全球合成的RNA在单细胞水平以下的低氧分析

Summary

我们描述了全球性RNA合成缺氧使用成像分析技术。以前没有缺氧条件下进行的RNA点击化学标记，并允许全球的RNA变化的可视化在单细胞水平。这种方法将与现有的平均值RNA技术，允许的细胞 - 细胞间的变化在全球RNA合成的直接可视化。

Abstract

的氧气供应缺氧或降低参与了许多生理和病理过程。在分子水平，细胞启动一个特定的转录程序，以安装适当的和协调一致的细胞反应。该电池具有需要分子氧作为辅助因子的活性几个氧传感器的酶。这些范围从脯氨酰羟化酶组蛋白去甲基化酶。大多数研究分析细胞对缺氧是基于蜂窝人口和平均的研究，并作为缺氧细胞的这种单细胞分析很少执行。这里我们描述了在低氧单细胞水平通过使用按此-IT RNA的成像盒中的控制氧工作站，随后显微镜分析和定量全球RNA合成的分析方法。采用低氧不同的时间长度的癌细胞，RNA标记和测量的每个小区中。这种分析可以的时间和细胞 - 细胞在全球RNA合成下列低氧应激的变化的可视化。

Introduction

当正常的氧气供应，组织受到干扰缺氧（低氧张力）发生。环境氧既是养分和信号传导分子，提供了重要的线索对许多类型的细胞。被改变的环境氧气通过一组控制的重要转录因子家族被称为缺氧诱导因子（HIFs）的双加氧酶的活性的检测。该HIFs是由两个亚基组成，α和β。有三种已知的（3 1，2，和）同种型，HIF-α和HIF-1β的多个剪接变体。 HIF-1β组成型表达，而不是由环境的氧气水平¹调节。缺氧诱导因子-α家族成员是由一类脯氨酰羟化酶（博士）动态地调节和抑制因子缺氧诱导因子（FIH）;两者都需要氧作为辅因子催化^HIF-α2,3的羟化。常氧中的HIF-α家族成员羟基化和标记为proteosom人降解的E3连接酶，希佩尔林道（VHL）。在缺氧的博士和富士康是无效的或具有活性降低。的HIF-α亚型变得稳定时，形成与HIF-1β的异源二聚体，以及影响基因，提供对低氧环境（ 图1A）的细胞应答的转录^4。

当前技术用于RNA分析集中于平均值的跨越给定的细胞群体的定量。细胞对缺氧的刺激所引发的基因，使他们能够适应他们的恶劣环境⁵无数的转录反应。然而，缺氧往往存在一个梯度，以及细胞在缺氧的环境不受统一的缺氧刺激。我们描述了按此-IT RNA成像试剂盒的实施方案中的控制氧工作站检查全局RNA合成在缺氧单细胞水平。

RNA的成像试剂盒采用一lkyne-修饰核苷，5 -乙炔基尿嘧啶核苷（EU）和化学选择性连接，能够检测全局的RNA合成的时间和空间中的细胞和组织^6。简言之，将细胞用缺氧和在欧盟的存在下进行培养。然后，他们的固定和通透和欧盟纳入新生RNA是由欧盟的化学选择性结扎用含叠氮染料的检测。一个典型的工作流用于此反应示于图1B中 。我们所使用的RNA的试剂盒的成像检查RNA的合成在起因于缺氧处理单细胞水平。

炔标签的小尺寸使得修饰的核苷的有效掺入到RNA的特异性。的化学选择性结扎或'点击'的反应是高效，快速和具体^7-10。所有的反应成分是生物惰性，反应不需要极端的温度或溶剂。点击反应否定要求对传统的放射性标记，并允许结果的直接可视化，因为输出是光。另外，检测分子可以很容易地穿透复杂样品，允许多重分析包括抗体用于RNA-相互作用蛋白的检测。这种RNA成像法是用有机染料包括的Alexa Fluor和荧光素（FITC）兼容。

