用于评估生物材料血管化的全层皮肤缺损模型 体内

摘要

血管化是实现成功组织工程的关键因素。因此，需要可靠的技术来评估组织构建物中血管网络的形成。本文介绍了一种简单且经济有效的方法，用于可视化并定量分析血管化 体内.

摘要

血管化不足被认为是限制组织工程构建物临床成功的主要因素之一。为了评估旨在改善血管化的新策略，需要可靠的方法来直观显示新生血管向生物人工支架内的长入情况，并对结果进行量化。在过去的几年中，我们课题组建立了一种全层皮肤缺损模型，该模型可通过透射 illumination 直接观察血管，并通过数字分割实现量化分析。在此模型中，通过手术在小鼠背部制造全层皮肤缺损，并用待测材料进行替代。也可将感兴趣的分子或细胞整合入这些材料中，以研究其潜在效应。经过自行设定的观察时间后，将材料取出进行评估。双侧伤口设计使得可在同一个体内部进行比较，从而最小化个体间差异带来的干扰，并减少实验所需动物数量。与其他方法相比，我们的方法具有操作简便、结果可靠且成本较低的优势。我们已将该模型作为常规工具，用于在测试不同生物材料及生物活化策略的血管化效果时进行高分辨率筛选。

引言

近年来，组织工程为利用机体自身细胞替代组织缺损开辟了一种新的治疗选择¹。为了支持组织再生的生理过程，支架被设计成一种可生物降解的结构，为创面床来源的细胞提供生长并修复缺损的微环境^2,3。

血管化不足被认为是阻碍生物人工支架实现临床突破的主要障碍⁴。随着细胞的长入，对营养物质和氧气的需求增加，材料的血管化变得至关重要。因此，血管化不足或延迟可导致组织工程产品的中心坏死⁵。此外，血管可提供具有免疫功能的细胞，并清除再生区域的代谢废物。在组织工程中观察到的高感染率和低再生能力等后果，正是由于血流灌注不足所致，而通过增强支架的血管化有望避免这些问题^6,7。

多种旨在改善血管化的策略聚焦于生物材料本身及其支架微结构的关键作用。目前正积极开展研究，致力于将愈合过程从修复转变为再生，从而（重新）生成具有最接近生理特性的组织以替代待恢复的组织^8,9。已被研究和评估其再生潜力的生物材料包括胶原蛋白、纤维蛋白、壳聚糖和海藻酸盐^10,11。这些生物材料可作为构建新型支架的骨架，并可通过不同的策略进行使用和组合，例如组织脱细胞化、自组装、快速成型和静电纺丝¹²。为了增强机体自身的再生能力，可对支架进行生物活化。已有研究表明，引入重组促血管生成生长因子¹³或编码此类因子的基因载体¹⁴可改善支架的血管化。干细胞的使用已被广泛证明是改善血管化的一种有前景的策略，其中间充质基质细胞和内皮祖细胞受到最多关注^15,16。其他方法则尝试在移植前构建包含预制血管网络的结构¹⁷。尽管在支架设计及其生物活化方面已投入大量努力，但尚无任何策略能在临床显著水平上改善血管化；除大面积烧伤中的皮肤替代物外，生物工程材料向临床常规应用的转化仍进展缓慢¹⁸。

人工组织构建物血管化之所以仍是一个未解决的问题，其原因之一在于评估新技术成功与否的困难性 体内 方法。尽管 体外 实验可为支架的血管化潜力提供重要见解，但需要适当的动物模型来研究一些关键参数，例如材料的生物相容性、治疗的安全性和有效性，以及尤为重要的组织构建物的血管化情况。因此，需要可靠的工具来可视化并量化血管网络 体内 至关重要。

本研究介绍了一种简单且可靠的方法，可用于可视化并量化移植后支架内部的血管网络。该方法基于组织透射照明和数字分割技术。由于该方法具有非侵入性，因此可对目标材料进行后续的分子和组织学分析。

方案

1. 支架的制备

1. 使用 12 mm 活检打孔器制备支架样品。
2. 为了将生物活性分子或细胞引入支架中，先用无菌纱布轻轻挤压支架以去除其中液体，随后加入含有目标生物活性分子或细胞的 160 µl 溶液，使支架重新水化。可通过代谢检测（如 MTT 检测）验证细胞生物活化的成功与否。
3. 如有必要，可通过再次水化（如步骤 1.2 所述）将待测化合物或细胞固定在支架内部，例如将其置于纤维蛋白-凝血酶溶液或水凝胶中进行递送。
   注意：当化合物或细胞无法通过机械方式附着于材料时，此步骤尤为有用。此外，还可调控化合物的释放动力学。
4. 准备钛化网格，用于每个实验组和对照组中放置于支架下方，将其裁剪为直径约 14 mm 的圆形片状。
   注意：钛化网格可作为物理边界，用于将再生组织与创面床分隔开来。

