大鼠视网膜全层标本的免疫组织化学与钙成像方法

摘要

免疫组织化学实验方案用于研究特定蛋白质在视网膜中的定位。钙成像技术用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。

摘要

本文中，我们介绍了进行以下实验所需的工具、试剂和具体操作步骤：1）成功制备用于免疫组织化学的全层视网膜样本；2）对视网膜神经节细胞中电压门控钙通道（VGCC）介导的钙信号进行钙成像研究。我们所描述的钙成像方法可避免视网膜神经节细胞层中移位的无长突细胞非特异性染料加载问题。

引言

视网膜神经节细胞（RGCs）表达L型、N型、P/Q型和T型电压门控钙通道（VGCC），该结论基于对全细胞钙通道电流中这些组分进行药理学阻断的研究^1,2。VGCC是跨膜多聚体蛋白，参与神经递质释放、基因转录、细胞调控以及突触可塑性^3,4,5。功能性的VGCC至少由三类不同的亚基组成：形成孔道的大跨膜α₁亚基，决定通道的生物物理特性和药理学特性；主要位于细胞外的辅助性α₂δ亚基；以及细胞内的β亚基。后两种亚基可与不同的α₁亚基形成异源复合物，从而调节通道的门控动力学及其向细胞膜的转运⁶。

近几十年来，已有多种技术被用于研究蛋白质表达，如免疫组织化学、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和流式细胞术。这些技术需要使用特异性抗体来检测目标蛋白质，为特定蛋白质在不同组织中的定位与分布提供了强有力的工具。当缺乏现成的抗体或某种蛋白质的表达水平较低时，可采用检测和定量特定蛋白质mRNA表达水平的技术作为替代方法，例如RNA印迹分析、逆转录PCR、实时定量逆转录PCR、原位杂交、cDNA微阵列以及核糖核酸酶保护实验⁷。然而，这类分子生物学技术的一个局限性在于必须事先明确目标基因的序列信息。

为了在视网膜中定位蛋白质，可在视网膜全层标本上进行免疫组织化学染色。由于视网膜神经节细胞（RGCs）易于接近，全层制备为研究特定蛋白质在RGC胞体及其轴突中的定位提供了优良的平台。

除了定位之外，还可以通过钙成像技术来展示视网膜神经节细胞（RGCs）中电压门控钙通道（VGCCs）的某些功能特性。本文描述了一种钙成像实验方案，通过使用钙离子指示剂染料对RGCs进行选择性标记，以检测细胞内钙离子动态变化。利用亚型特异性的钙通道阻断剂，可分离出不同VGCC亚型在细胞不同区域钙信号中的贡献。

此处所述的钙成像技术最具优势的特点之一，是能够同时且独立地记录多个视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突的活动。尽管许多生理学技术（如全细胞膜片钳记录）能够以高时间分辨率记录膜电流，但无法区分这些电流的胞体或轴突来源，且每次只能记录单个神经元。多电极阵列（MEAs）能够同时记录多个细胞的动作电位，但既无法检测也无法区分例如不同亚型的钙通道的激活情况。  MEAs 主要记录靠近特定电极的细胞⁸，并倾向于记录产生较大动作电位的细胞⁹。光学成像方法提供了一种替代策略，可实现对整个细胞群体的同时且独立的记录，并能与单细胞微电极、膜片钳记录以及 MEA 记录所获得的信息相互整合。  尽管此处描述的钙成像技术用于研究 RGCs 的钙动力学，但膜片钳和 MEA 技术也可并行使用，以进一步阐明 RGCs 的离子电流和放电特性。

由于移位的无长突细胞约占小鼠视网膜节细胞层神经元总数的60%¹⁰，我们的目标是采用一种选择性地将视网膜神经节细胞（RGCs）用合成钙指示剂染料进行标记的负载技术，用于视网膜全层铺片制备。尽管合成钙指示剂染料为研究细胞内钙动力学提供了优良的平台，但其广泛应用受到限制，原因在于难以有效地将特定神经网络中的特定神经元群体进行有效负载。  已有多种技术被用于对整群细胞进行负载，例如批量负载¹¹和电穿孔^8,12，然而这些技术无法区分特定的细胞类型。基因编码的钙指示剂能够实现对特定细胞群体的选择性标记，但此类方法需要构建转基因动物模型¹³。本技术描述了一种通过视神经残端注射钙指示剂染料，在视网膜全层铺片制备中选择性标记RGCs的方法。

综上所述，本文所述的结构与生理学技术为研究电压门控钙通道（VGCCs）在视网膜神经节细胞及其轴突中钙信号的定位与作用提供了平台。 

方案

所有实验均遵循美国卫生公共服务部发布的《实验动物福利指南》以及加州大学洛杉矶分校（UCLA）动物研究委员会关于实验动物护理与使用的政策进行。实验使用3至5周龄的雄性和雌性成年斯普拉格-道利大鼠（Charles River Lab，马萨诸塞州威尔明顿）。

