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方法文章

基于比色法的纸质检测 大肠杆菌, 沙门氏菌 和 spp. 单核细胞增生李斯特菌 从大量农业用水中

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DOI：

10.3791/51414

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2014年6月9日

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1Department of Animal Science, University of Wyoming, 2Department of Chemistry, Colorado State University, 3Department of Environmental and Radiological Health Sciences, Colorado State University, 4Department of Animal Sciences, Colorado State University, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Food Science and Human Nutrition, Citrus Research and Education Center, University of Florida, 7Department of Food Science and Agricultural Chemistry, McGill University

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于在大体积农业用水中对食源性病原体进行一体化浓缩、富集及终点比色检测的方案。该方法通过改良莫尔棉签（Modified Moore Swabs, MMS）对水样进行过滤，利用选择性或非选择性培养基进行富集，并采用嵌有细菌显色比色底物的纸质分析装置（µPAD）进行检测。

摘要

本方案描述了从大体积（10 L）农业用水中快速进行比色法检测大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella spp.）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。在此方法中，水样通过无菌改良摩尔棉签（MMS）进行过滤，MMS由封装在塑料卡匣中的简单纱布滤膜组成 ，以实现细菌的浓缩。过滤后，在MMS中对目标细菌进行非选择性或选择性增菌。为实现目标细菌的比色检测，随后使用嵌入了细菌指示性底物的纸质分析装置（µPADs）对增菌液进行检测。每种底物与目标细菌特有的酶发生反应，生成可在µPAD上肉眼观察到的有色产物（定性检测）。或者，可使用常见的扫描或摄影设备获取反应后µPAD的数字图像，并利用ImageJ软件进行分析，从而实现对结果更客观、标准化的解读。尽管生化筛查程序旨在鉴定上述细菌病原体，但在某些情况下，背景微生物群产生的酶或比色底物的降解可能导致假阳性结果。因此，需采用更具区分能力的诊断方法进行确认。尽管如此，该细菌浓缩与检测平台成本低廉、灵敏度高（检测限为0.1 CFU/mL）、操作简便且快速（浓缩、增菌和检测过程在约24 小时内完成），适合作为农业用水微生物质量的初步筛查方法。

引言

为了减轻食源性疾病的负担，快速检测食源性致病因子，最好在实地环境中进行检测，这一点至关重要。常见的食源性细菌病原体检测策略包括生化特征分析、选择性和鉴别性培养、免疫学分离与检测以及分子检测。然而，这些方法受限于偶然性的污染、检测样本量小、食源性致病菌浓度通常较低、处理时间较长，和/或不适用于现场环境。此外，许多食品基质中的化合物会抑制检测和诊断应用。为提高微生物检出的可能性，美国食品药品监督管理局（FDA）建议，检测与大量新鲜农产品表面接触或作为农产品污染传播媒介的农业用水（如清洗水和灌溉水），是直接检测食品的一种可行替代方案1。即便如此，由于自然环境中病原体载量通常较低，加之代表性农业水样本身的稀释效应，使得病原体浓缩的样品前处理方法变得至关重要。此类方法需要采集大量水样（≥10 L），实现充分的病原体浓缩，并能与后续检测策略相兼容。

改良摩尔拭子（Modified Moore swabs，MMS）是一种廉价、简单且耐用的装置，用于从大量水样（≥10 L）中浓缩细菌2-4。MMS由一个塑料盒组成，盒内填充纱布，作为粗滤器，在使用蠕动泵将大量水样泵入盒内时起到过滤作用。MMS是一种非选择性的细菌浓缩方法（浓缩倍数≥10倍），可捕获处理液样本中的有机和无机颗粒物质，包括微生物。MMS对目标微生物具有优异的浓缩效果，这很可能是因为微生物通常附着在悬浮固体中的粉砂-黏土组分或有机微聚集体上3。MMS的坚固设计克服了其他水样细菌捕获与浓缩过滤方法的大多数缺点，例如滤膜堵塞、无法处理大体积样本、难以过滤高浊度样本以及成本高昂等问题。基于这些优势，美国食品药品监督管理局（FDA）建议将MMS纳入环境及与农产品相关样本采集的官方规程中5。

