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单波长阴影成像 秀丽隐杆线虫 包含力估算的运动分析

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DOI：

10.3791/51424

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2014年4月18日

 ,  ,  , 
1Physics and Astronomy Department, Vassar College, 2Biology Department, Vassar College

本文内容

摘要

本文介绍的技术利用单波长曝光来测量自由游动的微观物种的运动轨迹。C. elegans 被用于演示阴影成像法，作为一种替代昂贵显微镜的低成本方案。该技术可针对不同方向、环境和物种进行调整，以测量运动方向、速度、加速度和受力情况。

摘要

本研究展示了一种经济且简便的技术，可用于测量线虫在水中悬浮状态下响应单波长光刺激时的运动行为所涉及的物理特性，如位置、速度、加速度和受力情况。我们通过两个不同实例，演示了如何利用单波长阴影成像（SWSI）技术评估微观生物体的运动行为。

第一个例子是对秀丽隐杆线虫（C. elegans）在水柱中平均下沉行为进行的系统性且具有统计学意义的研究。本研究使用了活体和死亡的野生型秀丽隐杆线虫（C. elegans）。通过比较线虫在重力场中的主动运动速度与方向，以及死亡个体的被动下沉过程，研究结果显示两者在下沉时间上无显著差异。在使用633 nm相干光条件下，活体与死亡线虫的平均下沉速度均为1.5 mm/sec ± 0.1 mm/sec。

第二个例子是一项案例研究，展示了单个秀丽隐杆线虫（C. elegans）在垂直水柱中下潜过程中改变运动方向的行为。本例中对加速度和受力进行了分析。该案例研究说明了在传统显微镜无法观测的环境中，利用单波长扫描成像技术（SWSI）评估生物行为的同时，还可进一步分析其他多种物理特性。通过该分析，我们估算出单个线虫能够产生超过 28 nN 的推力。

我们的研究结果表明，活体线虫在转向或逆重力场移动时施加的力为 28 nN。研究还进一步表明，线虫在水柱中会被动地下降，但主要通过改变方向主动抵抗重力作用。

引言

Caenorhabditis elegans 是一种自由生活的有益土壤线虫，是研究基因调控机制、发育过程，以及近年来用于理解感觉生物学和行为的强有力模式生物。尽管 C. elegans 仅有 302 个神经元，却能够表现出复杂的运动模式、生殖行为、导航能力、趋化性以及多种其他行为。C. elegans 拥有机械感受器和化学感受器，甚至能够感知蓝光波长（Ward et al., 2008）1。虽然目前对 C. elegans 感觉运动功能的神经回路和一般运动模式已有较多了解，但关于其对多种同时存在的刺激或比显微镜下更复杂的环境条件所产生反应的研究仍较为有限。少数研究已揭示出其具有高度可塑性的更复杂运动模式2,3,4。我们的方法学手段将实现在实时条件下对溶液中线虫的研究，能够同时提供多种环境条件。这一问题难以通过传统的基于显微镜的成像技术加以解决。我们开发了一种成像技术，可将线虫置于水柱环境中，以观察其运动行为，并确定线虫在不同环境条件下改变运动方式的能力。

本文首次提出单波长阴影成像技术（SWSI），以解决传统显微镜的局限性。传统显微镜仅能观察深度为几微米的水平焦平面内的样本5,6。在单波长研究方面，大多数传统显微镜使用彩色滤光片对白光进行非常宽泛的过滤，通常带宽为50–100 nm。而SWSI采用激光作为光源，可将波长选择范围窄化至1 nm以下，同时保持足够的光强7。类似地，单波长光也已被用于实时测量C. elegans的游泳频率8。

在本方法的首次演示中，我们监测了秀丽隐杆线虫（C. elegans）在水柱中自由游动时的水平位置 x 和垂直位置 y，监测距离约为 1 厘米。特别地，我们关注其垂直方向的运动，因为重力也沿垂直方向作用。对垂直位置进行线性拟合所得斜率即为线虫在水柱中下沉时的垂直速度 vy：
速度公式，vy=dy/dt，描述速度-时间关系的数学表达式。     (1)

