目前有多种方法可用于测量细胞内pH值，但其中极少有方法能够同时测量细胞质和细胞器的pH值。本文详细描述了一种通过活细胞的比率成像技术，快速、准确地同时测定细胞质和囊泡pH值的方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
细胞内pH值受到严格调控，已有报道指出细胞质与细胞器之间的pH存在差异1。细胞pH的调控对于维持蛋白质、DNA和RNA合成、囊泡运输、细胞生长及细胞分裂等生理过程的稳态控制至关重要。细胞pH稳态的改变可导致有害的功能性变化，并促进多种疾病的发展2。目前已有多种测量细胞内pH的方法，但其中极少有方法能够同时检测细胞质和细胞器内的pH。本文详细描述了一种利用共聚焦显微镜对活细胞进行细胞质和细胞器pH同步测量的快速且准确的方法3。该目标通过使用两种具有选择性细胞区室分布特性的pH比率型荧光染料实现。例如，SNARF-1主要定位于细胞质内，而HPTS则特异性分布于内体/溶酶体细胞器中。尽管HPTS通常被用作细胞质pH指示剂，但该染料在通过胞饮作用被细胞摄取后，可特异性地标记内体-溶酶体通路上的囊泡3,4。利用这些pH感应探针，可同时测量内吞区室和细胞质区室中的pH值。HPTS的最佳激发波长随pH变化而变化，而SNARF-1则是其最佳发射波长随pH变化。在将细胞负载SNARF-1和HPTS后，将其培养于不同pH校准的溶液中，以分别为每种探针构建pH标准曲线。通过共聚焦显微镜进行细胞成像，可有效消除伪影和背景噪声。由于HPTS具有特定的光谱特性，该探针更适用于轻度酸性内体区室的pH测量，或用于展示内体/溶酶体细胞器的碱化过程。该方法简化了数据分析流程，提高了pH测量的准确性，可用于研究细胞对外界刺激响应过程中pH调控相关的基础科学问题。
方案
1. 细胞pH校准用溶液的配制
- 将以下化合物分别加入五个独立的 50 ml 锥形管中，以配制用于校准的 5 种溶液：
- NaCl（1 ml 1 M NaCl）（1 M NaCl = 0.58 g 溶于 10 ml H₂O）20)
- KCl（1 M KCl 溶液 6.75 ml）（1 M KCl = 0.75 g 溶于 10 ml H₂O）20)
- 葡萄糖（1 ml，1 M） D-葡萄糖（1 M） D-葡萄糖 = 1.80 g 溶于 10 ml H₂O20)
- MgS04 （0.05 ml 的 1 M MgSO₄）4) (1 M MgSO₄4= 1.20 g 溶于 10 ml H20)
- 20 mM HEPES（1 ml 1 M HEPES）（1 M HEPES = 2.38 g 溶于 10 ml H₂O）20)
- CaCl2 （0.05 ml 的 1M CaCl₂）2) (1 M CaCl₂2= 1.47 克溶于 10 毫升 H20)
所有溶液均使用双蒸水配制2O (ddH₂O)2O
- 用35 ml的ddH2O定容每种溶液2O，并使用磁力搅拌器搅拌直至溶解。
- 使用 1 N KOH 或 1 N HCl 调节每种溶液的 pH 值，使其分别为 5.5、6.0、6.5、7.0 和 7.5。然后用去离子水定容至终体积 50 ml。
- 称取5 mg尼日里菌素，加入670 μl无水乙醇，配制10 mM尼日里菌素储备液。
注意：尼日里菌素具有高毒性，必须小心操作（佩戴手套、安全眼镜和口罩）。通过倒置混匀溶液，直至尼日里菌素完全溶解。 - 向每种校准溶液中加入 0.05 ml 的 10 mM 尼日霉素（终浓度为 10 μM）。尼日霉素是一种离子载体，可增加细胞膜通透性，在细胞外 K⁺ 处于去极化浓度时，促使细胞内与细胞外 pH 值达到平衡。+.