本文描述了一种从农业用水中浓缩、富集并检测大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella spp.）和单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的方法。采用微生物浓缩系统（MMS）对细菌进行浓缩，并作为选择性或非选择性细菌增菌的容器。细菌的检测通过基于纸张的分析装置（µPADs）以生化方式实现6。µPADs 可通过多种方法制造成微流控网络或斑点测试，包括光刻、喷墨打印、压印和蜡印7–11。流体设计的示例包括树突状通道图案，其中样品置于中心，随后流向远端储液池；或单通道图案，通过毛细作用将样品或底物从通道外侧储液池拉向中心12。在本实验方案中，我们选用嵌入显色底物的直径为 7 mm 的蜡印纸斑点阵列，这些底物可被本研究中目标微生物所产生特征性酶催化反应：用于检测大肠杆菌（E. coli）产生的 β-半乳糖苷酶和 β-葡萄糖醛酸酶的氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷（CPRG）和 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷（X-Gluc）；用于检测沙门氏菌（Salmonella spp.）产生的 C8-酯酶的 5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯（magenta caprylate）；以及用于检测单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）产生的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶 C（PI-PLC）的 5-溴-4-氯-3-吲哚基-myo-肌醇磷酸酯（X-InP）6。因此，无需复杂设备或数据分析，即可通过肉眼观察判断特定细菌的存在。此前已有研究探讨了基于酶法比色 µPAD 检测这些特定目标细菌的特异性和灵敏度6。此外，通过向大体积水样中加入已知浓度的微生物，对集成的浓缩-检测方法针对这些目标细菌的灵敏度进行了评估（未发表数据及 Bisha et al.13）。

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方案

1. 使用MMS从大量农业用水中浓缩细菌

  1. 膜过滤装置（MMS）制备
    1. 裁剪一块4层纱布，尺寸为40 × 12 cm的矩形。
    2. 沿两个轴向将纱布对折，得到一个20 × 6 cm的矩形。
    3. 沿长边方向紧密卷起纱布，形成一个长约6 cm、直径约3 cm的圆柱形拭子。
    4. 将纱布拭子用铝箔包裹后进行高压灭菌，切勿对MMS卡盒进行高压灭菌。通过将卡盒浸泡于10%家用漂白剂中30分钟进行去污，并随后将其浸泡于硫代硫酸钠五水合物（Na2S2O3·5H2O）溶液（50 mg/L，用无菌水配制）中15分钟，以中和残留氯。
    5. 将拭子插入MMS卡盒中。
      注意：若使用非一次性MMS卡盒，请起始使用一块80 × 22 cm的4层纱布，将其折叠为40 × 11 cm，再卷成一个长约11 cm、直径约6 cm的圆柱体。
    6. 组装MMS装置。
    7. 将乙烯基管路连接至MMS两侧的出液口，确保管路完全贴合出液口，并将管路固定于蠕动泵上。确保蠕动泵上游的管路长度足以完成采样。
  2. 细菌浓缩
    1. 通过以高速运行蠕动泵，采集至少10 L农业用水样品。
    2. 采样完成后，将蠕动泵进样端从水样中取出，并继续运行泵，直至MMS无出流液体为止。
    3. 若使用多通道装置同时处理多个样品，请分别收集每个MMS的出流液；当单个MMS过滤达到10 L时，关闭该MMS对应的阀门，并继续运行泵。
      1. 采样完成后，将蠕动泵进样端从农业用水中取出，打开多通道装置的所有阀门，并继续运行泵，直至所有MMS均无出流液体为止。
  3. 当所有MMS的浓缩步骤完成后，小心地将乙烯基管路从MMS出液口上拆除，并用盖帽封闭MMS两侧的出液口。密封良好的MMS可在添加增菌培养基前保存最多12小时。

2. MMS 富集与样品制备

  1. 增菌
    1. 拧开MMS的盖子，无菌操作加入20 ml适当的无菌增菌肉汤。每个选择性增菌使用一个MMS。或者，可进行非选择性增菌，以在同一份样品中同时扩增三种目标细菌。
      注意：如果使用MMS卡匣的非一次性版本，在加入225 ml适当的增菌培养基之前，需无菌取出卡匣中的纱布滤膜并置于无菌袋中。
      1. 为增菌E. coli，加入20 ml添加8 mg/L盐酸万古霉素的缓冲蛋白胨水（BPW）。
      2. 为增菌Salmonella spp.，加入20 ml添加Salmonella补充剂（4 ml/L）的BPW。
      3. 为增菌L. monocytogenes，加入20 ml VIDAS UP Listeria（LPT）肉汤。
      4. 若使用单个MMS对三种微生物同时进行非选择性增菌，使用通用预增菌肉汤（UPB）。
    2. 将MMS盖子重新拧紧。确保出液口的盖帽已紧密封闭，以避免在增菌过程中发生泄漏或污染。
    3. 将MMS置于摇床培养箱中培养，最长时间为18–24小时，转速为200 rpm。E. coli和Salmonella spp.的选择性增菌使用42 °C；L. monocytogenes的选择性增菌使用30 °C；非选择性增菌使用37 °C。
  2. 样品制备
    1. 培养完成后，将MMS从培养箱中取出，打开其中一个出液口，轻轻挤出约0.5 ml至1.5 ml微量离心管中。或者，也可拧开MMS盖子，用移液器吸取0.5 ml过夜增菌液。
      注意：如果使用MMS卡匣的非一次性版本，从袋中用移液器吸取0.5 ml增菌液。
    2. 对于E. coli选择性增菌的比色分析，或对非选择性增菌样品的分析，使用探头式超声仪对0.5 ml增菌液在5 W、22 kHz条件下超声处理20秒。

