力以及为细胞迁移提供路径。肿瘤微环境中的细胞外基质会发生显著的重塑，表现为纤维性和非纤维性基质蛋白的降解、沉积与重新排列。肿瘤微环境基质的硬化可促进肿瘤生长和侵袭，并引起血管和淋巴管的结构重塑。然而，目前对基质蛋白的活体成像主要局限于可通过多光子显微镜的二次谐波生成技术检测的纤维状胶原蛋白，导致大多数基质成分仍难以观察。本文描述了在小鼠薄而透明的背耳皮肤接种肿瘤、对细胞外基质蛋白进行免疫标记，并利用落射荧光和双光子显微镜对活体小鼠暴露组织进行活体成像的操作流程。我们的活体成像方法能够在皮肤肿瘤生长过程中直接检测纤维性和非纤维性基质蛋白。我们展示了局部基质收缩引起的血管重塑实例，并发现通过二次谐波生成检测到的肿瘤纤维基质在空间上与新沉积的基质成分（如腱生蛋白C）分布不同。此外，我们实现了对T细胞与肿瘤细胞相互作用以及肿瘤细胞沿基底膜IV型胶原迁移的长期（12小时）动态观察。综上所述，该方法能够随时间同步检测肿瘤细胞、其物理微环境以及内源性组织免疫反应，可能为揭示肿瘤进展机制以及治疗响应或耐药性的根本原因提供重要线索。

引言

对炎症、转移及基质重塑过程进行活体成像一直是重要的研究领域，推动了多种表达荧光蛋白的转基因报告小鼠模型的建立^1,2。由于非焦平面的荧光信号会降低图像质量并限制光在组织中的穿透深度，厚组织成像只能借助共聚焦或多光子扫描显微镜实现³。而更快速、成本更低且操作更简单的落射荧光显微镜仅适用于接近二维结构的组织，例如鸡胚尿囊膜⁴或小鼠耳部真皮⁵。大多数成像系统依赖于表达多种荧光蛋白的转基因小鼠，这些蛋白可在特定细胞类型中特异性表达。尽管这些荧光蛋白引起的光毒性较弱，但仍可能诱发免疫反应⁶。此外，难以在特定细胞亚型之间切换，或标记其基础状态与激活状态，因为此类变化通常需要构建新的遗传模型。另外，由于荧光蛋白的表达通常局限于细胞内区域，因此通常无法对基底膜蛋白或组织中趋化因子沉积等细胞外结构进行成像⁷。相比之下，使用针对细胞外抗原的抗体进行间接标记，可灵活地针对几乎任何细胞类型或基质特异性成分^8,9。然而，这种标记方法的主要缺点在于由抗原-抗体免疫复合物介导的免疫毒性，可能触发补体系统依赖性的细胞毒性和对细胞及细胞外结构的吞噬作用¹⁰。

肿瘤微环境中的细胞外基质，以及炎症或伤口愈合过程中正常组织的细胞外基质，均经历显著的重塑。肿瘤微环境的间质硬化可因应力诱导的信号传导机制促进肿瘤生长和侵袭，并导致血管和淋巴管的重塑。¹¹然而，基质蛋白的活体成像目前仅限于可通过多光子显微镜利用二次谐波生成技术检测的纤维状胶原蛋白。近期，我们发表了一种新型的活体成像方法，可最大限度地降低光毒性和免疫毒性对成像细胞及组织结构造成的损伤风险。⁵与已有的成像技术相比，传统的连续活体可视化单次观察时间通常在30分钟至2小时范围内^12-17，我们的活体免疫荧光（IF）技术可实现12小时（长期） ⁸成像。需要注意的是，由于动物实验方案中规定的限制，成像时间被限定在12小时以内；但如果能够监测并控制动物的关键生理参数（如血压和心率），则并无技术上的禁忌证来阻止成像时间的延长。⁸此外，通过使用自动化荧光体视显微镜，我们能够在单次实验中从多个视野采集图像 并观察到在具有功能性血管和淋巴管的皮肤生理环境中发生的罕见免疫及重塑过程。由于体视显微镜镜头具有相对较大的2 cm工作距离，且 与双光子显微镜光学系统相比 无需水浸蒸发，在荧光体视显微镜下进行长期成像。活体免疫荧光（intravital IF）技术可实现对正常皮肤中任何细胞外基质成分的免疫标记与检测。该技术的设计基于一种创新理念，即在手术暴露的活体组织上对活细胞及组织基质成分进行免疫染色  暴露小鼠真皮层而不引起有害的免疫毒性效应⁵该手术操作本身对真皮血管系统是安全的，因为它仅依赖于耳部两个独立神经支配、由不同淋巴循环分别供血和引流的皮肤层之间的分离。我们的实验装置可对多种重要的病理生理过程进行至少12小时的成像观察，包括白细胞在血管与淋巴管之间的迁移以及伤口愈合过程。在原始发表的研究中，我们将该技术与活体成像多个领域的前沿标准进行了比较，进而观察到不同类型白细胞的血管外渗和淋巴管内渗事件，其中包括免疫细胞进入集合淋巴管（而非预期的初始淋巴管）的独特可视化现象。¹⁵此外，补充其他研究团队的观察结果^9,18，我们发现 体内 CCL21 能够在集合淋巴管上形成强而间断的沉积，但在初始淋巴管上仅偶尔形成。