误差均方根（RMSE）9 用于评估拟合质量，并判断下降速度是否基本恒定。随后对每个物种及死亡的蠕虫分别计算垂直速度的平均值。根据这些结果，可估算蠕虫所受到的阻力。

在本方法的第二次演示中，我们选择了一些 C. elegans，这些线虫的下降速度并非恒定，与大多数观察到的线虫不同。所选线虫要么调转方向向上游动，要么在继续下降前短暂悬浮。从物理角度来看，该案例研究表明，游泳微生物所产生的推力是可以计算的。根据牛顿定律，一个改变运动方向的物体必然存在加速度，这意味着有净力作用于该物体10：净力矢量符号，静力学平衡方程，物理概念。，即：
净力方程，F_net = dp/dt，展示牛顿第二定律，物理公式。     (2)

其中 物理学方程中动量的矢量符号 \(\vec{p}\) 为线动量，t 为时间。由于蠕虫的质量保持不变，其加速度与作用在蠕虫上的力成正比。因此，垂直方向的合外力为：
牛顿第二定律公式 Fy=may，用于说明物理学中的动力学平衡 （3）

其中 m 为蠕虫的质量，ay 表示垂直方向的加速度。垂直方向的合力即为蠕虫在该方向产生的推力。总推力可通过计入水平方向的分量来计算。

方案

1. C. elegans 的制备

  1. 按照先前涉及将 C. elegans 悬浮于充满液体的比色皿中的实验方法，制备含有年轻成虫 C. elegans 的培养皿11。
  2. 在视频分析当天，使用铂金接种针直接从培养皿中挑取活的年轻成虫线虫，放入装有去离子蒸馏水的比色皿中，操作方法同第2步所述。
  3. 通过氯仿暴露制备死亡的 C. elegans。随后按照第2步中所述挑取活线虫的步骤继续操作。

2. 视频分析的光学装置

  1. 组装实验装置以生成阴影图像，如图所示 图 1相机可以放置在距离屏幕任意远的位置，只要能够捕捉到屏幕的正面视图即可。一个合适的位置是将相机放在比色皿旁边，正对屏幕。
    1. 使用至少两个反射镜将可调谐的氦氖激光器输出光束导入伽利略式扩束器，使光束扩展至直径为12 mm。
    2. 在光束路径中放置一个或两个针孔，使光束穿过针孔而不受阻碍。利用针孔确保光路准直保持对准。
    3. 将扩束后的光束导向一个固定的石英比色皿，该比色皿宽10 mm、深10 mm、高4 cm。
    4. 使用焦距为75 mm的平凸透镜放大光束。
    5. 将投影屏幕放置在距离镜头约120 cm处。距离大于此值将获得更大的阴影图像放大倍数，但图像质量会因光强降低和衍射干涉现象更加明显而下降。
    6. 将一台能够达到至少60帧每秒的高速相机紧邻比色皿放置，并正对屏幕。
  2. 在光学装置附近放置一台解剖显微镜，以便快速将线虫转移至比色皿中。
  3. 将带有毫米刻度的透明直尺临时固定在比色皿架中心，使其垂直于扩展光束，使光束在屏幕上投射出直尺的放大图像。设定视频分析的长度标尺。
    1. 在投影屏幕上，使用透明尺在非中心位置标记比例距离 从投射图像中移开，以避免干扰投影。 点击此处观看视频。
    2. 记录该图像并测量放大倍数。从装置中移除直尺。针对其他波长重复此步骤，因为由于色差的存在，不同波长的光通过透镜时的折射角会有所不同。
  4. 更换比色皿，并用蒸馏水填充至距边缘1 mm处。
  5. 打开房间灯光时开始录制，以便将标尺距离与投射图像记录在同一段视频中。随后关闭灯光。
  6. 使用一根细而扁平的铂丝挑取针，移动单个年轻成虫 秀丽隐杆线虫 一次将一个线虫从琼脂平板转移到比色皿中，方法是将接种针轻轻接触水面。当线虫进入光束时，由于光散射，其在水柱中将变得可见。 点击此处观看视频。
  7. 拍摄线虫穿过扩展激光束时的投影图像。需要注意的是，投影图像是倒置的，线虫在屏幕上的移动方向与其实际运动方向相反。例如，顺着重力方向下行的线虫在屏幕上会显示为向上移动。图 2).