- 校准溶液可在 4 °C 下保存长达 1 个月
2. 细胞准备
- 在生物安全柜中，将细胞以每皿 2 ml 的培养基接种于 35 mm × 10 mm 的培养皿中，培养基中需添加 10% 胎牛血清和抗生素。接种细胞数量应确保 24 小时后融合度约为 50%。
注：在我们的实验中，使用 HT-1080 细胞系，每培养皿接种 1 × 105 个细胞。 - 根据实验需求确定所需培养皿数量，并额外接种 5 个培养皿用于校准。
- 将培养皿置于 37 °C、5% CO2 的培养箱中培养至少 24 小时。
3. pH 传感探针的制备
- 用去离子水（ddH2O）配制1M的荧光pH探针8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（HPTS/吡兰宁）储备液。该溶液需在室温下保存，并避光。
- 将1 mg的5-(和-6)-羧基半萘罗丹明荧光素乙酰氧基甲酯乙酸盐（C-SNARF-1 AM；下文简称SNARF-1）溶于1.76 ml二甲基亚砜（DMSO）中，配制成1 mM的储备液。通过反复吹打充分混匀。SNARF-1溶液需在-20 °C保存，并避光。
4. 细胞标记
- 活细胞成像前16小时，向每个含有2 ml完全培养基的培养皿中加入2 μl的1 M HPTS储备液（终浓度为1 mM）。
- 将培养皿放回 培养箱。HPTS探针不能穿透细胞膜，因此要标记细胞器必须通过胞饮作用摄取该探针。此过程要求在含血清的培养基中进行HPTS孵育。
- 与HPTS孵育后，用无菌PBS洗涤细胞两次，并加入2 ml无血清培养基孵育至少2小时。SNARF-1的孵育必须在无血清培养基中进行，因为血清可能阻碍探针的摄取。
- 加入10 μl的1 mM SNARF-1储备液，使终浓度达到5 μM，在37°C弱光条件下孵育20分钟。C-SNARF-1的浓度和孵育时间可根据细胞类型有所不同。
- 孵育结束后，用无菌PBS洗涤细胞两次，并加入2 ml无血清培养基。
5. 添加pH调节剂
- 为评估该方法是否能够检测细胞内的 pH 变化，可使用不同的试剂来调节细胞内 pH：
- Bafilomycin A1，一种特异性 V-ATPase 抑制剂5
- Na+/H+ 交换体同工型 1 (NHE-1)6
- NH4Cl，一种可提高细胞内 pH 的弱碱7
- 制备上述试剂的储存液：
- Bafilomycin A1：将 10 μg 的 bafilomycin A1 加入 160 μl 的 DMSO 中，配制成 100 μM 的储存液
- EIPA：将 25 mg 的 EIPA 加入 1.67 ml 的甲醇中，得到终浓度为 50 mM 的溶液
- NH4Cl：将 0.53 g 氯化铵溶解于 10 ml 的 ddH2O 中，得到终浓度为 1 M 的溶液
注意：所有储存液均需保存在 4 °C，但 bafilomycin A1 必须保存在 -20 °C 并避光。 - 在不同的培养皿中，分别加入以下试剂之一：
- 2 μl 的 100 μM bafilomycin A1（终浓度为 100 nM）
- 1 μl 的 50 mM EIPA（终浓度为 25 μM）
- 40 μl 的 1 M NH4Cl（终浓度为 20 mM）
- 将细胞在 37 °C 下孵育 30 分钟。
- 进行图像采集。
6. 活细胞成像显微镜的规格及图像采集设置
- 使用配备电动 XY 载物台和环境控制（温度、湿度、CO2）载物台培养箱的光谱倒置扫描共聚焦显微镜，结合 40X 物镜进行活细胞成像。
- 本实验所用的共聚焦仪器（Olympus FV1000）配备以下组件：
- 405 nm 激光二极管
- 40 mW 氩离子激光器（458 nm、488 nm、515 nm）
- 氦氖激光器（543 nm）
- 萤石 10X 物镜，NA 0.4
- LUCPLFLN 40X 物镜，NA 0.60
- PLAPONSC PLAN APO 60X 油镜，NA 1.4
- 二向色镜 DM 405/458/488/543
- SDM 560 和 SDM 640 二向色滤光片
- BA655-755 发射滤光片
- 分光镜 BS20/80
- 用于图像采集与分析的数据分析软件
- 待载物台培养箱升温至 37 °C 且显微镜完成设置后，将预先用 HPTS 和 SNARF-1 孵育过的培养皿放入共聚焦显微镜的成像室中。
- 找到目标区域后，调整软件采集参数 图 1。
- 设置两个虚拟通道组。
- 启动第一阶段：HPTS 在 405 nm 激发，发射光收集范围为 505–525 nm；SNARF-1 在 543 nm 激发，发射光收集范围为 570–600 nm。