1. 全片视网膜制备与免疫组织化学实验方案的动物与组织准备

1. 准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端非常细的镊子、剪刀、纤维素滤纸、塑料移液管和显微镜载玻片。
2. 在密闭容器中通过1-3%异氟烷深度麻醉大鼠使其安乐死，随后使用断头器断头。用虹膜剪剪下眼球并置于含有细胞外溶液的培养皿中。推荐使用Hibernate A、Ames培养基或生理溶液。
3. [如需用Fluo-4逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs）则执行此可选步骤]。按照步骤2.3-2.4所述进行Fluo-4标记。
4. 在解剖显微镜下（光照强度：1.6 × 10⁸ 光子/mm²⋅秒），剪除眼球前部以去除角膜。用镊子从视网膜内表面移除晶状体和玻璃体。去除玻璃体时，用一把镊子牢固夹住巩膜以固定眼球，用另一把镊子从视网膜周边向中心方向轻轻剥离玻璃体基部。此阶段制备完成的组织称为眼杯（eyecup），用于制备冷冻切片。有关冷冻切片的更多细节可参见文献^14,15。
5. 从眼杯上取下视网膜，然后做四个切口，使视网膜能够平展铺开。将视网膜感光细胞层朝上轻轻贴附在载玻片上。向视网膜滴加一滴溶液，并在其上放置纤维素滤纸。待视网膜附着于滤纸上后，将其重新放回溶液中。如有需要，可用毛刷或镊子轻轻压平视网膜。
6. 将整体视网膜放入4%多聚甲醛（PFA）中固定10-15分钟。
7. 用0.1 M磷酸盐缓冲液（PB，pH 7.4）清洗整体视网膜三次，每次30分钟。在含0.3% Triton-X 100和0.1% NaN₃的0.1 M PB中，加入5%正常山羊血清或驴血清，于4 °C封闭过夜。为节约封闭液和抗体用量，建议所有步骤使用500 μl的终体积。
8. 次日，在4 °C下用一抗孵育整体视网膜5-7天。最佳稀释比例需由使用者自行确定。
9. 用0.1 M PB清洗视网膜三次，每次30分钟，然后在4 °C下用针对一抗宿主物种的荧光标记二抗（稀释比例1:1,000）避光孵育过夜。
10. 最后用PB清洗三次，每次30分钟，将视网膜封片于封片剂中。用指甲油密封盖玻片以便长期保存。样品储存于4 °C并避光。

2. 使用钙离子指示剂染料对大鼠全层视网膜中神经节细胞及其轴突进行标记

1. 配制 1,000 ml 哺乳动物任氏液，其中含有（单位为 mM）125 NaCl、3 KCl、2 CaCl₂、1.25 NaH₂PO₄、1 MgCl₂、25 NaHCO₃ 和 10 葡萄糖，并用 95% O₂/5% CO^­₂ 混合气体饱和。
2. 按照步骤 1.2–1.4 所述进行解剖操作。
3. 为了将钙离子指示剂染料加载至视网膜神经节细胞（RGCs）及其轴突中，使用注射器将 0.5 μl 的 Fluo-4 五钾盐（40 mM 储存液，溶于 H­₂O）注入视神经残端，注射位置位于眼球后方约 1 mm 处。为检测神经节细胞内 [Ca²⁺]_i 的动态升高，应选用高亲和力的指示剂，例如 K_d 为 345 nM 的 Fluo-4，其为最优选择。Fluo-4 还具有极高的量子效率优势，与钙结合后荧光发射强度可增加 >100 倍。
4. 将眼杯置于用 95% O₂/5% CO^­₂ 混合气体饱和的哺乳动物任氏液中，在室温避光条件下孵育 1 小时。