我们测量的RNA合成的变化下使用开放式显微镜环境下对远程对象（OMERO）的实施治疗我们的细胞。 OMERO是开源软件，可以在http://openmicroscopy.org/ 。这种显微镜图像可视化和分析软件可以访问和使用范围广泛的生物学数据，包括多维，异构数据集的管理。客户端应用程序允许远程可视化和复杂的生物图像数据¹¹的分析;我们用它来量化在全球和单细胞RNA合成的视觉变化。使用该显微镜图像可视化和分析软件这些数据，并分析了RNA的成像实验所需的步骤如下所示。

我们看着下面的人骨肉瘤的治疗（U2OS）细胞缺氧长达24小时的全球RNA合成的变化。在所有情况下，我们检测到细胞 - 细胞间的变化的RNA生产水平。低氧暴露短的时间内未产生显著改变在细胞新生RNA的水平。然而，暴露于缺氧24小时导致RNA的细胞产生的量显著增加。大多数细胞对低氧的是以下的曝光时间较长，例如4〜24小时来测定。然而，一些机制落实到位早得多，例如; NF-κB的激活发生在低氧暴露¹²的5-15分钟。调查较短的低因此霞曝光时间是必要的，并可能有损于更复杂的反应，如细胞周期和凋亡。

Protocol

1，细胞培养及处理

1. 收集在表1中，以培养人骨肉瘤（U2OS）细胞中列出的试剂和设备。准备好所有试剂，并对所有组织培养技术在空气层流罩，以保证无菌
2. 制备培养基如下:加入50 mL的FCS，加入5ml L-谷氨酰胺和5 ml青霉素/链霉素的DMEM中，以达到最终浓度为10％（FCS），2mM的（L-谷氨酰胺），50单位/毫升（青霉素）和50单位/毫升（链霉素）。温热的培养基中，在37℃的水浴中。
3. 准备细胞治疗:
   1. 几种消毒盖玻片的70％乙醇，在空气中晾干，然后将一个在6个3.5 CM平板的底部。
   2. 沉浸在2毫升的盖玻片回暖完全DMEM（37℃），按下与盖玻片钳，以确保它们保持附着在孔的底部。
   3. 从他们的邪教组织分离U2OS细胞URE板通过用3ml PBS洗涤一次，施加4毫升温热0.05％胰蛋白酶-EDTA（1％），并在37℃温育7分钟。
   4. 重悬细胞6毫升温热的完全DMEM以灭活胰蛋白酶-EDTA，并使用血细胞计数器计数。
   5. 板2×10 ⁵细胞以每点1.3.1编制的3.5厘米板。轻轻摇动平板，以确保均匀的细胞分布。使细胞附着过夜处理之前。
4. 通过将4个3.5 CM平板进入缺氧工作站处理细胞并保留其他两个3.5 CM平板在培养箱中37℃，正常氧条件。准备好开始治疗的条件下，RNA标记法（在缺氧室缺氧处理的细胞）1小时的缺氧治疗结束前。
5. 暴露的细胞对缺氧的1小时15分钟，1小时30分钟，2小时和24小时。这些时间点是灵活的，用户确定的。
6. 使用无论正血球XIC3.5厘米片作为阳性对照，用放线菌素D（10μg/ ml的终浓度）为4小时，作为阴性对照处理的含氧量正常3.5厘米板。放线菌素D是全球RNA合成的抑制剂。

注意事项:

赫斯特荧光染料33342是一种已知的诱变剂。
DMSO是已知的，以促进有机分子进入组织中。
氢氧化钠有腐蚀性。
盐酸具有腐蚀性。
多聚甲醛是所有动物剧毒，可致人类死亡。
下面直接接触的Triton X-100可引起皮肤过敏。
放线菌素D是有毒的皮肤或吞食接触时。
采取适当的预防措施处理所有危险化学品时。