- 启动第二阶段：HPTS 在 458 nm 激发，发射光收集范围为 505–525 nm；SNARF-1 在 543 nm 激发，发射光收集范围为 640–650 nm。
- 共聚焦针孔默认设置为 175 μm，最佳针孔大小需手动调整至 300 μm。
- 通过堆叠连续的水平光学切片（800 × 800 像素，厚度为 0.4 μm）获取图像。
注意：使用40倍物镜可同时观察多个细胞，适用于细胞器观察。然而，采用60倍油镜可获得更佳的空间分辨率和信号强度。此外，两种染料之间不存在激发或发射光谱的串扰。
7. pH 传感探针的校准
- 校准前，从先前用 HPTS 和 SNARF-1 孵育的培养皿中移除培养基，用无菌 PBS 洗涤两次，然后加入 2 ml 五种校准溶液中的一种。
- 将培养皿放入共聚焦显微镜的载物台腔室中。
- 按照以下设置进行时间序列图像采集：
- 设定实验所需的图像数量及采集间隔时间。
注：我们通常采用每 1 分钟采集一次图像，持续最多 30 分钟。 - 编程控制快门在每次图像采集之间关闭。
- 设定实验所需的图像数量及采集间隔时间。
- 在电子表格软件中记录每分钟的荧光强度，并确定荧光强度达到稳定的时间点。细胞内 pH 通常在 15–20 分钟后趋于稳定。
- 对每种剩余的校准溶液，使用新的培养皿重复步骤 7.1 至 7.4。
8. 数据采集
- 完成校准后，从随机选择的4-5个视野中获取样本数据，每个视野包含15-20个细胞。每个视野获取两幅图像：一幅用于HPTS标记（囊泡），另一幅用于SNARF-1标记（细胞质）。
- 从两种探针的荧光图像中数字减去背景荧光（细胞外区域）。使用二值掩膜从各自存储的图像中选择标记的囊泡和细胞质。针对每种pH传感探针，以数值尺度（0-4,095灰度级）测量荧光强度。计算细胞器或细胞质内所有像素的平均强度，并利用这些值计算荧光比值。
9. 数据分析
- 市面上有多种商业化的软件包可用于数据分析。i.e. Fluoview Software。
- 在电子表格中记录数值，并按如下方法计算荧光比值：对于 HPTS，R = (F458 nm/F405 nm)；对于 SNARF-1，R = (F644 nm/F584 nm)。
- 使用 GraphPad Prism 等科学绘图软件绘制数据图，图中应以荧光比值（Y 轴）随 pH 值（X 轴）的变化关系表示。采用非线性回归进行曲线拟合。
- 按照步骤 8.2 所述方法采集样品的荧光强度，并计算荧光比值。利用标准校准曲线将比值转换为 pH 值。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为了同时测量细胞内和内体/溶酶体区室的pH值，使用了比率型荧光pH传感探针SNARF-1和HPTS。SNARF-1局限于胞质溶胶区室，而HPTS可用于内体/溶酶体区室的比率型pH测量。通过将细胞负载HPTS 16小时，可实现其在内体/溶酶体中的选择性定位4。在图2A中展示了从负载pH传感探针的HT-1080细胞记录到的荧光典型示例。通过与Alexa 546标记的转铁蛋白（内体）或荧光溶酶体探针（Lysotracker Deep Red染料）共染色，证实了HPTS可标记内体和溶酶体两个区室。数据明确显示HPTS对这两个区室均有染色图2A。
采用上述方法，利用每种探针的校准曲线（图 2B 和 2C），根据每种pH敏感染料的比率特性测定了活细胞内的pH值。使用五种校准溶液将荧光强度转换为pH单位。每种pH传感探针的数据均报告了三次独立校准的结果（图 2C）。每个数据点代表在特定pH值下，HPTS在4...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在对不同细胞区室进行活细胞成像时，定量测量 pH 值对于准确评估细胞在应对外界刺激时的 pH 变化至关重要。然而，目前仍存在的主要难题之一是如何简便且特异性地靶向特定细胞区室。在这方面，已有少数研究报道了使用 HPTS 作为细胞内 pH 指示剂，并通过电穿孔或显微注射将其导入细胞8-10。但这些技术存在严重缺陷：电穿游戏副本导致细胞严重损伤，而显微注射则需要特殊设备和技术操作能力。值得关注的是，Hinton et al. 此前曾报道，HPTS 可通过胞饮作用被细胞摄取，并且 SNARF-1 与 HPTS 的联合使用可用于监测细胞质以及内体/溶酶体区室的 pH3。我们利用这一特性，在活体 HT-1080 细胞中记录了溶酶体/内体区室的 pH 变化。通过与荧光素标记的转铁蛋白（溶酶体/内体区室的标志物）或主要标记溶酶体的嗜酸性染料共染色，证实了 HPTS 定位于该区室，因此可作为可靠的 pH 指示剂图 2。此外，使用靶向不同细胞区室的多种细胞内 pH 调节剂表明，bafilomycin A1 可特异性升高囊泡内 pH，而不影响胞质 pH；相比之下...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