3. 比色底物在µPAD中的制备与包埋

  1. 为每个待测样品和目标准备足够的µPAD。检测大肠杆菌（E. coli）时，准备CPRG和X-Gluc µPAD；检测沙门氏菌（Salmonella spp.）时，准备MC µPAD；检测单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）时，准备X-InP µPAD。
    1. 配制HEPES缓冲液 [0.1 M HEPES 含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）]，用于显色底物，并根据所用底物调整缓冲液pH值：配制CPRG或X-Gluc时pH为7.5，MC时pH为9，X-InP时pH为7。
    2. 在pH调整后的HEPES缓冲液中配制各底物的储备液，浓度分别为：3 mM（CPRG）、62.5 mM（X-Gluc）、15 mM（MC）、100 mM（X-InP）。储备液需避光保存。
    3. 将µPAD置于无菌培养皿中，然后向µPAD的微点加入24 µl每种底物储备液。

4. 检测与数据分析

  1. 检测
    1. 将6 µl富集后的样品加入培养皿中相应的µPAD微点内。
    2. 将培养皿盖重新盖上，并用Parafilm密封。
    3. 将样品与µPAD在37 °C下孵育最长3小时，以使微点显色并干燥。
  2. 结果的目视检查
    1. 通过直接目视观察µPAD的颜色变化进行检测。
      注：通常在富集18–24小时后，强阳性反应会产生明确的颜色变化，无需进一步确认，应判为阳性。
    2. 通过观察嵌入CPRG的微点由黄色变为红紫色，以及嵌入X-Gluc的微点由无色变为蓝绿色，判断是否存在E. coli阳性样品。
    3. 通过观察嵌入X-InP的微点由无色变为靛蓝色，判断是否存在L. monocytogenes阳性样品。
    4. 通过观察嵌入MC的微点由无色变为紫红色，判断是否存在Salmonella spp.阳性样品。
  3. 软件辅助数据分析
    注：用于明确判断弱反应为阳性或阴性，并实现结果的半定量分析。
    1. 让µPAD完全干燥。
    2. 使用平板扫描仪扫描µPAD。
    3. 使用ImageJ软件处理图像。
      1. "打开”主菜单“文件”选项卡下的已扫描图像（或按“Clt+O”）以在ImageJ中进行分析。
      2. 在主菜单“编辑”选项卡下选择“反相”（或按“Clt+Shift+I”）对图像进行反相处理。
      3. 使用主菜单中的“分析”选项卡，选择“设置测量项…”以确定需报告的测量参数。
      4. 确保勾选“平均灰度值”、“仅限阈值范围”和“显示标签”选项，然后点击“确定”。此设置将决定软件如何分析选定区域及其报告方式。
      5. 使用“椭圆”工具绘制一个圈，标定需要测量的区域范围。
      6. 在“分析”选项卡下选择“测量”（或按“Clt+M”）。软件将测量所定义区域内的平均灰度强度，并在弹出窗口中报告结果，该结果可复制并粘贴至Excel中进行进一步分析。
        注：为获得更准确的分析结果，每个样品应至少进行两次技术重复。

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结果

如本方案所述，使用MMS（图1）浓缩细菌可在约15-20分钟内完成。MMS由丙烯腈-丁二烯-苯乙烯（ABS）材料制成，包含两个独立部件：一个盖子和一个滤筒，两者均集成了带旋塞的装置，用于插入圆柱形纱布拭子（图1A）。将两个部件拧合在一起即组成完整的MMS（图1B）。基于MMS的处理过程由电池驱动的蠕动泵推动，使得样品可在野外条件下进行浓缩。通过结合MMS浓缩、选择性增菌（18-24小时）以及µPAD检测技术，可对农业用水中的重要食源性致病菌和指示微生物（包括E. coli、Salmonella spp. 和 L. monocytogenes）进行快速（约24小时）、简便且低成本的筛查。采用本方案，这些目标细菌的检测限可低至0.1 CFU/mL。µPAD检测基于对细菌特异性酶的检测，这些酶可与比色底物发生反应并产生颜色变化（图2）。检测普通E. coli（非E. coli O157:H7）的检测体系会产生蓝绿色产物（...

