单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。
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摘要
摘要
干细胞群体的异质性阻碍了对干细胞生物学特性的深入理解，例如其向不同谱系分化的倾向。单细胞转录组分析可为解析个体差异提供一种新方法。我们已开发出单细胞qRT-PCR技术，并证实该方法在多个基因表达谱中均具有良好效果。在单细胞水平上，通过OCT4::EGFP阳性细胞分选得到的每个人类胚胎干细胞均表现出高水平的OCT4表达，但NANOG的表达水平各不相同。我们的单细胞基因表达检测技术应有助于深入探究群体异质性。
引言
大多数高等真核生物群体具有异质性，因此在分析混合群体时，常常难以准确解读其细胞特征。群体内的单个细胞可能存在细微差异，而这些差异可能对整个群体的性质和功能产生重要影响1,2。特别是人类胚胎干细胞（hESCs）已知具有异质性，这导致其在多能性水平以及向不同谱系分化的潜能方面表现出精细而多样的差异3,4。例如，不同的细胞表面抗原可用于对未分化的多能干细胞进行分类5，而Austin Smith研究组则根据形态、分化倾向以及信号通路依赖性，提出了小鼠胚胎干细胞中存在不同层次的多能性状态6。这一现象也被推测存在于人类胚胎干细胞中7。然而，迄今为止的大多数研究是在不同的干细胞系之间进行的，而非针对单个细胞；因此，在单细胞水平上分析多能性的不同层次，可能对理解其向所有体细胞谱系分化的潜能具有重要意义。
细胞和分子异质性可通过转录谱分析来确定，这一方法被称为“单细胞转录组”，强调了定量基因表达水平的新策略8-10。为了在单个细胞中分析基因表达水平，我们开发了一种简单但稳健的单细胞定量RT-PCR方案。通过比较单个细胞裂解液的两半部分以及人胚胎干细胞（hESCs）总RNA的连续稀释样本，验证了该方案的有效性和可行性，结果显示技术变异和差异极小。此外，我们利用基因报告细胞系，通过基因靶向系统分离出高度均一的hESCs群体。 靶向OCT4位点的供体质粒（OCT4-2A-EGFP-PGK-Puro构建体）和一对TALEN质粒被使用11。通过我们的核转染、克隆筛选方案将供体质粒和一对TALEN质粒导入hESCs（H9，WA09），并依据常规方案进行hESCs的培养与维持12。我们证实该基因报告细胞系在OCT4::EGFP hESCs中可表达EGFP以反映OCT4的表达情况。
我们的结果表明，单个hESC（通过OCT4::EGFP强阳性细胞分选获得）具有高水平的OCT4表达，但NANOG表达水平各不相同。因此，我们的单细胞基因表达检测方法可用于研究多能干细胞群体的异质性。
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方案
1. 96 孔板的制备
- 将1 μl单细胞DNase1与9 μl单细胞裂解液混合。
- 将10 μl混合液加入96孔PCR板的每个孔中。
2. 脱落 hESC 以进行 FACS 纯化
- 用 1 ml Accutase 在 37 °C 下处理 60 mm 培养皿中的 OCT4::EGFP ES 细胞系 20 分钟，使其脱离，随后用人胚胎干细胞培养基中和。
- 将细胞悬液加入 1 ml FACS 缓冲液中，调整细胞浓度至 1 × 106 个细胞/ml。
- 用 35 μm 滤膜帽管过滤细胞样品。
- 细胞分选前将样品管置于冰上保存。
3. 裂解96孔板中每个孔内经FACS纯化的单个细胞
- 使用经过培训的操作员在细胞分选仪上对样本进行EGFP阳性细胞的分选。将单个细胞放入96孔PCR板中的单细胞裂解/DNase1溶液中。如有必要，含有样本的96孔板可在-80 °C超低温冰箱中保存不超过一个月。
- 室温孵育5分钟，使细胞裂解。
- 加入1 μl终止液以终止裂解反应。
- 室温孵育2分钟。
4. 逆转录
- 向每个样品中加入 0.5 μl 的 20 μM SMA-T15、SMA-A。
- 向每个孔中加入 4 μl 5X 缓冲液、2 μl DTT、1 μl 逆转录酶和 1 μl dNTP。
- 在热循环仪中进行逆转录反应。
- 将热循环程序设置为 42 °C × 90 分钟，然后在 85 °C × 5 分钟条件下使逆转录酶失活。
5. 扩增
- 向每个反转录样品中加入 4 μl ExoSAP-IT 试剂。
- 将样品在 37 °C 下孵育 15 分钟，然后在 80 °C 下孵育 15 分钟，以灭活 ExoSAP-IT 试剂。
- 用 SMA-p2（2 nM）配制 PCR 反应混合液