3. 视频数据准备

  1. 将视频导入视频分析程序。
  2. 使用先前确定的放大倍数设置标度。
  3. 对阴影线虫头部在整个运动路径上的线性位移，至少采集10个数据点进行追踪。
  4. 通过求取垂直方向的导数（"Y"，"时间"）得到垂直方向速度，并将该值除以第2.2步中确定的放大倍数。

4. 数据分析

  1. 分析秀丽隐杆线虫（C. elegans）的直线下降运动：
    1. 检查垂直位置随时间变化图上的数据点是否大致形成一条直线。由于线虫头部的运动，某些偏差可以忽略。如果数据点大致呈直线分布，则继续进行步骤 4.1.2；否则，下降过程为非线性，应按照本方案中的步骤 5.1 继续分析。
    2. 通过在“分析”菜单中对数据拟合一条直线12，生成线性回归线。该直线的斜率即为 C. elegans 的垂直运动速度。斜率表示在特定时间间隔内位置变化量除以时间变化量。采用此方法确定活体与死亡线虫的下降速度（图 3）。
    3. 对多个线虫的垂直游泳速度取平均值。约 50 条线虫的样本量已足够。比较活体线虫的游泳速度与死亡线虫的沉降速度。

5. 分析非线性运动 秀丽隐杆线虫

  1. 从第3节中选择一个已分析的视频文件，该文件显示在水柱中呈非线性下降（图 4）。可使用本方案中的步骤4.1.1来识别非线性下降。
  2. 在视频分析软件的“分析”菜单中选择“曲线拟合”，并选择二阶（二次）多项式，然后进行曲线拟合。
  3. 针对感兴趣区域，通过调整拟合曲线上两侧的括号位置，使拟合曲线尽可能接近拟合范围内的数据点和/或完全处于误差棒范围内。拟合程序会给出拟合曲线的数学表达式，即垂直位置随时间变化的关系。需考虑程序给出的与物理特性相关的拟合误差，通常相对误差在15%或以下是可以接受的。
  4. 添加更多曲线拟合以覆盖数据的其他部分。使用样条函数13对各函数进行连接以实现最佳覆盖：确保各拟合曲线之间有重叠，并尽量使相邻曲线在重叠区域的斜率相匹配。
  5. 通过对步骤5.1.3中获得的拟合曲线数学表达式求导，得到感兴趣区域的速度。速度可能随时间变化。注意，导数即函数的斜率，可通过数学方法或图形方法获得。在此情况下，使用给定的数学表达式更为实用。
  6. 对拟合曲线求二阶导数，以获得加速度。加速度可能随时间变化。
  7. 将加速度乘以蠕虫的质量，以计算蠕虫施加的推力。假设蠕虫主要由水组成，则其质量的合理估计值为3 μg。

结果

稳定下降

首次实验表明，在使用633 nm波长进行SWSI时，C. elegans 下降速率无显著差异。活体与死亡的C. elegans 下降速率均恒定在1.5 mm/sec ± 0.1 mm/sec。对50条线虫的样本量进行测量，活体与死亡线虫的变异系数均达到合理的7%。由于下降速度恒定，线虫未受到加速度作用，因此阻力等于重力减去浮力。这表明线虫的密度略大于水的密度；然而，在以下估算中，仍可合理假设线虫的密度大致与水相当。