本文介绍了一种改良的活体免疫荧光（IF）技术，该技术可与双光子显微镜结合，利用二次谐波生成（SHG）检测纤维状胶原蛋白网络。我们证明，该方法还可用于在动态肿瘤微环境背景下成像癌细胞的侵袭过程，其中包括如腱生蛋白C（tenascin C）等基质分子，而这些分子目前尚未被现有成像技术充分研究¹⁹。我们发现，通过二次谐波生成检测到的肿瘤纤维基质在肿瘤微环境中的分布位置，与新沉积的、主要由腱生蛋白C构成的基质存在差异。此外，我们展示了局部基质收缩引起的血管重塑实例、T细胞与肿瘤细胞相互作用的长期（12小时）成像，以及肿瘤细胞沿基底膜胶原IV迁移的过程。在成像这些事件的同时，还可同步记录局部生理参数，如血管通透性和淋巴引流情况。

方案

所有动物实验操作均严格遵循瑞士动物保护法、动物保护条例及动物实验条例。我们确认，本研究已获得由沃州州立监督委员会（许可编号：2687）命名的机构动物护理与使用委员会（IACUC）的特别批准。

1. 耳部肿瘤接种

1. 在10 cm培养皿中，使用DMEM + 10% FBS培养基培养B16-F10-GFP黑色素瘤细胞。
2. 当细胞融合度达到80-90%时，用PBS洗涤细胞，并通过胰酶消化法使其脱离。在4 °C下以1,500 × g离心5分钟，将细胞沉淀重悬于1 ml林格氏液中，转移至1.5 ml离心管。再次离心后，弃去上清液，仅保留紧贴细胞沉淀上方的一薄层液体。将细胞重悬，最终形成浓稠的细胞悬液。
3. 用氯胺酮/多布隆 [右美托咪定]（75 mg/kg - 1 mg/kg）混合物麻醉小鼠，并通过轻捏足趾确认动物已充分麻醉。若观察到动物有运动反应，以0.1%为梯度逐步增加异氟烷浓度（例如 用肛温探头控制的加热垫（37 °C）保持小鼠体温，并在整个过程中保护其眼睛，使用适当的医用眼膏。
4. 准备一支Hamilton注射器（33 G针头，10 ml注射器容积）。取下针头端帽，将20 µl细胞悬液加至尖端腔室顶部。回拉活塞，使注射器内吸入5 ml悬液。清除尖端腔室多余的悬液，并盖上端帽。
5. 用胶带将耳部近端边缘固定于食指指尖。以45°角将Hamilton注射器针头缓慢插入耳背侧真皮与软骨之间。进入后，沿近端向远端方向穿刺约2-3 mm。
   注意：细胞注射操作应由经过培训并获得认证的技术人员进行。此外，该过程必须缓慢且按顺序执行：首先将针头水平置于耳部皮肤表面，并缓慢插入耳部真皮层。只有在针尖完全进入皮肤后，方可推动推杆，推动推杆将启动细胞在皮肤内的接种。若极罕见情况下针头穿透耳部真皮双层、软骨层，并刺入操作者的手指皮肤，造成操作者手指疼痛，应视为警示信号，须立即将针头从操作者皮肤中撤出。在此情况下，不应推动推杆，并应使用酒精对皮肤进行消毒。 alternatively，可使用无生命物体代替手指来固定耳朵。
6. 注射3 µl细胞悬液，缓慢将针头从耳部退出。让肿瘤细胞在7-9天内形成实体瘤，并使用荧光体视显微镜监测肿瘤生长。
7. 或者，为观察肿瘤细胞与组织基质相互作用的早期步骤，可在暴露并染色的耳部真皮（步骤3.3之后）上施加50 μl含100,000个肿瘤细胞的Ringer's溶液。