- 向每个反转录样品中加入 10 μl PCR 反应混合液。
- 进行扩增反应，包括 20 个循环的变性（94 °C 持续 30 秒）、退火（57 °C 持续 30 秒）和延伸（68 °C 持续 10 分钟）。
6. qRT-PCR 实验操作
- 向每个孔中加入 10 μl 的 2X SYBR Green PCR 主混合液、1 μl 扩增的 cDNA、2 nM 引物以及 7 μl 水。
- 设置程序：95 °C 3 秒，60 °C 30 秒，循环 40 次。
- 为避免技术误差，每个样本设置两个重复。
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结果
高效且稳健的单细胞RNA扩增
为了最大限度减少人胚胎干细胞（hESCs）间的转录差异，我们采用 OCT4::EGFP 人胚胎干细胞克隆进行荧光激活细胞分选（FACS）纯化。将 OCT4::EGFP 阳性细胞分选至96孔板后，每个细胞在裂解缓冲液中裂解，并利用SMA-T15（GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT）引物和SMA-A（ACATGTATCCGGATGTGGG）锚定，通过SMART模板转换技术将poly(A)+ RNA逆转录为全长cDNA。过量的寡核苷酸使用ExoSAP-IT试剂消化，随后对cDNA进行18–20个循环的PCR扩增，所用引物为SMA-p2（GACATGTATCCGGATGT）13。我们将扩增得到的cDNA作为模板用于qRT-PCR分析（图1）。已有若干研究利用少量细胞或单细胞进行全长RNA测序及RNA变异性的测定3,14,15<...
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讨论
单细胞基因表达谱分析可能成为预测单个细胞或整个细胞群体功能的重要工具。由于技术限制，全基因表达谱分析一直局限于群体平均水平。个体细胞之间以及亚群之间的基因表达模式和水平的差异可能导致错误的解释。这种细胞异质性在人胚胎干细胞（hESCs）中尤为明显，其异质性导致维持多能性及命运决定过程的能力存在细微差异。
我们开发并验证了单细胞定量RT-PCR方法，该方法为单个细胞中基因表达的研究提供了一种简单但稳健的技术。为验证本方案，我们将经FACS纯化的单细胞裂解液均分为两份，并应用该方法检测其准确性。单细胞实验结果与系列稀释的总RNA样本结果一致，且每份细胞裂解液的两部分之间也显示出一致的结果（图4）。然而，本方案仍存在一些局限性。我们能够检测超过40个基因的表达水平，但某些特定的转录信息（例如 非多聚腺苷酸化mRNA、miRNA、未知转录本等）可能无法检测。此外，针对目标基因的引物仍有优化空间。通常接受的引物长度为18-22个碱基对，引物的退火温度一般在50-60 °C范围内。引物的GC含量可能影响其退火能力。本文中，我们在qPCR中省略...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢李实验室成员对本文手稿提出的宝贵讨论。李实验室的工作得到了纽约干细胞基金会罗伯特森研究员奖和马里兰干细胞研究基金（TEDCO）资助项目的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 96孔PCR板 | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion细胞裂解试剂盒 | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe逆转录酶 | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum高保真DNA聚合酶 | Invitrogen | 11304 | |
| 10 mM dNTP混合液，PCR级 | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR通用2X预混液 | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS缓冲液 | 45 ml PBS，5 ml a-MEM，100 μl DNase，过滤除菌 | ||
| 35 μm细胞滤网带盖离心管 | BD Biosciences | 352235 |
参考文献
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重印与许可