2，点击-IT分析

1. 收集下列试剂所需要除了按此-IT试剂盒:磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH值7.2 - 7.6，3.7％多聚甲醛（PFA）的PBS，1％的Triton X在PBS中的-100，去离子水（DH ₂ O），二甲基亚砜（DMSO），10μM氢氧化钠（NaOH），和37％的盐酸（HCl）;可选 - pH值试纸。
2. 进行点击，它的反应如下之前准备一个新鲜的PFA原液:
   1. 把1.85克PFA，3.5毫升DH ₂ O和10微升16:05 M氢氧化钠到50毫升猎鹰管。煮沸300 - 400毫升H _{2 O}的在一个大烧杯中的微波，使水浴并在通风橱受不了这个。
   2. 放置50毫升隼入水浴中，并轻轻搅拌10分钟后，周期性地释放所述盖子直至PFA溶解。
   3. 通过0.2微米的过滤器的注射器的PFA溶液到另一个50毫升Falcon管中，产生了37％的溶液。
   4. 通过加入PBS稀释10倍的这个和通过加入约12微升的浓盐酸使pH为6.8。选项​​:确认正确的pH值在通风柜的试​​纸。
   5. 立即使用或存放Øvernight在4℃下
3. 制备储备溶液的核糖核酸成像试剂盒如下:
   1. 加入373微升DH _{2 O}至导致欧盟100毫米的原液成分A。储存在-20℃下长达一个月。
   2. 加85微升的DMSO中，以组分B（的Alexa Fluor 594）和通过移液或涡旋混匀。无论是在-20℃可保存一年储存。
   3. 加入2ml DH _{2 O}至E成分以创建RNA成像试剂盒反应缓冲液添加剂的10X的解决方案。储存在-20℃下长达一年，丢弃时的解决方案开发了一个棕色的颜色。
4. 细胞与欧盟标签:准备欧盟从预热的完全培养基（37℃）制备步骤2.3的100毫米的股票2X工作液执行此步骤的余下并且在缺氧室步骤2.5与低氧处理的细胞 。 ，通过添加本2X工作溶液等体积的介质续稀释至1X癌宁细胞。孵育治疗的细胞培养条件下1小时。
5. 细胞固定:每洗一次很好用PBS加1毫升3.7％的煤灰股票准备在上面的步骤2.2处理条件下。孵育处理条件下15分钟。 与低氧处理后的样品可以从缺氧室中在这一点上被移除 。去除固定液，用PBS洗涤每孔一次（ 请小心处理煤灰的浪费负责 ）。执行下面的步骤在室温下。
6. 通透:取出洗涤溶液并加入1 ml 1％的Triton X-100的PBS中的每个孔中。孵育15分钟，在室温下进行。除去透化缓冲液并用PBS洗涤各孔一次。
7. 标记的RNA检测:
   1. 在DH ₂ O稀释10X溶液（步骤2.3准备）1:10准备的RNA成像试剂盒反应缓冲液添加剂的新鲜的1X工作液
   2. 准备RNA成像套件配制后立即按表2使用的反应鸡尾酒。
   3. 去除洗涤液，并加入500μl的RNA成像试剂盒反应鸡尾酒到每个样品。孵育30分钟，在室温， 避光 。
   4. 除去核糖核酸成像试剂盒反应混合物和用1ml RNA成像试剂盒反应漂洗缓冲液（F成分）洗一次，然后拆下核糖核酸成像试剂盒反应漂洗缓冲液。
8. 可选多重反应:在这一点上，根据制造商的建议进行样品的额外抗体标记。
9. DNA的染色:洗涤样品，用PBS然后除去洗涤液。稀释的Hoechst 33342（G成分）1:1,000在PBS。加入1毫升稀释的Hoechst 33342至每个孔，并孵育15分钟，在室温下， 避光 。取出的Hoechst 33342溶液并用PBS洗细胞两次。取出洗净solution和进行光镜。