2. 耳科手术

1. 实验前3天，剃除小鼠头部毛发，对头部及耳周区域进行脱毛处理（10-15秒），并用水冲洗。
2. 使用加湿氧气与异氟烷（3-4%诱导，1-2%维持）混合气体麻醉小鼠，并通过轻捏脚趾确认动物已充分麻醉。若观察到动物有运动反应，以0.1%为梯度逐步增加异氟烷浓度 例如 用肛温探头控制的加热垫（37 °C）在整个过程中保持小鼠体温，并使用适当的眼科软膏保护其眼睛。
3. 用8张粘合在一起的玻璃组织学载玻片搭建一个平台。将小鼠仰卧放置，并将其带瘤耳朵轻轻置于载玻片堆上。使用小条状胶带将耳朵的前缘和后缘固定在载玻片堆上。
4. 沿小鼠耳廓的对耳轮处，用手术刀切开耳部腹侧皮肤。借助弯头镊子，轻轻将腹侧真皮和软骨从肿瘤接种侧的背侧真皮上剥离。用弯头镊子取下腹侧皮肤和软骨，暴露背侧真皮。注意：若耳部主要血管被切断，或血液循环在15分钟内未能恢复正常流动，则该耳不可用于成像。始终使用林格缓冲液保持耳部皮肤湿润，并用盖玻片维持湿度。
5. 若肿瘤血管持续出血，可通过加入100 µl凝血酶（5 U/ml）于Ringer缓冲液（102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂）中止血。₂，28 mM 乳酸钠）置于耳部表面持续 5 分钟。
6. 用约 5 ml 的林格氏缓冲液清洗耳部两次，并用无菌擦拭巾除去多余液体。立即进行下一步操作（切勿使开放的耳部在任何时刻变干）！

3. 免疫荧光染色

所有染色步骤均使用添加了人血清（1:10）、鼠抗人IgG多克隆二抗（1:50）和125 IU/ml（2.5 mg/ml）抑肽酶（抑制性缓冲液）的林格氏缓冲液。抑肽酶通过抑制纤溶酶促进凝血，以限制手术后可能发生的初期出血。

1. 将耳部真皮开放部分折叠至耳甲隆起处，并用无菌擦拭巾擦干外部未开放的耳部真皮。在载玻片堆叠上固定耳部，于其前后背侧边缘涂抹0.5 μl手术胶。随后，轻柔地将耳部背侧真皮压平贴附于玻璃表面。
2. 在暴露的耳部上施加针对细胞外基质分子的一抗，抗体浓度为10 µg/ml，总体积为100 µl封闭缓冲液。用盖玻片覆盖耳部，防止染色液在耳缘干燥。孵育15分钟。用约5 ml林格氏缓冲液洗涤耳部两次。
3. 在暴露的耳部上施加适当的二抗或链霉亲和素偶联物（用于活体成像时，建议选用激发波长较高的荧光染料，如594 nm或647 nm），抗体浓度为10 µg/ml，总体积为100 µl封闭缓冲液。用盖玻片覆盖耳部，孵育15分钟。用约5 ml林格氏缓冲液洗涤耳部两次。

