大鼠视网膜全层标本的免疫组织化学与钙成像方法

摘要

免疫组织化学实验方案用于研究特定蛋白质在视网膜中的定位。钙成像技术用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。

摘要

本文中，我们介绍了进行以下实验所需的工具、试剂和具体操作步骤：1）成功制备用于免疫组织化学的全层视网膜样本；2）对视网膜神经节细胞中电压门控钙通道（VGCC）介导的钙信号进行钙成像研究。我们所描述的钙成像方法可避免视网膜神经节细胞层中移位的无长突细胞非特异性染料加载问题。

引言

视网膜神经节细胞（RGCs）表达L型、N型、P/Q型和T型电压门控钙通道（VGCC），该结论基于对全细胞钙通道电流中这些组分进行药理学阻断的研究^1,2。VGCC是跨膜多聚体蛋白，参与神经递质释放、基因转录、细胞调控以及突触可塑性^3,4,5。功能性的VGCC至少由三类不同的亚基组成：形成孔道的大跨膜α₁亚基，决定通道的生物物理特性和药理学特性；主要位于细胞外的辅助性α₂δ亚基；以及细胞内的β亚基。后两种亚基可与不同的α₁亚基形成异源复合物，从而调节通道的门控动力学及其向细胞膜的转运⁶。

近几十年来，已有多种技术被用于研究蛋白质表达，如免疫组织化学、酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹分析和流式细胞术。这些技术需要使用特异性抗体来检测目标蛋白质，为特定蛋白质在不同组织中的定位与分布提供了强有力的工具。当缺乏现成的抗体或某种蛋白质的表达水平较低时，可采用检测和定量特定蛋白质mRNA表达水平的技术作为替代方法，例如RNA印迹分析、逆转录PCR、实时定量逆转录PCR、原位杂交、cDNA微阵列以及核糖核酸酶保护实验⁷。然而，这类分子生物学技术的一个局限性在于必须事先明确目标基因的序列信息。

为了在视网膜中定位蛋白质，可在视网膜全层标本上进行免疫组织化学染色。由于视网膜神经....

方案

所有实验均遵循美国卫生公共服务部发布的《实验动物福利指南》以及加州大学洛杉矶分校（UCLA）动物研究委员会关于实验动物护理与使用的政策进行。实验使用3至5周龄的雄性和雌性成年斯普拉格-道利大鼠（Charles River Lab，马萨诸塞州威尔明顿）。

1. 全片视网膜制备与免疫组织化学实验方案的动物与组织准备

1. 准备以下材料和工具：解剖显微镜、两把尖端非常细的镊子、剪刀、纤维素滤纸、塑料移液管和显微镜载玻片。
2. 在密闭容器中通过1-3%异氟烷深度麻醉大鼠使其安乐死，随后使用断头器断头。用虹膜剪剪下眼球并置于含有细胞外溶液的培养皿中。推荐使用Hibernate A、Ames培养基或生理溶液。
3. [如需用Fluo-4逆行标记视网膜神经节细胞（RGCs）则执行此可选步骤]。按照步骤2.3-2.4所述进行Fluo-4标记。
4. 在解剖显微镜下（光照强度：1.6 × 10⁸ 光子/mm²⋅秒），剪除眼球前部以去除角膜。用镊子从视网膜内表面移除晶状体和玻璃体。去除玻璃体时，用一把镊子牢固夹住巩膜以固定眼球，用另一把镊子从视网膜周边向中心方向轻轻剥离玻璃体基部。此阶段制备完成的组织称为眼杯（eyecup），用于制备冷冻切片。有关冷冻切片的更多细节可参见文献^14,15。
5. 从眼杯上取下视网膜，然后做四个切口，使视网膜能够平展铺开。将视....

结果

使用特异性抗体进行免疫标记可为研究特定感兴趣蛋白在视网膜中的定位提供平台，而钙成像技术则可用于研究电压门控钙通道（VGCCs）对视网膜神经节细胞及其轴突中钙动力学的贡献。

通过使用针对视网膜神经节细胞蛋白 RBPMS（RNA 结合蛋白，多剪接型）的抗体，该抗体可特异性标记视网膜神经节细胞（RGCs）¹⁹，我们证实 Fluo-4 的标记局限于神经节细胞（图 1）。 stump 注射并不会如该技术所预期的那样标记所有神经节细胞。

通过商业供应商针对RBPMS多肽（RBPMS_4-24）N端序列GGKAEKENTPSEANLQEEEVR制备了兔多克隆抗体（表1）。RBPMS在哺乳动物中高度保守，用于免疫的多肽序列在小鼠、大鼠、猴和人中完全相同（NCBI蛋白质数据库，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein.......

讨论

本文中，我们描述了两种不同的技术：1）免疫组织化学法，用于显示Fluo-4在视网膜铺片中节细胞的定位；2）钙成像法，用于分析视网膜节细胞及其轴突中的钙动力学。

利用全组织样本进行免疫组织化学染色已被用于揭示蛋白质在啮齿类动物视网膜中的定位^20-23。然而，该方法存在一些局限性。染色质量在很大程度上依赖于抗体对其相应抗原的识别能力，以及其穿透视网膜组织到达特定目标层的能力。这些问题可通过延长一抗孵育时间至最多七天、增加Triton-X的浓度，和/或在孵育过程中去除滤纸以促进抗体穿过神经节细胞层和感光细胞层来改善。另一个局限性在于固定的时间和浓度。某些抗体在组织固定一小时时效果更佳，而其他抗体则需要更短的固定时间。同样，某些抗体在4%多聚甲醛（PFA）固定条件下效果最佳，而另一些抗体在较低浓度下表现更好。我们建议使用者根据具体实验条件优化固定时间与浓度、孵育时间、Triton-X浓度以及一抗浓度，以获得最佳结果。

钙成像被用于研究视网膜神经节细胞及其轴突中的钙动力学。通过灌流电压门控钙通道（VGCC）阻断剂，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
直剪刀	WPI	14124-G	解剖工具
直镊	WPI	501985	解剖工具
弯头虹膜剪	WPI	504487	解剖工具
纤维素滤纸	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	培养基
Vectashield	Vector	H-1000	荧光封片剂
Fluo-4 五钾盐	Invitrogen	F-14200
异氟烷	雅培实验室	05260-05	麻醉剂
显微镜载玻片	费舍尔科技	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal 显微镜	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) 物镜	Zeiss
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG (H+L) 抗体	分子探针	A-11034	二抗
RBPMS	ProSci, Poway, CA		由商业供应商（ProSci, Poway, CA）针对 RBPMS 多肽 N 端序列（RBPMS4-24），GGKAEKENTPSEANLQEEEVR，制备了兔多克隆抗体  。