改变方向

第二项研究是一项案例研究，证明了线虫能够改变运动方向，并可逆着重力向上游动。通过对线虫垂直位移绘制两条曲线拟合，进而对这些曲线的二阶导数进行样条插值，以绘制加速度随时间变化的图像。图 5). 建议在保持良好拟合的前提下，尽量采用较低的多项式阶数。较低的多项式阶数表明加速度随时间的变化较小。若多项式阶数过高，则高阶项将变得可忽略，因而不必要。该蠕虫以每秒0.110 mm的恒定速率减速2 ± 0.002 mm/sec2，转身并以相同的加速度 0.110 mm/sec² 加速2 ± 0.002 mm/sec2 直到不久之后 转折点。该 秀丽隐杆线虫 继续向上运动，加速度逐渐减小，表达式为 1.252 - 0.00708 t mm/sec²2 直到加速度降至零。考虑到公式 3 以及估计的蠕虫质量 3 μg，线虫受到一个垂直方向的净力，FNy0.33 pN，直至转向点稍后。

下降过程：在蠕虫到达转向点之前，作用在其上的力有三种：重力、阻力、浮力和推力（图6a）。合力等于这三个力的矢量和。此处我们仅考虑垂直方向的分量：
FNy = FDy+FTy-Fg+FB     (4)

其中 FB 是浮力。 Fg 其大小相等但方向与浮力相反，假设线虫的密度与水相同。因此，方程 4 可改写为如下形式：
FNy = FDy+F酪氨酸     (5)

FNy 在下降过程中保持不变。这意味着在蠕虫到达转向点之前，FDy + FTy 保持恒定。FDy 在路径顶端（即路径起点）时最大，并随着速度在转向点减小至零而逐渐减小至零，与此同时，FTy 必须相应增加以维持 FNy 的恒定。

转向点： 在转向点处，垂直方向上没有拖拽力，因为该点的垂直速度为零。垂直方向上作用的力仅有重力 -Fg、浮力 FB 以及线虫的垂直推进力 FTy，如图 6b所示。在此点，可确定 C. elegans 的推进力：
FTy = FNy (6)

轨迹底部的推力约为 0.33 pN，约为线虫体重的 0.001%。考虑到秀丽隐杆线虫（C. elegans）的估算体重 Fg 为 28 nN,

上升阶段： 同样，在上升过程中，阻力增大，但方向向下（图6c）：
FNy = -FDy+FTy(7)

蠕虫产生的推力现在必须更大，且等于阻力与重力之和。蠕虫在开始向上游动后速度正在减慢。若要以与下沉时相同的速度上浮，蠕虫必须施加至少为其体重两倍的向上推力。

悬停

一条蠕虫减缓其下降速度约3秒的示例展示于 图 7. A 3rd 二次多项式对整体路径具有合理的拟合度。由此拟合得到的加速度和速度误差均小于15%。线虫开始时具有显著的向上推力，随后减速，并在68秒时开始转向；然而，向上的加速度持续减小图 8) 直到净加速度在约 68.5 秒时等于零。这最终导致向下的净加速度，随后速度出现另一个零点（图9) 线虫在 69 秒时开始再次下降。

有趣的是，本案例中观测到的最大垂直加速度为 2.7 mm/sec2。在转向点处的加速度分别为 0.455 mm/sec2 和 -0.455 mm/sec2，大约是线虫转身后向上游动情况下的四倍。根据公式 6 估算，第一个转向点处的向上推力约为 1.32 pN。在第二个转向点处，净加速度为负值，因此向上推力为 1.32 pN。

Laser setup diagram: beam expander, cuvette; optical study, laser spectroscopy, photonic analysis.
图1. 实验装置示意图。 激光器、扩束镜、透镜和屏幕是实验装置的基本组成部分。导向镜和针孔可以省略，但会使光路准直的稳定性降低。