4. 血源性活化脾细胞与肿瘤细胞的相互作用 原位

1. 在同系小鼠背部皮肤接种GFP-B16-F10黑色素瘤7天后，处死动物并取出脾脏。通过70 μm细胞筛网对脾脏进行机械性破碎，分离脾细胞。
2. 用Red CMTPX细胞质染料（1 μM，溶于PBS）在37 °C下标记脾细胞8分钟，在4 °C下用15 ml缓冲液洗涤4次，随后立即将细胞重悬于200 μl无血清培养基中，通过尾静脉注射至此前7天耳部已接种B16-F10-GFP的小鼠体内。

5. 使用体视显微镜进行活体成像

1. 对于短期成像（最长2小时），加入新配制的无菌抗坏血酸-林格缓冲液，其中含有140 mM抗坏血酸钠、10 mM HEPES、4 mM KCl和5 mM CaCl₂₂，置于pH 7.5（抗坏血酸-Ringer缓冲液，终末渗透压为320 mOsM）的溶液中，滴加于固定好的耳组织上方。用盖玻片覆盖耳组织，使用配备2倍物镜的荧光体视显微镜开始成像。
2. 对于长时间成像（超过2小时），将连接至含有抗坏血酸-林格缓冲液储液器的针头出口置于盖玻片下方，距离耳部约0.5 cm处。使用蠕动泵以1 µl/min的速度持续向盖玻片下的腔室输送抗坏血酸-林格缓冲液。
3. 将1X物镜（工作距离6 cm）更换为2X物镜（工作距离2 cm）。打开采集软件并配置荧光体视显微镜的设置。在相机设置中，选择12位作为图像色彩深度，将相机灰度值范围调整为0%（最小值）至5.1%（最大值），并将伽马校正设为2。
   1. 将采集增益设为1（最低值），荧光强度设为1,000（最大值），放大倍数设为280X–320X，并调整曝光时间以避免曝光过度或不足（曝光时间应小于1秒）。根据成像视野数量（通常为10至20个），采集周期的时间间隔应设置在1至2分钟之间。过短的时间间隔可能导致荧光漂白和光毒性。
4. 选择多个包含肿瘤细胞以及染色的细胞外基质蛋白的视野（例如 图3）。使用电动载物台，采集相应荧光通道（如 GFP 和荧光染料 647）的图像 图3随时间变化（例如 每2分钟一次。
5. 实验结束后，根据机构的动物使用指南对小鼠实施安乐死。本实验中，在实验结束时，对麻醉后的小鼠采用颈椎脱位法处死，随后进行放血（心脏灌流）。

6. 使用多光子显微镜进行活体成像

1. 使用硅脂在耳部周围构建一个直径约2 cm、高2-3 mm的圆形围堰，从耳基部开始，确保无泄漏点。用抗坏血酸-Ringer缓冲液填充该区域。
2. 将小鼠放置于载物台上，并连接加热垫（37 °C）。
3. 打开采集软件，并配置多光子显微镜的参数设置。
4. 选择最多四个包含肿瘤细胞和染色的细胞外基质蛋白（如图3所示）的不同视野。在此示例中，将Ti-蓝宝石激光器调至850 nm以获取GFP信号，随后使用647单光子激发以检测647荧光染料标记，并通过二次谐波生成（SHG）观察纤维状胶原。使用水浸HCX APO 20X物镜（数值孔径1.00，工作距离2 mm），每隔2分钟（例如）采集相应的荧光通道（如GFP和647荧光染料，见图3）及二次谐波生成图像。
5. 实验结束后，通过颈椎脱位处死麻醉小鼠，随后进行放血（心脏灌注）。

结果

迄今为止，由于免疫复合物的形成会导致染色背景高和免疫毒性，活体组织中的免疫染色通常并未被采用²⁰。这一问题通过预先阻断组织巨噬细胞上的 Fcγ 受体得以解决，从而使这些细胞对后续的间接强免疫染色“失明”。由于标记位于细胞外，可通过将组织浸入含有天然抗氧化剂缓冲液的等渗抗坏血酸溶液中，来控制光毒性和荧光染料漂白（图 1A）。自我们首次描述该方法以来⁵，我们进一步改进了抗漂白和抗光毒性的技术，使得荧光漂白现在不仅能够被抑制，而且可以被完全防止（图 1B）。该效果通过在固定耳片的腔室内，将耳片包埋于大量抗氧化剂（100 μl）中实现。需要注意的是，连续成像300秒相当于在每分钟采集500毫秒图像的情况下进行10小时的成像（为常规成像设置参数）。

