本研究的总体目标是展示在零售熟食店环境中食源性致病菌Listeria monocytogenes潜在的交叉污染机制。该方法可应用于多种不同环境，用于追踪病原体污染情况。
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摘要
摘要
零售环境中食源性致病菌的交叉污染是一个重要的公共卫生问题，会增加食源性疾病的风险。即食（RTE）加工食品，如熟食肉类、奶酪，以及在某些情况下的新鲜农产品，曾因受到单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）等病原体污染而引发食源性疾病暴发。就L. monocytogenes而言，熟食切片机通常是交叉污染的主要来源。本研究的目的是使用一种荧光化合物模拟细菌污染，并在零售环境中追踪该污染的传播路径。为此设计了一个模拟熟食厨房，以再现真实的零售环境。将荧光化合物接种到熟食肉上，并招募志愿者完成一系列类似于食品零售员工日常操作的任务。志愿者被要求对肉类进行切片、包装，并将其储存在熟食冷藏柜中。通过在模拟零售环境中对特定区域进行拭子采样，并使用分光光度计测量采样区域的光密度，从而追踪潜在的交叉污染情况。结果表明，冷藏柜（i.e. 熟食展示柜）把手以及切片机的多个部位具有最高的交叉污染风险。本研究的结果可用于为零售业员工开发更具针对性的培训材料。此外，类似的方法也可用于追踪食品生产环境（e.g. 小型农场）、医院、养老院、邮轮和酒店中的微生物污染情况。
引言
食源性致病菌在食品制备环境中的交叉污染，尤其是在零售环节，已成为一个主要问题，原因是来自多种来源（包括肉类和蔬菜）的食源性疾病风险日益增加1-5。细菌性致病菌通常通过受污染的食品进入零售环境6。在零售环节制备的即食食品尤其令人关注，因为这些食品在食用前通常不再进行任何干预或处理（例如烹饪或加热）7。此外，存在于受污染即食食品上的致病菌还可能传播至零售环境中的其他食品或食品接触表面。
尽管交叉污染可能发生在几乎所有类型的零售食品环境中，但熟食店尤其值得关注，原因在于即食型熟食肉类与病原体之间的关联 单核细胞增生李斯特菌2根据美国食品药品监督管理局（FDA）和美国农业部食品安全检验局（USDA-FSIS）开展的风险评估分析，受污染的即食肉类制品可能引发了90%的单核细胞增生李斯特菌病病例。 一种罕见但严重的人类疾病，由 单核细胞增生李斯特菌 - 美国8通常，零售和餐饮服务机构切片的熟食肉类与较高的风险相关 单核细胞增生李斯特菌 与生产商在经美国农业部检验的工厂中预先切片的熟食肉制品相比9这可能是因为食品操作人员、输入的生原料或加工后可能被污染的食品在处理后引入病原体的可能性增加7总体而言，李斯特菌病约占美国每年因食源性疾病导致的死亡病例的28%。
由于在零售环节切片的熟食肉类中单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）污染的风险增加，熟食切片机本身已被确认为零售环境中食源性致病菌表面传播的重要因素2,10。正如Sheen1所指出，切片是食用前的最后一道加工步骤；因此， 熟食切片机应被视为理解与预防交叉污染的关键控制点1。
本研究的总体目标是开发一种方法，利用荧光粉末（如Glo Germ）追踪零售熟食环境中的污染情况。Glo Germ是一种荧光化合物，已被用于模拟细菌交叉污染及卫生操作过程11,12。本研究旨在追踪病原体从受污染肉类向切片机、周围环境以及其他熟食肉类的转移过程。了解污染传播途径对于制定有效的干预措施以及面向零售员工和管理人员的教育培训材料至关重要。类似的方法也可用于模拟其他加工环境（例如禽类和牛肉加工）、农场以及医院中的病原体传播过程。
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方案
1. 标准曲线
- 称取 37.5 mg 荧光粉末，溶于 6 ml 200 proof 乙醇中。用 200 proof 乙醇对该溶液进行 2 倍系列稀释。
- 将所有样品涡旋振荡 10 秒，测定 370 nm 处的吸光度。
- 计算每 1 ml 200 proof 乙醇中所含荧光粉末的量（mg）。
- 绘制标准曲线（y 轴为浓度，单位 mg/ml，x 轴为 370 nm 处的吸光度），以显示吸光度与荧光粉末浓度之间的关系。
2. 用荧光粉末接种熟食肉类（博洛尼亚香肠）
- 使用干净的刀具和砧板将熟食肉切成约 100 mm 厚的样品。制备三个样品，分别标记为 A、B 和 C。
- 用略微湿润的干净海绵将荧光粉末均匀地涂抹在样品 A 上。确保粉末在肉样表面分布均匀。样品 B 和 C 不接种荧光粉末。
- 用塑料薄膜包裹样品，并用胶带将涂有荧光粉末的样品标记为“A”，其余两个样品标记为 B 和 C。
- 将样品放入模拟厨房中温度维持在 4 °C 的熟食柜或冰箱内，以进行后续实验。
3. 模拟熟食厨房制备
- 在厨房中提供清洁手套和70%乙醇喷雾。
- 在切片区域周围安装带有13 W灯泡的黑色紧凑型荧光灯。
- 准备一块5 cm × 5 cm的铝箔剪切模板，用于取样拭子定位。
- 准备含有6 ml 95%乙醇的15 ml离心管。
4. 视频设置
在模拟熟食店的三个关键位置安装视频摄像机，以同时观察所有区域。在模拟切片机操作程序（如第5个方案所述）之前开启摄像机，并同时分析结果（如第7个方案所述）。
5. 模拟熟食切片操作以追踪交叉污染
为了增加样本量并纳入变异因素，在获得各机构机构审查委员会（IRB）对研究方案的批准后，开始招募参与者以开展本研究。参与者可以是具有或不具有零售熟食环境工作经验的大学生。确保每位参与者进入熟食区后立即佩戴手套。在研究开始前，在黑色荧光灯下拍摄“干预前”照片；研究结束后，拍摄“干预后”照片。向每位参与者提供清晰的书面和口头指导，内容如下：
- 前往冰箱。
- 取出标有“A”的肉类。
- 拆开肉类包装，并保留塑料薄膜。
- 将肉类放置于切片机的载物托盘上。
- 使用肉类固定夹固定肉类。
- 打开电源开关。
- 调节切片机刻度旋钮至“2”档。
- 切下5片肉类并将其放置于熟食纸上。
- 关闭电源开关，并松开肉类固定夹。
