本文介绍了一种用于在大体积农业用水中对食源性病原体进行一体化浓缩、富集及终点比色检测的方案。该方法通过改良莫尔棉签（Modified Moore Swabs, MMS）对水样进行过滤，利用选择性或非选择性培养基进行富集，并采用嵌有细菌显色比色底物的纸质分析装置（µPAD）进行检测。
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本文内容
摘要
摘要
本方案描述了从大体积（10 L）农业用水中快速进行比色法检测大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella spp.）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。在此方法中，水样通过无菌改良摩尔棉签（MMS）进行过滤，MMS由封装在塑料卡匣中的简单纱布滤膜组成 ，以实现细菌的浓缩。过滤后，在MMS中对目标细菌进行非选择性或选择性增菌。为实现目标细菌的比色检测，随后使用嵌入了细菌指示性底物的纸质分析装置（µPADs）对增菌液进行检测。每种底物与目标细菌特有的酶发生反应，生成可在µPAD上肉眼观察到的有色产物（定性检测）。或者，可使用常见的扫描或摄影设备获取反应后µPAD的数字图像，并利用ImageJ软件进行分析，从而实现对结果更客观、标准化的解读。尽管生化筛查程序旨在鉴定上述细菌病原体，但在某些情况下，背景微生物群产生的酶或比色底物的降解可能导致假阳性结果。因此，需采用更具区分能力的诊断方法进行确认。尽管如此，该细菌浓缩与检测平台成本低廉、灵敏度高（检测限为0.1 CFU/mL）、操作简便且快速（浓缩、增菌和检测过程在约24 小时内完成），适合作为农业用水微生物质量的初步筛查方法。
引言
为了减轻食源性疾病的负担，快速检测食源性致病因子，最好在实地环境中进行检测，这一点至关重要。常见的食源性细菌病原体检测策略包括生化特征分析、选择性和鉴别性培养、免疫学分离与检测以及分子检测。然而，这些方法受限于偶然性的污染、检测样本量小、食源性致病菌浓度通常较低、处理时间较长，和/或不适用于现场环境。此外，许多食品基质中的化合物会抑制检测和诊断应用。为提高微生物检出的可能性，美国食品药品监督管理局（FDA）建议，检测与大量新鲜农产品表面接触或作为农产品污染传播媒介的农业用水（如清洗水和灌溉水），是直接检测食品的一种可行替代方案1。即便如此，由于自然环境中病原体载量通常较低，加之代表性农业水样本身的稀释效应，使得病原体浓缩的样品前处理方法变得至关重要。此类方法需要采集大量水样（≥10 L），实现充分的病原体浓缩，并能与后续检测策略相兼容。
改良摩尔拭子（Modified Moore swabs，MMS）是一种廉价、简单且耐用的装置，用于从大量水样（≥10 L）中浓缩细菌2-4。MMS由一个塑料盒组成，盒内填充纱布，作为粗滤器，在使用蠕动泵将大量水样泵入盒内时起到过滤作用。MMS是一种非选择性的细菌浓缩方法（浓缩倍数≥10倍），可捕获处理液样本中的有机和无机颗粒物质，包括微生物。MMS对目标微生物具有优异的浓缩效果，这很可能是因为微生物通常附着在悬浮固体中的粉砂-黏土组分或有机微聚集体上3。MMS的坚固设计克服了其....
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方案
1. 使用MMS从大量农业用水中浓缩细菌
- 膜过滤装置（MMS）制备
- 裁剪一块4层纱布，尺寸为40 × 12 cm的矩形。
- 沿两个轴向将纱布对折，得到一个20 × 6 cm的矩形。
- 沿长边方向紧密卷起纱布，形成一个长约6 cm、直径约3 cm的圆柱形拭子。
- 将纱布拭子用铝箔包裹后进行高压灭菌，切勿对MMS卡盒进行高压灭菌。通过将卡盒浸泡于10%家用漂白剂中30分钟进行去污，并随后将其浸泡于硫代硫酸钠五水合物（Na2S2O3·5H2O）溶液（50 mg/L，用无菌水配制）中15分钟，以中和残留氯。
- 将拭子插入MMS卡盒中。
注意：若使用非一次性MMS卡盒，请起始使用一块80 × 22 cm的4层纱布，将其折叠为40 × 11 cm，再卷成一个长约11 cm、直径约6 cm的圆柱体。 - 组装MMS装置。
- 将乙烯基管路连接至MMS两侧的出液口，确保管路完全贴合出液口，并将管路固定于蠕动泵上。确保蠕动泵上游的管路长度足以完成采样。
- 细菌浓缩
- 通过以高速运行蠕动泵，采集至少10 L农业用水样品。
- 采样完成后，将蠕动泵进样端从....