图 1. 通过在林格液中以抗坏血酸盐替代氯化物，并将暴露的耳部包埋于100 μl该溶液中，可阻止光漂白和光毒性。(A) 组织首先用针对基底膜成分IV型胶原的生物素化抗体进行染色，随后用链霉亲和素-647（红色）检测染色信号，并在正常林格液（上图）或抗坏血酸盐-林格液（下图）中持续成像300秒。请注意，持续成像300秒相当于每分钟采集500毫秒图像时的10小时成像时间（常规成像设置）。像素强度值最亮的25%以绿色显示。(B) 免疫荧光衰减的定量分析（林格液中为50%，抗坏血酸盐-林格液中为0%）。数值已归一化至初始荧光强度。图像使用免疫荧光体视显微镜采集。A中的比例尺为100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

研究肿瘤转移细胞与肿瘤间质之间的相互作用，对于理解肿瘤细胞迁移及肿瘤免疫过程至关重要。这是因为肿瘤相关间质可占肿瘤质量的高达90%，并 actively 调控肿瘤的生长和转移扩散。²¹然而，关于基质如何驱动肿瘤细胞向淋巴管或血管迁移的作用机制，目前仍缺乏深入的认识 ²²这在一定程度上是由于活体成像基质蛋白主要局限于利用双光子显微镜中的二次谐波生成技术来观察成熟的纤维胶原纤维。²³因此，我们改进了用于可视化组织微环境（包括血管和淋巴管、周细胞、神经、肌肉及脂肪细胞）的方法，以实现对细胞外基质成分的直接可视化。通过针对基底膜成分（如胶原蛋白IV或perlecan）进行免疫染色后，可根据形态学特征区分多种结构。图 2A），然而，直接对特定细胞表面标志物进行染色， 例如 Lyve1图 2B 和 C）和podoplanin（图 2C），还可进一步区分初始的毛细淋巴管（Lyve1⁺）来自淋巴管收集器（Lyve1^-）。对皮肤中基质结合型CCL21的染色显示，该趋化因子沉积于淋巴管收集管的基底膜上，后者通过硫酸乙酰肝素蛋白聚糖perlecan的染色得以识别图 2D).

图 2. 正常小鼠耳朵活体染色示例。(A) 针对基底膜组分 perlecan 的染色显示所有血管和淋巴管、神经、肌纤维及脂肪细胞。(B) Lyve1 染色标记初始淋巴毛细血管网络。(C) Lyve1 与泛淋巴标记物 podoplanin 的共染色，显示初始淋巴管和集合淋巴管的网络结构。由于耳部真皮层脂肪细胞数量较少，不会遮蔽成像视野，因此可使用传统的落射荧光显微镜（无光学切片功能）对耳背侧真皮进行成像。(D) 淋巴管基底膜上的 CCL21 染色（绿色），基底膜本身经 perlecan 染色（红色）。图像由免疫荧光体视显微镜采集。图 A 和 B 的比例尺为 1 mm；图 C 为 100 μm；图 D 为 50 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

最重要的是，一些通常无法通过二次谐波生成（SHG）——经典的基质检测方法²³——检测到的结构蛋白也可以被可视化。例如，我们发现基质蛋白tenascin C（图3A），其在肿瘤发生、伤口愈合和炎症过程中表达¹⁹，其在肿瘤间质中的沉积位置与纤维状胶原蛋白不同（图3B）。这种基质异质性可能影响肿瘤细胞的分布和转移（图3C）。

图 3. 可使用多光子显微镜对耳背真皮进行活体成像。单个肿瘤 B16-F10 视野。肿瘤间质经 tenascin C 抗体标记，并用抗山羊-594 驴抗体检测染色信号。tenascin C（红色）网络的免疫荧光显示于A，通过二次谐波生成（SGH）检测到的纤维状胶原显示于B。这两个网络与肿瘤细胞（青色）叠加显示于C（合并图）。由 tenascin C 标记的新肿瘤基质与通过 SHG（绿色）检测到的纤维状胶原无重叠。该图像采集自 44 个 z 轴切片（z 步长为 1.0 μm），进行四次平均，以 16 位色深模式获取。图像由双光子显微镜采集。比例尺：100 μm。请点击此处查看此图的高清版本。