- 将切好的肉片放入标有“A”的塑料袋中。
- 重新用塑料薄膜包裹肉类“A”，并放回冰箱。
- 对标有“B”和“C”的肉类重复步骤2-11。
6. 荧光粉末的定量分析
在熟食厨房完成模拟切片（第5.4节）后，对荧光粉末进行定量。操作步骤如下：
- 使用无菌的 5 cm × 5 cm 铝箔模板，将其放置在图1中标记的区域。
- 取一支浸有95%乙醇的无菌海藻酸钙棉拭子擦拭该区域，并将拭子放入装有6 ml 95%乙醇的无菌聚丙烯管中。
- 充分涡旋振荡该管，然后转移至玻璃比色皿，在370 nm处测定吸光度。
- 参照标准曲线，使用以下方程计算荧光粉末含量（y）：y = mx + b，其中x为吸光度，m为标准曲线的斜率，b为截距。
- 为对数据进行归一化处理，使用以下公式计算所取样面积中荧光粉末的百分比：
7. 视频分析
在参与者完成任务5.1-5.12时进行录像。将录像同步并保存至DVD光盘，以便同时查看各个角度的画面。观看录像以记录手部接触次数（志愿者接触模拟熟食店环境中不同表面的次数），并在熟食店环境中的各种表面上进行统计（4名不同的研究人员将独立分析完整的数据集）。
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结果
图1展示了志愿者完成指定任务后被取样的切片机区域。通过录像记录志愿者手部接触这些不同表面的平均频率。四名不同的观察者对手部接触频率进行分析并取平均值。结果如图2所示。数据显示，肉类握柄、熟食包装膜、熟食肉类和熟食纸张的手部接触频率最高（平均接触次数为8–14次）。
随后，对志愿者完成操作后切片机和熟食厨房各部件上荧光粉末的残留量进行了定量分析。对冰箱把手、操作台、肉夹、切片刀以及托架托盘的各个部件等表面进行了取样。如图3所示，结果表明，冰箱把手上的污染程度最高（约25%）。肉夹和背板的污染程度也较高，均约为12%。
类似的分析可用于多种不同环境，通过使用荧光化合物（如荧光粉末）来追踪污染情况。该分析可进一步帮助识别需要加强清洁的关键区域，并有助于创建有效的培训材料。
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讨论
本研究的总体目标是展示细菌交叉污染如何在零售熟食环境中发生，以便制定控制和降低食源性疾病风险的策略。零售熟食环境尤其存在较高的单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）污染风险。美国农业部食品安全检验局（USDA-FSIS）报告指出，在零售店切片的熟食肉类与联邦检验机构切片并包装的熟食肉类相比，与李斯特菌病的关联性高出七倍9。
已有专利报道了基于荧光的方法用于检测胴体表面的粪便污染13,14。独立研究曾利用荧光化合物识别肉类上的粪便污染以及禽类加工厂中的交叉污染源15-17。其他研究人员开展过与本研究类似的工作，他们将荧光化合物涂覆在火鸡胸肉块上并进行切片，以确定高污染区域18。结果显示，运输托盘、背板、刀片护罩、刀具以及收集区域均受到污染。然而，该研究未对污染浓度进行定量评估。本研究所记录的方法可对问题区域的污染量进行定量分析。
本研究中，研究人员使用了Glo Germ粉末—— 一种在紫外光下可发...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
作者谨向所有参与本研究的食品安全实验室学生和志愿者表示感谢。本研究由美国农业部国家综合食品安全计划（NIFSI）资助（项目编号 #10507316）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光示踪粉 | Glo Germ Co | 购自供应商 | |
| 乙醇 | Sigma | E7023 | |
| 永久性记号笔 | Sharpie | 从文具店购买 | |
| 手套 | VWR | 82026-424 | |
| 熟食肉类 | NA | NA | 普通杂货店购买的波洛尼亚香肠卷 |
| 砧板 | NA | NA | 普通厨房用砧板 |
| 刀具 | NA | NA | 普通厨房用刀具 |
| 5 cm × 5 cm 无菌模板 | NA | NA | 将铝箔裁剪成 5 cm × 5 cm 的模板并进行灭菌处理 |
| 15 ml 聚丙烯离心管 | VWR | 89039-664 | |
| 棉签 | Puritan | 25-806 | |
| 玻璃比色皿 | VWR | 470019-186 | |
| 涡旋振荡器 | VWR | 58816-121 | |
| 便携式摄像机 | Flip Ultra HD | NA | 在线购买 |
| 熟食切片机 | Bizerba | SE-12 | |
| 熟食冷藏柜 | True Company | TDBD-722 | |
| 天平 | NA | ||
| 分光光度计 | Milton Roy Company | NA | Spectronic 20D |
参考文献
- Sheen, S., Hwang, C. A. Mathematical modeling the cross-contamination of Escherichia coli O157: H7 on the surface of ready-to-eat meat product while slicing. Food Microbiol. 27, 37-43 (2010).
- Crandall, P., Neal, J. Jr, et al. Minimizing the risk of Listeria monocytogenes in retail delis by developing employee focused, cost effective training. Agric. Food Anal. Bacteriol. 1, 159-174 (2011).
- Koo, O. K., Sirsat, S. A., et al. Physical and chemical control of Salmonella in ready-to-eat products. Agric. Food Anal. Bacteriol. 2, 56-68 (2012).