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结果
如本方案所述，使用MMS（图1）浓缩细菌可在约15-20分钟内完成。MMS由丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）材料制成，包含两个独立部件：一个盖子和一个滤筒，两者均集成了带旋塞的装置，用于插入圆柱形纱布拭子（图1A）。将两个部件拧合在一起即组成完整的MMS（图1B）。基于MMS的处理过程由电池驱动的蠕动泵推动，使得样品可在野外条件下进行浓缩。通过结合MMS浓缩、选择性增菌（18-24小时）以及µPAD检测技术，可对农业用水中的重要食源性致病菌和指示微生物（包括E. coli、Salmonella spp. 和 L. monocytogenes）进行快速（约24小时）、简便且低成本的筛查。采用本方案，这些目标细菌的检测限可低至0.1 CFU/mL。µPAD检测基于对细菌特异性酶的检测，这些酶可与比色底物发生反应并产生颜色变化（图2）。检测普通E. coli（非E. coli O157:H7）的检测体系会产生蓝绿色产物（.......
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讨论
本方案描述了一种用于检测农业用水中 E. coli、Salmonella spp. 和 L. monocytogenes 的整合方法。该方法结合了使用磁性微球（MMS）从大体积（10 L）农业用水中浓缩细菌、细菌增菌以及利用微流控纸基分析装置（µPADs）进行指示细菌存在的比色检测。MMS 程序能够应对水样中高含量的颗粒物，同时将细菌浓缩 10 倍，操作稳定、简便，适合经最低限度培训的人员在野外应用，且成本极低。通过引入细菌增菌步骤，可检测活菌，显著提高方法的灵敏度。增菌过程可扩增待测目标物，结合选择性培养基使用，还能抑制样本中非目标微生物的生长，从而减少可能导致假阳性结果的干扰。最终检测采用 µPADs 实现，提供了一种简单、经济且易于判读的方案，用于筛查重要的食源性致病菌。整个流程包括 MMS 浓缩、过夜增菌和比色检测，可在一天内完成，并能检测低至 0.1 CFU/mL 的细菌污染水平。
为了简化方法并降低污染的可能性，使用MMS作为细菌增菌的容器。将此增菌步骤加入流程中可提高检测的灵敏度、特异性，并增强方法的灵活性。尽管本.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢美国农业部国家食品与农业研究所提供的资助，项目编号为 2009-01208 和 2009-01984。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 农业用水 | 灌溉用水、农产品清洗水、井水等 | ||
| 乙烯基管 | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" 内径， 3/8" 外径，可从以下网址获取： http://www.wilmar.com |
| 改良摩尔拭子滤筒 | Lumiere Diagnostics | 长 11 ½ cm，宽 4 ½ cm，可从以下网址获取： http://www.lumierediagnostics.com 。或者，也可使用非一次性滤筒（参见正文） | |
| 纱布 | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | 90 号级，44 × 36 编织，可从以下网址获取： www.raglady.com |
| 家用漂白剂 | 多种品牌 | 次氯酸钠浓度约为 6% | |
| 五水合硫代硫酸钠 | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| 多通道装置 | 自制 | 可选，该设备可由 PVC 管和合适的接头组装而成 | |
| 蠕动泵 | Micron Meters | RPP1300 | 可从以下网址获取： http://www.micronmeters.com |
| 血清移液管 | 多种品牌 | 一次性，10 ml | |
| 通用预增菌肉汤 | Difco | 223510 | |
| 缓冲蛋白胨水 | Difco | 218105 | |
| 沙门氏菌补充剂 | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP 李斯特菌（LPT）肉汤 | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| 万古霉素 | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| 移液器辅助器 | 多种品牌 | 本实验使用 Drummond DP-110 | |
| 振荡培养箱 | 多种品牌 | 本实验使用 Excella E25，New Brunswick Scientific | |
| 微量移液器 | 多种品牌 | 10 μl，1 ml | |
| 微量移液器吸头 | 多种品牌 | 带屏障，10 μl，1 ml | |
| 1.5 ml 微量离心管 | 多种品牌 | 无 RNase 和 DNase | |
| 探头式超声破碎仪 | Q Sonica LLC | XL-2000 系列 | |
| µPADs | Avant | 蜡印直径 7 mm 的圆，线宽 4 pt。更多信息请联系 Charles Henry 博士 | |
| HEPES [N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| 氯酚红-半乳吡喃糖苷（CPRG） | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X-Gluc） | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯（品红辛酸酯） | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-溴-4-氯-肌醇磷酸（X-InP） | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| 培养皿，聚苯乙烯，100 mm × 15 mm | 多种品牌 | 无菌 | |
| 平板扫描仪 | 多种品牌 | Xerox USB 扫描仪 | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
参考文献
- Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D.
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重印与许可