干涉图样，绿色激光，光学示意图，波前畸变，向上的箭头标记
图 2. 单波长阴影成像（SWSI）。 使用 2 mW 的 543 nm 激光光源，将线虫的阴影投射到屏幕上。图像经过倒置处理，使得线虫看起来呈向上运动。

线性回归分析图表；时间与垂直位移数据，含斜率和相关性插图
图3. 单个野生型 C. elegans 在水柱中的垂直下降运动。 该线虫由633 nm相干光照射成影。线性拟合的斜率表明其下沉速度为1.09 mm/sec ± 0.01 mm/sec。 请点击此处查看该图的高清版本。

振荡运动分析图；垂直位移与时间关系及曲线拟合方程。
图 4. 单条野生型上行游动秀丽线虫（C. elegans）的位移图。 两条样条拟合曲线描绘了线虫的整体运动轨迹。拟合曲线的二阶导数反映了加速度。最大加速度可由第一次拟合轻松确定：0.110 mm/sec2 ± 0.002 mm/sec2。仅显示少量误差棒，以便数据点和拟合曲线保持清晰可见。该线虫由633 nm相干光照射成像。请点击此处查看此图的高清版本。

垂直加速度与时间关系图；方程 a=0.11, a=-0.00708t+1.252；数据分析。
图5. 单个野生型 C. elegans 的加速度图。 该线虫维持着 0.110 mm/sec2 ± 0.002 mm/sec2 的恒定向上加速度，导致其速度减慢并随后向上运动。在转向点之后不久，加速度持续下降，净加速度逐渐减小至零。 请点击此处查看该图的放大版本。

静力平衡示意图，包含力矢量：ΣFy=0，分量 FNy、FTy、FDy。
图6. 下降、转向点和上升阶段的受力示意图。 浮力与重力大小相等、方向相反，因此二者的作用相互抵消，故在本图中未予显示。(a) 蠕虫向下运动，阻力与推力均向上；(b) 蠕虫处于运动轨迹的最低点，无阻力作用，推力向上；(c) 蠕虫向上运动，阻力向下，推力向上。

Vertical displacement vs. time; graph with curve fitting; data analysis; error bars; scientific plot.
图7. 单个悬浮线虫的位移图。 线虫在约68秒时减速并开始转向，但在约69秒时开始下降. 请点击此处以查看此图的放大版本。

竖直加速度与时间关系图，68.5秒时ay=0，用于运动分析研究。
图8. 单条悬浮线虫的加速度图。 该线虫初始向上加速度为2.7 mm/sec2，随后减小至零，最终产生向下的加速度，大小为-2.6 mm/sec2。请点击此处查看此图的高清版本。

抛物线运动图；68秒和69秒时vy=0；垂直速度随时间变化；抛射体分析。
图9. 单个悬浮线虫的速度图。 该线虫在68秒时停止运动，随后开始向上移动，速度减慢，并在69秒时垂直方向的速度降至零，之后开始下降。 请点击此处查看该图的高清版本。

垂直速度数据表；比较活体和死亡样本的平均值与方差。
表 1. N2 C. elegans 的平均下降速度。 在下降过程中追踪了 50 条活体和 50 条死亡的线虫。活体与死亡蠕虫下降的平均速度相同：1.5 mm/sec ± 0.1 mm/sec。

讨论

SWSI 技术为理解自由生活的线虫等微型生物的运动能力提供了另一种方法。利用该技术，我们能够区分主动运动（游泳）与因重力作用于死亡线虫而产生的被动漂移。此外，当自由游动的线虫在水中运动过程中改变方向时，我们能够测量作用于线虫以及线虫自身施加的阻力和角力。