3，光学显微镜

1. 摩盖玻片:
   1. 把10微升在标准显微镜载玻片的中心安装的介质。
   2. 将盖玻片与细胞侧朝下放在显微镜载片上的中心以覆盖安装介质的等分试样。注意避免在安装介质中气泡的产生，因为这会掩盖后续的图像采集。
   3. 通过应用明确的指甲油，以它的周长坚持盖玻片在显微镜幻灯片。允许在室温下干燥5分钟。 避光保存 。样品可以贮存于-20℃下以下安装。
2. 图像采集:采用宽视场显微镜能够荧光检测获取图像。为的Alexa Fluor染料和赫斯特荧光染料33342绑定到DNA的近似荧光/激发发射最大值示于表3中 。
3. PERFOR使用40X/1.30 NA油浸镜头和拍摄的影像具有冷却CCD相机米影像。

4，数据分析

1. 使用图像处理软件（见材料表）导入到客户端OMERO之前去卷积图像。正常化通过施加从控制氧正常细胞中的渲染设置到所有其他条件呈现在相同的实验中，显微镜图像可视化和分析的软件设置为所有图像。
2. 使用感兴趣区域（ROI）工具在显微镜图像可视化和分析软件（见材料表），以从每个图像选择核。获得平均强度为每个投资回报率，并通过选择强度分析选件，其中包括一批30-50单元格之间计算每个条件的平均值和标准偏差。
3. 通过绘制步骤4.2吨获得的所有个体的平均亮度值使用数据绘图软件（见材料表）构建散点图Ø反映各条件下的细胞之间的差异。或者构建条形图来表示平均平均强度加上新生RNA标准偏差。

Results

RNA的成像试剂盒反应的原理图如图1B所示。我们利用这个反应来定量测定总RNA的合成在U2OS细胞在与缺氧处理两个个体（单细胞）和全球层面（细胞群）上。将细胞用缺氧和在欧盟的存在下进行培养。然后，他们被固定和通透和欧盟的成立是由欧盟的化学选择性结扎用含叠氮染料的检测。这"咔哒"反应导致可检测并使用荧光光学显微镜定量的荧光发射。 图2A示出从这个实验的典型结果。荧光标记的细胞被伪彩色红色和图像已在公开显微镜环境对远程对象（OMERO）被打开。这种显微镜图像可视化和分析软件有一个内置的ROI工具，它可用于选择各个亚细胞结构Tures的和定量分析所选区域内的图像强度。数据输出后，在客户端程序中使用这个工具的一个典型例子可以看出，在图2B;单个电池强度显示从旁边用作目视检查，以确保数据的有效性实验的代表图像。

单个细胞的荧光强度，可以绘制为散点图来显示个人的蜂窝强度的处理过的细胞群体中的分布。这种类型的曲线图的一个例子是出现在图2C中 。因为它允许治疗结果的比较快速和清楚地表明，用标准数据表示另有遮蔽处理的细胞群内的显著异质性作图的强度数据以这种方式是很有用的。该反应的异质性是有趣在这个实验中，因为虽然一个统一的缺氧刺激是一个pplied到细胞中，显而易见的是，从同一个单层人口每一个细胞的反应不同，这种刺激。

图2D描绘了从我们的实验中，总体结果。从一个处理群中所有的细胞的荧光强度进行平均，然后绘制在该条形图。学生的t检验被用来计算每个治疗组从控制显著不同的统计概率。有趣的是，这些数据表明，有超过时U2OS细胞用缺氧处理的时间在全球RNA合成具有统计学显著增加（在时间大于1小时30分钟，* P <0.01; ** p <0.05和，*** P <0.001和n> 30）。这些数据表明，缺氧处理的时间较长，细胞论点集中，即使在如此恶劣的低氧环境下其对RNA合成的努力。放线菌素D处理完全烧蚀如预期般的荧光强度。