3. 视网膜神经节细胞及其轴突的钙成像实验方案。

1. 按照步骤1.1-1.4所述去除眼球、晶状体和玻璃体。从眼杯中分离视网膜并将其分为四个象限。取其中一个象限，神经节细胞面朝上固定于载玻片上，并使用网格切片固定器（harp slice grid）加以稳定。其余组织块则在以95% O₂ 与5% CO₂ 混合气体饱和的哺乳动物任氏液（mammalian Ringer's）中保持暗适应状态₂/ 5% CO₂^­₂ 置于冰上以备后续使用。
2. 用哺乳动物林格氏液灌流记录室，并持续以95% O₂₂/5% CO₂₂.
3. 在显微镜下观察组织。实验在室温（约 23 °C）下进行，或通过加热载物台、加热标本下方的水浴，或向标本表面施加暖风，以达到生理温度。
   注意：许多细胞功能受温度调控，而温度在维持细胞内稳态中起着关键作用¹⁶然而，引入加温措施可能会加快光漂白速率、培养基蒸发以及由热膨胀引起的焦平面漂移¹⁷使用室温可降低 Fluo-4 的细胞内区室化¹⁸.
4. 进行两组配对的高K对照⁺ 在无药物条件下刺激脉冲。通过提高[K⁺]_o 从3 mM到60 mM，每次脉冲持续33秒，通过八通道重力驱动的灌流系统激活电压门控钙通道（VGCCs）。降低Na⁺ 通过添加 57 mM 来维持高 K+ 条件下的等渗状态⁺ 溶液
5. 利用广谱或特异性钙通道阻断剂评估不同电压门控钙通道（VGCCs）对钙信号的贡献。例如，加入非特异性钙通道阻断剂钴离子后钙信号的降低，可半定量地反映VGCCs在高K⁺诱导的钙信号中的作用⁺-诱发的钙信号
6. 通过在目标RGCs周围设置感兴趣区域（ROI）来获取荧光强度值（图2).
7. 标准化第二次高钾刺激引起的荧光强度变化⁺ 峰值与第一次高钾引起的变化相对应⁺ 峰。随后，在测试特异性钙通道阻滞剂时，仅在第二次高钾刺激期间给予药物⁺ 一对脉冲的峰值，并将该峰值相对于第一个峰值进行归一化，以测量药物对高K⁺诱导的反应的影响⁺ 峰值，将第二个K的振幅除以⁺ 峰值与第一个峰值进行比较。应针对这些数值与其配对的高K对照组进行分析。⁺ 在无药物存在时测得的峰
8. 以5秒间隔采集图像。为避免光漂白，应尽可能降低激光激发强度。使用氩离子激光器的488 nm谱线进行激发，同时通过505 nm长通滤光片由光电倍增管收集荧光发射信号。

结果

使用特异性抗体进行免疫标记可为研究特定蛋白质在视网膜中的定位提供平台，而钙成像技术则可用于研究电压门控钙通道（VGCCs）对视网膜神经节细胞及其轴突内钙动力学的贡献。

通过使用针对视网膜神经节细胞蛋白 RBPMS（RNA 结合蛋白，多剪接型）的抗体，该抗体可特异性标记 RGCs¹⁹，我们能够证实 Fluo-4 的标记仅限于神经节细胞（图 1）。 stump 注射法并不会像人们预期的那样标记所有神经节细胞。

通过商业供应商针对RBPMS多肽（RBPMS_4-24）N端序列GGKAEKENTPSEANLQEEEVR制备了兔多克隆抗体（表1）。RBPMS在哺乳动物中高度保守，用于免疫的多肽序列在小鼠、大鼠、猴和人中完全相同（NCBI蛋白质数据库，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein）。免疫后收...

讨论

本文中，我们描述了两种不同的技术：1）免疫组织化学法，用于显示Fluo-4在视网膜铺片中节细胞的定位；2）钙成像法，用于分析视网膜节细胞及其轴突中的钙动力学。

利用全组织样本进行免疫组织化学染色已被用于揭示蛋白质在啮齿类动物视网膜中的定位^20-23。然而，该方法存在一些局限性。染色质量在很大程度上依赖于抗体对其相应抗原的识别能力，以及其穿透视网膜组织到达特定目标层的能力。这些问题可通过延长一抗孵育时间至最多七天、增加Triton-X的浓度，和/或在孵育过程中去除滤纸以促进抗体穿过神经节细胞层和感光细胞层来改善。另一个局限性在于固定的时间和浓度。某些抗体在组织固定一小时时效果更佳，而其他抗体则需要更短的固定时间。同样，某些抗体在4%多聚甲醛（PFA）固定条件下效果最佳，而另一些抗体在较低浓度下表现更好。我们建议使用者根据具体实验条件优化固定时间与浓度、孵育时间、Triton-X浓度以及一抗浓度，以获得最佳结果。

钙成像被用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。通过灌流电压门控钙通道（VGCC）阻断剂，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直剪刀	WPI	14124-G	解剖工具
直镊	WPI	501985	解剖工具
弯头虹膜剪	WPI	504487	解剖工具
纤维素滤纸	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	培养基
Vectashield	Vector	H-1000	荧光封片剂
Fluo-4 五钾盐	Invitrogen	F-14200
异氟烷	雅培实验室	05260-05	麻醉剂
显微镜载玻片	费舍尔科技	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal 显微镜	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) 物镜	Zeiss
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体	分子探针	A-11034	二抗
RBPMS	ProSci, Poway, CA		由商业供应商（ProSci, Poway, CA）针对 RBPMS 多肽 N 端序列（RBPMS4-24），GGKAEKENTPSEANLQEEEVR，制备了兔多克隆抗体  。