线虫在土壤中会遇到不同的环境条件。土壤中存在水 pockets，以及具有不同形状和质地的固体颗粒与生物材料。此外，线虫所处的重力环境也会引发其行为响应14。 同时，靠近土壤表层的线虫还会暴露于不同波长的光、温度与湿度变化，以及细菌、捕食性真菌和其他土壤生物等生物变量。线虫必须对所有这些不同变量作出响应，在不同介质中游动和爬行，转弯并调整导航策略。所有这些复杂的计算仅由302个神经元完成，其中一部分神经元参与运动调控，另有95个体壁肌细胞参与执行。SWSI技术所描述的这类测量为理解线虫如何实现如此复杂的导航行为提供了重要见解。

在第一部分中，我们测量了野生型 C. elegans 在 633 nm 光照下的整体下沉速率。利用这些测量数据，我们可以估算线虫所受到的阻力。

在加速线虫的案例研究中，由于阻力随速度变化，所涉及的力也在持续改变。我们能够对作用于该线虫的力做出一些判断。当线虫减速并试图向上游动时，阻力的垂直分量逐渐减小，直至在线虫运动轨迹的最低点减小到零。此时，线虫必须具有 一个向上的力才能向上游动。

该方法可通过多种方式加以改进。任何在透明液体中移动的微观物种均可利用SWSI进行追踪。研究可采用数码相机可检测的任意波长进行。数码相机通常可捕获从紫外到近红外范围的波长。此外，通过将激光束垂直向上引导，可开展水平方向的研究。此时可将待测物种置于水平透明表面（如显微镜载玻片）上。调节扩束镜或扩束镜后的放大透镜，可使模糊图像变得清晰。使用者应确保将所有组件牢固固定于实验台上，以保证光束准直的一致性和便捷性。

该方法受限于可用的激光波长和分辨率。本质上，此方法相较于现有显微镜的优势——即方向和波长的灵活性——同时也是其弱点，因为装置结构较为简单。简化的光学系统以及激光的散斑效应限制了分辨率。其中一些缺点未来完全可以通过引入空间滤波器并将图像直接投射到CCD相机上加以改进。

该实验方案中最关键的步骤可在首次进行实验时轻松掌握。将线虫放入比色皿时，避免产生湍流至关重要。此外，振动可能干扰实验装置并改变线虫的行为。务必限制用于投影成像的光功率，直径为1 mm的激光束最大功率不应超过2 mW，以避免热效应。当使用蒸馏水以外的液体时，应检测装置是否存在散射效应。

目前大多数显微镜在水平平面上运行，使用白光或彩色滤光片，其波长范围仍然较宽。真正采用单一波长且在观察方式上具有灵活性的显微镜， 即 水平放置的显微镜通常只能具备其中一种优势，且这类显微镜通常价格昂贵，仍然局限于焦平面成像，而我们的方法则不受此限制。我们的装置可以用极低的预算轻松搭建，适合资金有限的学校、环境公司及其他机构直接使用。未来，该方法可用于高度精密的实验系统，以研究微观物种运动行为和机械感知的实时效应。该方法可方便地实现宽角度和不同观察深度下的单波长研究。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢瓦萨学院本科生研究暑期研究所（URSI）、露西·梅纳德·萨蒙研究基金、美国国家航空航天局（NASA）资助编号NX09AU90A、美国国家科学基金会科学与技术研究中心（NSF-CREST）资助编号0630388以及美国国家科学基金会（NSF）资助编号1058385的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
可调谐氦氖激光器 Research Electro-Optics30602可在 543 nm 至 633 nm 之间选择四种波长。
2 个前表面铝镜ThorlabsPF10-03-F01
高速 Exilim 相机Casio
石英比色皿Starna Cells21/G/5
LoggerPro（软件）Vernierhttp://www.vernier.com/products/software/lp/
Mathematica 8Wolframhttp://www.wolfram.com/
5倍至10倍可变变焦伽利略式扩束镜ThorlabsBE05-10-A
焦距为 75 mm 的平凸透镜ThorlabsLA1257

参考文献

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