使用共聚焦显微镜在活细胞内同时测量内吞体和胞质区室的 pH 值

摘要

目前有多种方法可用于测量细胞内pH值，但其中极少有方法能够同时测量细胞质和细胞器的pH值。本文详细描述了一种通过活细胞的比率成像技术，快速、准确地同时测定细胞质和囊泡pH值的方法。

摘要

细胞内pH值受到严格调控，已有报道指出细胞质与细胞器之间的pH存在差异¹。细胞pH的调控对于维持蛋白质、DNA和RNA合成、囊泡运输、细胞生长及细胞分裂等生理过程的稳态控制至关重要。细胞pH稳态的改变可导致有害的功能性变化，并促进多种疾病的发展²。目前已有多种测量细胞内pH的方法，但其中极少有方法能够同时检测细胞质和细胞器内的pH。本文详细描述了一种利用共聚焦显微镜对活细胞进行细胞质和细胞器pH同步测量的快速且准确的方法³。该目标通过使用两种具有选择性细胞区室分布特性的pH比率型荧光染料实现。例如，SNARF-1主要定位于细胞质内，而HPTS则特异性分布于内体/溶酶体细胞器中。尽管HPTS通常被用作细胞质pH指示剂，但该染料在通过胞饮作用被细胞摄取后，可特异性地标记内体-溶酶体通路上的囊泡^3,4。利用这些pH感应探针，可同时测量内吞区室和细胞质区室中的pH值。HPTS的最佳激发波长随pH变化而变化，而SNARF-1则是其最佳发射波长随pH变化。在将细胞负载SNARF-1和HPTS后，将其培养于不同pH校准的溶液中，以分别为每种探针构建pH标准曲线。通过共聚焦显微镜进行细胞成像，可有效消除伪影和背景噪声。由于HPTS具有特定的光谱特性，该探针更适用于轻度酸性内体区室的pH测量，或用于展示内体/溶酶体细胞器的碱化过程。该方法简化了数据分析流程，提高了pH测量的准确性，可用于研究细胞对外界刺激响应过程中pH调控相关的基础科学问题。

方案

1. 细胞pH校准用溶液的配制

1. 将以下化合物分别加入五个独立的 50 ml 锥形管中，以配制用于校准的 5 种溶液：
   • NaCl（1 ml 1 M NaCl）（1 M NaCl = 0.58 g 溶于 10 ml H₂O）₂0)
   • KCl（1 M KCl 溶液 6.75 ml）（1 M KCl = 0.75 g 溶于 10 ml H₂O）₂0)
   • 葡萄糖（1 ml，1 M） D-葡萄糖（1 M） D-葡萄糖 = 1.80 g 溶于 10 ml H₂O₂0)
   • MgS0₄ （0.05 ml 的 1 M MgSO₄）₄) (1 M MgSO₄₄= 1.20 g 溶于 10 ml H₂0)
   • 20 mM HEPES（1 ml 1 M HEPES）（1 M HEPES = 2.38 g 溶于 10 ml H₂O）₂0)
   • CaCl₂ （0.05 ml 的 1M CaCl₂）₂) (1 M CaCl₂₂= 1.47 克溶于 10 毫升 H₂0)
     所有溶液均使用双蒸水配制₂

结果

为了同时测量细胞内和内体/溶酶体区室的pH值，使用了比率型荧光pH传感探针SNARF-1和HPTS。SNARF-1局限于胞质溶胶区室，而HPTS可用于内体/溶酶体区室的比率型pH测量。通过将细胞负载HPTS 16小时，可实现其在内体/溶酶体中的选择性定位⁴。在图2A中展示了从负载pH传感探针的HT-1080细胞记录到的荧光典型示例。通过与Alexa 546标记的转铁蛋白（内体）或荧光溶酶体探针（Lysotracker Deep Red染料）共染色，证实了HPTS可标记内体和溶酶体两个区室。数据明确显示HPTS对这两个区室均有染色图2A。

采用上述方法，利用每种探针的校准曲线（图 2B 和 2C），根据每种pH敏感染料的比率特性测定了活细胞内的pH值。使用五种校准溶液将荧光强度转换为pH单位。每种pH传感探针的数据均报告了三次独立校准的结果（图 2C）。每个数据点代表在特定pH值下，HPTS在4.......

讨论

在对不同细胞区室进行活细胞成像时，定量测量 pH 值对于准确评估细胞在应对外界刺激时的 pH 变化至关重要。然而，目前仍存在的主要难题之一是如何简便且特异性地靶向特定细胞区室。在这方面，已有少数研究报道了使用 HPTS 作为细胞内 pH 指示剂，并通过电穿孔或显微注射将其导入细胞^8-10。但这些技术存在严重缺陷：电穿游戏副本导致细胞严重损伤，而显微注射则需要特殊设备和技术操作能力。值得关注的是，Hinton et al. 此前曾报道，HPTS 可通过胞饮作用被细胞摄取，并且 SNARF-1 与 HPTS 的联合使用可用于监测细胞质以及内体/溶酶体区室的 pH³。我们利用这一特性，在活体 HT-1080 细胞中记录了溶酶体/内体区室的 pH 变化。通过与荧光素标记的转铁蛋白（溶酶体/内体区室的标志物）或主要标记溶酶体的嗜酸性染料共染色，证实了 HPTS 定位于该区室，因此可作为可靠的 pH 指示剂图 2。此外，使用靶向不同细胞区室的多种细胞内 pH 调节剂表明，bafilomycin A1 可特异性升高囊泡内 pH，而不影响胞质 pH；相比之下.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
校准用溶液
氯化钠	Fischer	L-11621
氯化钾	Fischer	M-12445
D-葡萄糖（右旋糖）	Fischer	D16-1
硫酸镁	Fischer	M65-500
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
二水合氯化钙	Fischer	M-1612
去离子水	N/A	N/A
尼日尔菌素（Nigericin）	Calbiochem	481990	吸入或皮肤接触有毒
避光，4 °C 保存
培养皿 ∅ 35 mm	BD Biosciences	354456
pH 传感探针
8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS）	Life technologies	H-348	避光，室温保存
5-(和-6)-羧基 SNARF®-1, 乙酰氧基甲基酯，醋酸盐	Life technologies	C-1271	避光、防潮，-20 °C 保存
二甲基亚砜（DMSO）	Fischer	BP231-1	有害
磷酸盐缓冲液（PBS）100X
氯化钾	Fischer	M-12445	20 g
磷酸二氢钠	Fischer	S369-1	115 g
磷酸二氢钾	J.T Baker	3246-01	20 g
去离子水	N/A	N/A	加至 1 L
高压灭菌，调节 pH 至 7.4
磷酸盐缓冲液（PBS）1X
PBS 100X	N/A	N/A	50 ml
氯化钠	Fischer	L-11621	40.5 g
去离子水	N/A	N/A	加至 5 L
pH 调节剂
巴佛洛霉素 A1（Bafilomycin A1）	Sigma-Aldrich	B-1793
5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利（EIPA）	Sigma-Aldrich	A3085
氯化铵	Fischer	A649-500