在对肿瘤基质的不同组分（例如 tenascin C 和 collagen IV）进行免疫标记后，我们能够识别出肿瘤基质方向性重塑的局部且突发的事件（视频 1）。肿瘤微环境中产生的力学作用可能导致肿瘤基质的扩张或收缩，进而引起肿瘤血管系统的重塑与延伸，其程度与我们此前在愈合伤口中所观察到的情况相似^11,24。

视频 1. 标记为胶原蛋白 IV（红色）和腱生蛋白 C（青色）的肿瘤基质扩张，拉长血管（箭头）并被动迁移三个肿瘤细胞（绿色）。在成像的 12 小时内，富含腱生蛋白 C 的肿瘤基质局部收缩，使血管（红色水平结构）移动约 100 μm。图像采用免疫荧光体视显微镜采集。点击此处观看视频。

使用多光子显微镜结合荧光染料标记存在技术难题，因为这些实验所用的光子通量会迅速漂白未受氧化保护的荧光染料²⁵。本文展示了我们能够在进行双光子延时显微成像的同时，对免疫标记的腱生蛋白C基质进行成像，即使在高光子密度的双光子显微镜下，荧光染料的光漂白程度也极低（视频2）。

视频 2. 双光子显微镜下十纤连蛋白 C 免疫荧光（红色）的低水平光漂白。 接种后第 9 天，在开放的耳背皮肤中对 B16-F10-GFP 肿瘤细胞（青色）进行成像。通过在成像组织上施加抗坏血酸-Ringer 缓冲液以保护荧光信号。二次谐波生成信号（绿色）与代表新生基质的十纤连蛋白 C 无重叠。图像采集持续 15 分钟，获取了 16 位色深、共 11 个 z 层面的图像，每个层面进行 4 次平均，z 步进为 1.9 μm。每 1 分 5 秒采集一次，共采集 6 个 z 平面。 点击此处观看视频。

我们还对免疫细胞与转移性肿瘤细胞的相互作用进行了成像。来自荷瘤小鼠的CMTPX标记脾细胞在静脉输注后8小时从肿瘤相关血管中渗出，侵入肿瘤基质，并通过形成长时间的细胞接触与肿瘤细胞发生主动相互作用（视频2）。在长达12小时的成像过程中，荧光染料647标记的IV型胶原结构对光漂白具有抵抗性。

视频 3. 来自荷瘤（B16-F10）小鼠的 CMTPX 标记脾细胞与单个肿瘤细胞（GFP- B16-F10）的相互作用。 脾细胞经静脉输注，并在组织染色胶原蛋白 IV 后进行观察。胶原蛋白 IV 为绿色（647），脾细胞为红色（CMTPX），B16-F10 为青色（GFP）。图像使用免疫荧光体视显微镜采集。视频时长为 12 小时。点击此处观看视频。

将新分离的肿瘤细胞接种于预先用IV型胶原染色的裸露耳部真皮组织上。我们观察到，部分细胞群在黏附于组织后，开始沿血管和脂肪细胞的基底膜进行集体迁移。

视频 4. 肿瘤细胞沿基底膜迁移。对正常耳部皮肤进行胶原蛋白 IV（647，红色）染色后，接种新鲜传代的 B16-F10-GFP 细胞，并连续成像 5 小时。部分黏附于组织的肿瘤细胞开始沿血管和脂肪细胞的基底膜进行集体迁移。图像使用免疫荧光体视显微镜采集。视频时长：5 小时。点击此处观看视频。

此外，由于耳部真皮几乎呈二维结构，我们可以利用快速荧光体视显微镜轻松获取大量数据，而无需使用速度较慢且成本较高的共聚焦或双光子显微镜。然而，也可将上述任何一种扫描显微镜方法与我们的活体免疫荧光制备样本结合使用（图3，视频1）。