感谢 Gilles Dupuis 博士对本文手稿的审阅。
资金
本工作由加拿大卫生研究院（Canadian Institutes for Health Research）资助，资助号为 MOP-126173。C.M.D. 是由魁北克健康研究基金会（Fonds de la Recherche en Santé, FRSQ）资助的艾蒂安·勒贝尔临床研究中心（Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel）的成员。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 校准用溶液 | |||
| 氯化钠 | Fischer | L-11621 | |
| 氯化钾 | Fischer | M-12445 | |
| D-葡萄糖（右旋糖） | Fischer | D16-1 | |
| 硫酸镁 | Fischer | M65-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 二水合氯化钙 | Fischer | M-1612 | |
| 去离子水 | N/A | N/A | |
| 尼日尔菌素（Nigericin） | Calbiochem | 481990 | 吸入或皮肤接触有毒 |
| 避光，4 °C 保存 | |||
| 培养皿 ∅ 35 mm | BD Biosciences | 354456 | |
| pH 传感探针 | |||
| 8-羟基芘-1,3,6-三磺酸（HPTS） | Life technologies | H-348 | 避光，室温保存 |
| 5-(和-6)-羧基 SNARF®-1, 乙酰氧基甲基酯，醋酸盐 | Life technologies | C-1271 | 避光、防潮，-20 °C 保存 |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Fischer | BP231-1 | 有害 |
| 磷酸盐缓冲液（PBS）100X | |||
| 氯化钾 | Fischer | M-12445 | 20 g |
| 磷酸二氢钠 | Fischer | S369-1 | 115 g |
| 磷酸二氢钾 | J.T Baker | 3246-01 | 20 g |
| 去离子水 | N/A | N/A | 加至 1 L |
| 高压灭菌，调节 pH 至 7.4 | |||
| 磷酸盐缓冲液（PBS）1X | |||
| PBS 100X | N/A | N/A | 50 ml |
| 氯化钠 | Fischer | L-11621 | 40.5 g |
| 去离子水 | N/A | N/A | 加至 5 L |
| pH 调节剂 | |||
| 巴佛洛霉素 A1（Bafilomycin A1） | Sigma-Aldrich | B-1793 | |
| 5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利（EIPA） | Sigma-Aldrich | A3085 | |
| 氯化铵 | Fischer | A649-500 |
参考文献
- Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
- Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
- Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
- Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
- Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
- Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
- Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
- Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