图1:A的HIF系统响应的变化，细胞供氧。在这个简化的示意图缺氧稳定HIF二聚体通过防止HIF-α羟基（-OH）的脯氨酰羟化酶的酶（博士）及其以后的多泛素化被von-Hippel的林道蛋白（VHL）。缺氧诱导因子稳定在结果无数的基因，有助于可使用的Click-IT试验来检测B. RNA合成细胞缺氧细胞响应的激活;细胞治疗的Click反应检测RNA的合成可以通过荧光强度和光学显微镜进行量化后标有欧盟。 请点击此处查看大图自愿减排量离子这个数字。

图2:从OMERO A.截图显示典型的微观输出下列RNA标记。这种显微镜图像可视化和分析软件，可以使用其内置的宏观投资回报率迅速提取物对单个细胞水平强度数据。从这个命令的输出的屏幕截图所示B.全球RNA的合成可以从单个细胞强度来推断，其范围可以在散点图可以看出C的这些汇总数据正式表示可以看出D. * P <0.01; ** P <0.05，*** P <0.001和n> 30。 点击这里查看大图。

细胞培养试剂 磷酸盐缓冲盐水（PBS）pH为7.2 - 7.6 Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）中胎牛血清（FCS）的过滤除菌青霉素/链霉素 L-谷氨酰胺 0.05％胰蛋白酶-EDTA（1％） 70％乙醇放线菌素D（1微克/微升股票） 细胞培养设备 无菌巴斯德移液器适合用于细胞培养的保养和治疗细胞培养处理过的塑料制品的一系列置水浴在37℃ 空气层流罩孵化器设置在37℃，5％CO ₂的缺氧工作站设置在_{37℃，5％CO2，1％O2} 盖玻片精密镊子血球

表1所需的U2OS细胞的培养试剂和设备。

反应元件	盖玻片数
	1	2	4	5	6	10
按一下，它的RNA反应缓冲液（成分C）	428微升	856微升	1.7毫升	2.1毫升	2.58毫升	4.3毫升
CuSO 4的（D成分）	20微升	40微升	80微升	100微升	120微升	200微升
的Alexa Fluor叠氮化物（制备步骤2.3）	1.8微升	3.7微升	7.4微升	9.3微升	11.28微升	18.8微升
点击 - 它反应缓冲液添加剂（准备步骤2.3）	50微升	100微升	200微升	250微升	300微升	500微升
概约总成交量	500微升	1毫升	2毫升	2.5毫升	1.5毫升	5毫升

表2的RNA成像套件反应鸡尾酒:参考表根据盖玻片被污染的数量，详细预混试剂进行RNA成像试剂盒的反应率。

荧光	激励（纳米）	发射（纳米）
的Alexa Fluor 488	495	519
赫斯特33342，与DNA结合	350	461

表3荧光/激发发射峰:对的Alexa Fluor染料和赫斯特33342与DNA结合的近似荧光/激发发射最大。

Discussion

我们已经描述了我们使用的RNA成像套件的研究缺氧对RNA合成的骨肉瘤（U2OS）细胞的作用。这一技术相对比较简单，并提供了有关在单细胞水平全局转录数据。我们修改了传统的协议，这个套件包含标签在缺氧室。据我们所知，这是使用这种技术来测量缺氧改变RNA合成的第一份报告。我们所使用的RNA的成像试剂盒适用于实验中缺氧，因为它不需要放射性同位素，并与在受控气氛工作站协同工作的限制技术上不兼容。常见的问题该技术关注有效固定和样品的标记。这是极为重要的是，煤灰用于固定样品是新鲜的和描述的一样，以确保样品的低背景染色执行遵循'点击'反应，该洗涤步骤。若bACKGROUND荧光变得建议的步骤2.7.4后洗一次，用1ml的RNA成像试剂盒反应漂洗缓冲的一个问题。

这里提到的RNA成像套件代表了RNA成像技术一个显著进步在易用性和特异性的反应和速度方面。这种技术是通过它需要以标记样品中的时间主要限制。 RNA的成像套件需要，防止在全球RNA的快速变化通常会发生此期限内的考试有1小时的贴标时间。正是由于这个原因，我们的第一时间点被限制为1小时和15分钟。该技术被用在很大程度上涉及与试剂的相容性和其它荧光标记物，例如，该RNA成像试剂盒不与鬼笔环肽染色兼容其他一些局限性有关。

