方法文章

分析单个人类胚胎干细胞通过定量RT-PCR

DOI：

10.3791/51408

⸱

2014年5月29日

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

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单细胞基因表达分析是需要了解干细胞的异质性。

摘要

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干细胞群的异质性阻碍了干细胞生物学的详细了解，如他们的分化倾向朝着不同的谱系。单细胞转录组分析可以为解剖的个体差异的新方法。我们已经开发了单细胞定量RT-PCR法，并证实了该方法在几个基因表达谱效果很好。在单细胞水平上，每一个人类胚胎干细胞，按OCT4 :: EGFP阳性细胞，具有较高的表达OCT4，但不同级别NANOG的表达。我们的单细胞基因表达分析应该是有用的审问人口异质性。

引言

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大多数高等真核生物的人群是异质从而汇集与人口分析，它往往是难以解释其细胞的功能。在一个人口单个细胞可能是细微的差别，而这些差别能有重要影响整个人群1，2的特性和功能。特别是，人胚胎干细胞（胚胎干细胞）被称为是异质的，这会导致不同程度的多能性和多样化的电位，以微妙独特的方式3，4谱系规范。例如，不同的细胞表面抗原，可用于分类的未分化的多能干细胞，5和奥斯汀史密斯组建议在小鼠胚胎干细胞不同级别的多能性，根据其形态，分化倾向和信号转导通路6的依赖性。这种现象被推测在人类胚胎NIC干细胞7。而整体的研究，不同的干细胞系，而不是单个单个干细胞中进行的，它可能是非常有趣的，分析不同层次的多能性的在单细胞水平，这可能会影响其分化能力，向全体细胞谱系。

细胞和分子异质性可以通过转录分析来决定的，这就是所谓的"单细胞转录组"，并强调定量基因表达水平8-10新方法。用于在单个细胞的基因表达水平的分析，我们开发了单细胞定量RT-PCR的一个简单的，但健壮的协议。我们证实了我们的协议的有效性和可行性通过比较单个细胞裂解物各一半以及人类胚胎干细胞的连续稀释的总RNA，产生最小的技术的变化和差异。进一步，我们使用了遗传记者线隔离同质population利用基因打靶系统的人类胚胎干细胞。用于靶向OCT4基因座（OCT4-2A-EGFP-PGK-迪普 ​​罗构造）和一对TALE....

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方案

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一个96孔板的1。下游

  1. 混合1μL单细胞DNase1至9微升单细胞裂解液。
  2. 把10μl的混合溶液中的96孔PCR板各孔中。

2，拆卸人类胚胎干细胞的分离纯化流式细胞仪

  1. 从60毫米培养皿用1ml的Accutase 20分钟，在37℃，这是中和人ES介质分离OCT4 :: EGFP的胚胎干细胞系。
  2. 制备的细胞群体在1ml的FACS缓冲液和细胞调整至1×10 6细胞/ ml。
  3. 通过一个35微米的细胞过滤帽筒通过细胞样本。
  4. 细胞分选之前存储管冰。

的FACS纯化的单细胞在96孔平板的每个孔3。裂解

  1. 排序的样品用于在细胞分选器与受过训练的操作者的EGFP阳性细胞。把单细胞成单细胞Lysis/DNase1解决方案在96孔PCR板。如果有必要，96孔板与样本可以被存储在一个-80℃的冰柜少于一个月。
  2. 孵育样品5分钟，在室温下细胞裂解。
  3. 加入1μl终止液终止反应溶解。
  4. 孵育2分钟，在室温。

4，反转录

  1. 添加到20μm的SMA-T15，SMA-A中的每个0.5微升等分。
  2. 加4μl的5X缓冲液，....

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结果

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高效率和强大的单细胞RNA扩增

为了尽量减少人类胚胎干细胞中的转录变化，我们使用的OCT4 :: EGFP的胚胎干细胞克隆流式细胞仪净化。 OCT4 :: EGFP阳性细胞分选入96孔板后，每个小区被裂解在裂解缓冲液中，并用SMA-T15（GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT）引物和具有SMA-A（ACATGTATCCGGATGTGGG锚固转换的poly（A）+ RNA到cDNA全长）通过使用智能模板切换技术。多余的寡核苷酸消化ExoSAP-IT试剂，再其次是cDNA的PCR扩增带SMA-P2（GACATGTATCCGGATGT）13 18-20周期。我们所用的扩增的cDNA，以使该模板用于定量RT-PCR（ 图1）。有几项研究对全长RNA测序和RNA变性的测量通过使用数量细胞的低和单个电池单元3，14，15。到O乌尔知识，我们人类胚胎干细胞稀释的总RNA（微克量）下降到纳米和微微克水平和应用我们的协议，以评估低量的总RN.......

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讨论

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单细胞基因分析可能是一个主要的工具来预测一个单细胞的功能或整个人口。由于技术的限制，全基因谱分析已经被限制人口的平均水平。中的基因表达模式和个体的细胞和亚群之间的水平的变化已经被提出来引起错误的解释。这些不同的细胞方面可以在人类胚胎干细胞被发现和他们的异质性造成微妙的不同能力维持多能性和命运规范的过程。

我们开发并验证了单细胞定量RT-PCR方法，这对于在单个细胞的基因表达研究提供了简单，但强大的方法。为了验证我们的协议，FACS纯化的单细胞裂解物分成一半，并应用到该方法中用于检查的精确度。我们与单细胞的结果被证实与连续稀释的总RNA样品，我们发现一致的结果between细胞裂解物的各一半（ 图4）。但是，与我们的协议，有一些限制。我们可以检测到过40个基因的表达水平，但特异性转录信息（ 如非多聚腺苷酸化的mRNA，miRNA的，未知的成绩单等），可能无法检测到。此外，还有一些机会，以优化引物对靶基因。公认的引物长度通常为18-22个碱基对。的引物的退火温度一般工作在50-60℃的范围。引物的GC含量可以受引物的退火的能力。在本文.......

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披露

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作者什么都没有透露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢李实验室的成员对稿件有价值的讨论。在李的实验室工作是由纽约干细胞基金会罗伯逊研究奖和美国马里兰干细胞研究基金（TEDCO）资助。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔 PCR 板USA scientific1402-8900
Ambion 细胞裂解试剂盒Life Technologies4458235
SMARTScribe 逆转录酶Clonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNA 聚合酶高保真Invitrogen11304
10 mM dNTP 混合物、PCR 级Invitrogen18427
SYBR 通用 2X 预混液Kapa 生物系统KR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS 缓冲液45 ml PBS、5 ml a-MEM、100 和 mu;l DNase，过滤灭菌
35 &μ;m 细胞过滤器盖管BD Biosciences 352235

参考文献

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  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generi....

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qRT PCR OCT4 EGFP

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