讨论

意义

本文介绍了一种新型的活体显微成像方法，可实现对不同组织微环境组分（包括纤维状和网状基质蛋白）的高分辨率、动态可视化观察。该方法相较于现有的活体成像技术具有多项优势：（i）活体荧光成像已应用于微循环研究，例如追踪溶质从血液渗出或进入淋巴管的过程，但尚未与免疫染色技术结合使用；（ii）利用基因修饰报告小鼠可实现特定细胞类型的成像，但依赖于此类小鼠模型的可获得性（或需耗费大量精力构建新模型），并限制了可同时研究的相互作用细胞类型的数量；（iii）细胞外基质可通过二次谐波生成技术进行在体成像，但该技术仅能检测纤维状胶原蛋白，导致基底膜、纤连蛋白、腱生蛋白、生长因子、趋化因子以及组织中的糖胺聚糖等大量重要的细胞外组分无法被当前研究手段覆盖。本方法克服了上述局限性，能够在实时追踪血液和/或淋巴流动的同时，整合并进一步结合标准成像技术与针对其他细胞类型、组织结构、硫酸乙酰肝素结合生长因子（例如 VEGF²⁶）和趋化因子（CCL21^5,18及图2D）沉积物，或细胞外基质蛋白的免疫染色分析。

局限性

活体免疫荧光（IF）的落射荧光成像仅限于缺乏厚皮下组织（脂肪组织）的薄层皮肤瓣。尽管我们发现耳背真皮层最适合进行相对无创的耳部皮肤手术暴露，但落射荧光结合活体IF技术并不局限于耳部真皮，还可能应用于e.g.脚趾暴露的皮肤或新生小鼠的背部皮肤。免疫荧光（IF）中的快速抗体染色（15分钟）不依赖于被动扩散，而是需要功能性的淋巴引流和组织间液流动，因此当淋巴管被阻塞时，无法观察到染色信号²⁷。与此一致的是，淋巴管的染色强度高于渗漏的血管系统（如受损血管、微动脉）⁵。背侧与腹侧耳部皮肤瓣的分离是一种轻微的外科操作，但仍会造成部分毛细血管损伤以及多种组织细胞的死亡。当需要研究完全未受损的组织时，这可能成为一个问题，e.g.观察药物对细胞存活的轻微影响。此外，使用抗氧化剂以保护皮肤免受光毒性和光漂白的影响，会排除利用活体免疫荧光技术研究e.g.组织氧化应激或一氧化氮生物学过程的可能性。

最后，利用免疫复合物对组织驻留巨噬细胞进行盲化可激活这些细胞并产生影响 例如。 组织免疫反应与树突状细胞活化研究

修改与故障排除

为了研究组织氧化应激或一氧化氮生物学，必须用其他与组织相容且不干扰实验结果的介质替代抗坏血酸。同样，如果研究目的是组织免疫反应、树突状细胞活化与迁移的功能与机制，则应避免阻断皮肤免疫细胞上的 Fc 受体。这可以通过使用 Fc 片段被切除的二抗（F(ab)2 抗体片段），或采用生物素标记的抗体联合荧光标记链霉亲和素作为检测试剂来实现。

未来应用

我们介绍一种新颖且独特的活体免疫荧光技术，结合双光子显微镜下二次谐波产生（SHG）检测的纤维状及成熟胶原蛋白，用于对可移植皮肤肿瘤中细胞外基质的非纤维成分进行成像。相较于表层荧光成像，多光子（或多通道共聚焦）显微镜的一个优势在于能够实现z轴层扫成像，从而可对细胞外基质内发生的事件进行空间共定位分析。 例如 肿瘤侵入淋巴管或血管的过程，在标准落射荧光显微镜下通常只能通过侵袭细胞的形态学变化间接推断。该技术具有更广泛的应用潜力。例如，我们已利用活体免疫荧光成像技术研究了基于淋巴靶向光动力疗法导致淋巴管阻塞的机制。²⁷该方法的其他潜在应用包括但不限于炎症过程中皮肤免疫的研究、移植排斥反应机制的研究，以及肿瘤发生过程中血管和淋巴管生成方法的研究。