研究RNA合成细胞的所有现有的方法都是基于修饰核苷的掺入新生RNA和结合标签通过不同方式的检测。开拓方法是基于用放射性标记的RNA前体随后检测与放射自显影。这种方法导致了发现细胞周期阶段和其他重要发现;然而，它有很多缺点，例如放射性工作中，长曝光时间和放射自显影⁶的低分辨率图像的笨重的性质。在该领域的未来提前利用免疫组织化学的方法，以消除放射性的必要性。 RNA的标记由BRU注册成立后免疫组化检测。然而，有效的抗体结合所需核酸变性，改善获得的DNA或导致的细胞形态丢失和损坏的许多蛋白质的抗原决定簇，以阻止其进一步的检测与荧光标记的抗体¹³的RNA。的"点击化学"技术的引入简化了检测步骤和t他的程序相比，放射自显影和免疫组化。该技术是基于叠氮 - 炔胡伊斯根环加成反应，其中的5-ethyniluridine末端炔烃与叠氮化物与结合在铜（I）的存在荧光团结合。该反应是特异性，快速，不需要任何额外的步骤，并且与免​​疫化学检测其它细胞成分容易相容。

使用该RNA的成像技术，我们发现，细胞，在相同的单层人群中，有不同的RNA合成水平响应于缺氧。我们限制了我们的实验中只检查RNA生产的影响;但是，它是完全可以用这样的RNA成像试剂盒进行修改，附加的多重反应中，允许对RNA的产量的更复杂的分析。例如，使用特异于活跃转录的标记物，如磷酸化的RNA聚合酶II或transla的偶数分量电平的次级抗体染色化机械给这个新产生的RNA被转化成蛋白质的量的指示是可能的。额外的蛋白质，如肌动蛋白，这不应该与低氧显著改变的蛋白质，可以测试作为一个额外的控制。此外，不同类型的细胞可以被测试，因为这很可能是不同的单元将具有不同的RNA合成速率和甚至不同的反应缺氧。

使用该RNA成像试剂盒是相当简单的提供作为所述被执行的步骤。在协议中的关键步骤涉及细胞接种，细胞固定和染色和图像采集。该板块的细胞所描述的密度，防止过或正在汇合在实验这将显著影响的结果是很重要的。同样重要的是用新鲜固定液，保证了电池的取最好的"快照"，并染色以减少BAC后洗涤细胞时要小心kground到一定水平，是可以接受的效率分析。最后，图像采集的方法是实现这一目标是一个质量足够好，以供后续分析的图像非常重要。我们建议您使用的最佳光镜可检查样品光学如本协议，可在最密集的研究中心在全球范围使用的显微镜​​。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
U2OS 原代细胞	欧洲细胞培养物保藏中心	92022711
PBS	Gibco	14190094
DMEM	Gibco	41966029
FCS	Gibco	10270106
青霉素/链霉素		Lonza DE17-603E
L-谷氨酰胺	Lonza	BE17-605E
0.05% 胰蛋白酶-EDTA （1%）	Gibco	25300062
缺氧室	Ruskinn	Invivo2 300
Click-iT 检测试剂盒	Invitrogen	C-10329/C10330
pFA	Sigma	76240
Triton X-100	Sigma	X-100
10 M NaOH	Sigma	72068
37% HCl	VWR	20252.335
VectaShield 封固剂	载体实验室	H-1400
放线菌素 D	Sigma	A9415
Deltavision 核心显微镜	应用精度	N/A
softWoRx	应用精度	N/A	在文本中称为图像处理软件。
CoolSnap HQ2 CCD 相机	光度学	N/A
用于远程对象的开放式显微镜环境 （OMERO）	OME	N/A	在文本中称为显微镜图像可视化和分析软件。
SigmaPlot v12.0	系统软件公司	N/A	在文本中称为数据绘图软件。