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讨论

本方案描述了一种用于检测农业用水中 E. coli、Salmonella spp. 和 L. monocytogenes 的整合方法。该方法结合了使用磁性微球（MMS）从大体积（10 L）农业用水中浓缩细菌、细菌增菌以及利用微流控纸基分析装置（µPADs）进行指示细菌存在的比色检测。MMS 程序能够应对水样中高含量的颗粒物，同时将细菌浓缩 10 倍，操作稳定、简便，适合经最低限度培训的人员在野外应用，且成本极低。通过引入细菌增菌步骤，可检测活菌，显著提高方法的灵敏度。增菌过程可扩增待测目标物，结合选择性培养基使用，还能抑制样本中非目标微生物的生长，从而减少可能导致假阳性结果的干扰。最终检测采用 µPADs 实现，提供了一种简单、经济且易于判读的方案，用于筛查重要的食源性致病菌。整个流程包括 MMS 浓缩、过夜增菌和比色检测，可在一天内完成，并能检测低至 0.1 CFU/mL 的细菌污染水平。

为了简化方法并降低污染的可能性，使用MMS作为细菌增菌的容器。将此增菌步骤加入流程中可提高检测的灵敏度、特异性，并增强方法的灵活性。尽管本...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢美国农业部国家食品与农业研究所提供的资助，项目编号为 2009-01208 和 2009-01984。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
农业用水灌溉用水、农产品清洗水、井水等
乙烯基管WilmarBN-CVT1005 1/4" 内径， 3/8" 外径，可从以下网址获取： http://www.wilmar.com
改良摩尔拭子滤筒 Lumiere Diagnostics长 11 ½ cm，宽 4 ½ cm，可从以下网址获取： http://www.lumierediagnostics.com 。或者，也可使用非一次性滤筒（参见正文）
纱布Chesapeake Wiper & Supply, Inc.CC9090 号级，44 × 36 编织，可从以下网址获取： www.raglady.com
家用漂白剂多种品牌次氯酸钠浓度约为 6%
五水合硫代硫酸钠Mallinckrodt Baker Inc8100-04
多通道装置自制可选，该设备可由 PVC 管和合适的接头组装而成
蠕动泵Micron MetersRPP1300可从以下网址获取： http://www.micronmeters.com
血清移液管多种品牌一次性，10 ml
通用预增菌肉汤Difco223510
缓冲蛋白胨水Difco218105
沙门氏菌补充剂Biomérieux Industry42650http://www.biomerieux-usa.com
VIDAS UP 李斯特菌（LPT）肉汤Biomérieux Industry410848http://www.biomerieux-usa.com
万古霉素Sigma-Aldrich861987http://www.sigmaaldrich.com
移液器辅助器多种品牌本实验使用 Drummond DP-110
振荡培养箱多种品牌本实验使用 Excella E25，New Brunswick Scientific
微量移液器 多种品牌10 μl，1 ml
微量移液器吸头多种品牌带屏障，10 μl，1 ml
1.5 ml 微量离心管多种品牌无 RNase 和 DNase
探头式超声破碎仪Q Sonica LLCXL-2000 系列
µPADsAvant 蜡印直径 7 mm 的圆，线宽 4 pt。更多信息请联系 Charles Henry 博士
HEPES [N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-2-乙磺酸]Sigma-AldrichH3375
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA8022
氯酚红-半乳吡喃糖苷（CPRG）Sigma-Aldrich59767
5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸（X-Gluc）Sigma-AldrichB8174
5-溴-6-氯-3-吲哚基辛酸酯（品红辛酸酯） Sigma-Aldrich53451
5-溴-4-氯-肌醇磷酸（X-InP） Sigma-Aldrich38896
培养皿，聚苯乙烯，100 mm × 15 mm多种品牌无菌
平板扫描仪多种品牌Xerox USB 扫描仪
ImageJ 软件美国国立卫生研究院http://rsb.info.nih.gov/ij/

参考文献

  1. Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , U.S. Dept. of Health and Human Service, Food and Drug Administration, Center for Food Safety and Applied Nutrition (CFSAN). (1998).
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  3. Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
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  7. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
  8. Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
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  11. Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
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  13. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. Bisha, B., et al. Internation Association for Food Protection Annual Meeting, Providence, RI, , (2012).

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