- Hanning, I. B., Johnson, M. G., Ricke, S. C. Precut prepackaged lettuce: a risk for listeriosis? Foodborne Pathog. Dis. 5, 731-746 (2008).
- Hanning, I. B., Nutt, J. D., Ricke, S. C. Salmonellosis outbreaks in the United States due to fresh produce: sources and potential intervention measures. Foodborne Pathog. Dis. 6, 635-648 (2008).
- Zhu, M., Du, M., et al. Control of Listeria monocytogenes contamination in ready‐to‐eat meat products. Compr. Rev. Food Sci. Food Safety. 4, 34-42 (2005).
- Lianou, A., Sofos, J. N. A review of the incidence and transmission of Listeria monocytogenes in ready-to-eat products in retail and food service environments. J. Food Protect. 70, 2172-2198 (2007).
- Quantitative risk assessment of relative risk to public health from foodborne Listeria monocytogenes among selected categories of ready-to-eat foods. , http://www.fda.gov/downloads(2003 Forthcoming.
- Endrikat, S., Gallagher, D., et al. A comparative risk assessment for Listeria monocytogenes in prepackaged versus retail-sliced deli meat. J. Food Protect. 73, 612-619 (2010).
- Pradhan, A. K., Ivanek, R., et al. Comparison of public health impact of Listeria monocytogenes product-to-product and environment-to-product contamination of deli meats at retail. J. Food Protect. 74, 1860-1868 (2011).
- Jones, C. K. Handwashing Technique Analysis. Patent number 5900067. , (1999).
- Gibson, K. E., Koo, O. K., et al. Observation and relative quantification of cross-contamination within a mock retail delicatessen environment. Food Control. 31, 116-124 (2013).
- Xiao, M., Zheng, G., et al. Method and System for Fecal Detection. Patent number 5821546. , (1998).
- Waldroup, A., Kirby, J. Method and System for Fecal Detection. Patent number 5621215. , (1997).
- Ashby, K. D., Wen, J., et al. Fluorescence of dietary porphyrins as a basis for real-time detection of fecal contamination on meat. J. Agric. Food Chem. 51, 3502-3507 (2003).
- Cabrera-Diaz, E., Moseley, T. M., et al. Fluorescent protein marked Escherichia coli biotype I strains as surrogates for enteric pathogens in validation of beef carcass interventions. J. Food Protect. 72, 295-303 (2009).
- Byrd, J., Hargis, B., et al. Fluorescent marker for the detection of crop and upper gastrointestinal leakage in poultry processing plants. Poult. Sci. 81, 70-74 (2002).
- Vorst, K. L., Todd, E. C., et al. Transfer of Listeria monocytogenes during mechanical slicing of turkey breast bologna, and salami. J. Food Protect. 69, 619-626 (2006).
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