实验步骤中的关键环节

维持生理组织环境最关键的步骤是将腹侧皮肤和软骨与背侧真皮进行外科分离。切断或阻塞主要动脉或静脉将导致大量出血和局部组织缺氧，从而影响细胞对处理的反应以及细胞迁移⁸。使用手术胶固定耳朵时需格外小心，若将胶水洒在暴露的组织上，会因阻塞血管而导致组织永久性损伤。必须控制并维持小鼠体温在 37 °C。此外，异氟烷麻醉过程中需使用加湿的氧气，以确保实验期间眼睛和肺部保持适当的湿润。同时，抗坏血酸钠必须新鲜配制，并在使用前检测其 pH 值。

总之，这种活体免疫荧光技术将小鼠皮肤中生理功能的实时、局部测量与复杂细胞事件的分子成像相结合。此外，该方法具有广阔的应用前景，可轻松应用于 例如 研究血管和淋巴管发育后的机制，或可视化多种病原体引起的皮肤感染早期阶段。凭借其灵活性和高通量潜力，这种活体成像技术可显著推动生物学多个领域的研究进展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
小鼠品系
BALB/C 小鼠（8-12 周龄）	查尔斯河实验室		奥尔良，法国
C57/Bl6 小鼠（8–12 周）	Harlan		英国卡夏尔顿
细胞系
表达 OVA-GFP 的 B16 F10 黑色素瘤
麻醉维持
异氟烷	Minrad Inc.	2222	Minrad 公司，纽约州布法罗市
加湿输送系统	Rothhacher GmBH		伯尔尼，瑞士
直流温度控制系统	FHC 公司		鲍登，缅因州
体视显微镜
带电动载物台的荧光体视显微镜	M250 FA，徕卡显微系统 CMS 股份有限公司		德国韦茨拉尔
1倍物镜（线性系统放大倍数从7.5倍至160倍）	Leica Microsystems CMS GmbH		德国韦茨拉尔
2倍镜（线性系统放大倍数从15.6倍至320倍）	Leica Microsystems CMS GmbH		德国韦茨拉尔
由 LAS AF 软件控制的 DFC 350 FX 相机	Leica Microsystems CMS GmbH		德国韦茨拉尔
多光子显微镜
LEICA SP5，双光子倍增管，电动载物台	Leica Microsystems CMS GmbH		德国韦茨拉尔
HCX APO 20X/1.2 油镜
Chameleon Ultra 激光器
林格氏缓冲液（102 mM NaCl，5 mM KCl，2 mM CaCl₂）2，28 mM 乳酸钠）	B. Braun Medical AG	445968	森帕赫，德国
抑肽酶	弹性蛋白	AP92	密苏里州欧文斯维尔
凝血酶	Sigma-Aldrich	T7326-1KU	德国陶夫基兴
抗坏血酸钠	Sigma-Aldrich	11140-50G	德国陶夫基兴
针对人 IgG 制备的小鼠血清	Abcam	ab34834	英国剑桥
IV型胶原蛋白	Abcam	AB6581	英国剑桥
Perlecan	研发	ab79465	明尼阿波利斯，明尼苏达州
Tenascin C	研发	AF3358	明尼阿波利斯，明尼苏达州
Podoplanin	研发	AF3244	明尼阿波利斯，明尼苏达州
LYVE-1	Reliatech	103-PA50	沃尔芬巴ü德国 ttel
CCL21	研发	AF457	明尼阿波利斯，明尼苏达州
链霉亲和素 Pacific Blue	Invitrogen	S11222	纽约州格兰德岛
链霉亲和素 Alexa 647	Invitrogen	S21374	纽约州格兰德岛
链霉亲和素 Alexa 488	Invitrogen	S11223	纽约州格兰德岛
驴抗山羊594	Invitrogen	A21113	纽约州格兰德岛
驴抗兔594	Invitrogen	A21207	纽约州格兰德岛
CMTPX 细胞示踪剂	Lifetechnologies	C34552	加利福尼亚州卡尔斯巴德
Histocryl（外科胶水）	Braun Aesculap	1050060	德国特特林根
细胞培养试剂
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）	Gibco Invitrogen	E15-843	纽约州格兰德岛
胎牛血清（FBS	Gibco Invitrogen		纽约州格兰德岛
胰蛋白酶	Gibco Invitrogen	25300062	纽约州格兰德岛
PBS	Gibco Invitrogen		纽约州格兰德岛