2. 动物

1. 在实施本模型之前，须咨询相应的动物保护法律法规，并获得当地主管部门的许可。本研究中所有实验均根据现行的德国动物福利法进行，并已获得上巴伐利亚行政区政府（Regierung von Oberbayern）的批准。
2. 谨慎选择实验动物及其品系。尽管该模型是针对小鼠建立的，但也可推广至其他常用动物，如大鼠、兔或猪。
3. 若使用带毛动物，应在植入支架前将其背部毛发剃除。
   注意：本研究使用6至8周龄、体重在20 g至25 g之间的小鼠，但也可使用不同年龄和体重的动物。

3. 麻醉

1. 在无菌条件下进行操作。为维持动物的正常体温，使用加热垫。
2. 在实施吸入麻醉前，动物需每8小时皮下注射一次布托啡诺（Buprenorphin），剂量为0.05–0.1 mg/kg体重。
3. 将动物置于吸入麻醉（异氟烷，Isoflurane）下，或采用等效的标准操作程序。通过轻捏动物脚趾或皮肤夹捏法确认麻醉效果。
4. 为防止脱水，在手术开始时皮下注射0.5 ml生理盐水溶液。

4. 皮肤切除

1. 将动物置于俯卧位，并用细头永久性记号笔在小鼠背部标记中线（图 1A）。
2. 确定切除区域。将缺损部位置于图1C所示区域。注意，若缺损位置过于靠尾侧，动物更容易移除敷料和支架。
3. 使用10 mm活检打孔器创建双侧圆形缺损（图 1B）。应小心地将打孔器压向皮肤，但不可完全穿透皮肤切割，仅用于界定切除区域（图 1C & 1E）。
4. 用镊子轻轻提起已标记的皮肤，并沿标记的圆周使用精细手术剪进行切开（图 1F）。如出现出血，需用无菌纱布小心压迫止血。图1展示了切除操作的逐步示意图。
   注意：缺损所用打孔器直径应小于制备支架所用的打孔器，以补偿因皮肤弹性导致的缺损扩大。

5. 支架植入

1. 为了给钛化网膜留出空间，将伤口边缘处皮肤与下方组织分离的范围扩大 2-4 mm（图 2A）。
2. 将钛化网膜直接置于创面床面上，并置于伤口边缘下方（图 2A & B）。
3. 将支架材料直接覆盖在网膜上方。
4. 使用 4 至 6 个单结将支架缝合至邻近的伤口边缘，使边缘略微覆盖支架（图 2C）。
   注意：避免使用可降解缝线。
5. 在创面上方缝合透明伤口敷料，以保护支架并便于观察伤口区域（图 2D）。

6. 术后护理

1. 每笼饲养一只小鼠，以防止小鼠之间相互触碰敷料和支架。
2. 通过观察小鼠的运动活动、体重、疼痛迹象、对敷料的耐受性以及自残行为，每日评估动物的一般状态。同时监测伤口区域是否有出血、局部或全身感染迹象以及敷料的位置。
3. 为尽量减轻动物疼痛，每日注射布托啡诺（Buprenorphin），剂量为0.05–0.1 mg/kg体重，或等效镇痛药物。
4. 若小鼠移除或损坏伤口敷料，需在麻醉下更换或重新固定敷料。

7. 处死动物与支架的取出

1. 在预定的时间点，通过注射过量戊巴比妥（150 mg/kg）处死动物。
2. 使用永久性记号笔标记皮肤切除部位，应包含支架以及尽可能多的小鼠背部皮肤（图 3A）。
3. 用剪刀或手术刀沿标记线切开皮肤。通过钝性分离将整块皮肤（包括支架和钛化网片）从下方组织上完整剥离（图 3B）。
4. 将取出的组织展平后置于培养皿中（图 3C 和 D）

8. 血管网络的可视化与定量分析

1. 透射照明：
   1. 通过将培养皿置于强白光光源（100瓦标准灯泡）上方，搭建透射照明装置。
   2. 在透射照明仪上方固定一台数码相机，用于获取数字图像。
   3. 将样品倒置放置于透射照明装置上的培养皿中。
   4. 以宏观模式拍摄完整支架的图像，同时拍摄与正常皮肤相同大小区域的图像。将图像以TIFF格式保存，用于后续数字分析。
   5. 保存组织样本，用于进一步的生物化学或组织学分析。
2. 数字分割与定量分析：
   1. 下载并安装VesSeg-Tool软件，该软件可免费获取，网址为：http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255。
   2. 使用VesSeg-Tool软件打开图像。
   3. 选择图像中支架所覆盖的区域，用于数字分析（图像→选择）。
   4. 为增强血管对比度，使用“滞后阈值化”选项（图像→血管增强滤波器→滞后阈值化→顶帽变换→计算血管增强）。
   5. 继续进行血管图的分割（图像→血管增强滤波器→滞后阈值化→阈值边界）。选择第一个阈值（“血管覆盖率”），使任何具有血管特征的像素均被标记为血管；选择第二个阈值（“背景覆盖率”），仅将明显具有血管特征的像素标记为血管。
   6. 手动检查自动分割结果，补充未被识别的血管，并剔除常见的假阳性结构，这些结构通常为细长的类血管结构，如毛发或缝线。
   7. 计算血管总长度及血管覆盖的总面积（图像→图像统计→二值图像统计）。
      注：在计算血管长度时，所得血管图中的血管会被细化为宽度为一个像素的线条²⁰。
3. 以与支架相同的参数分析原生皮肤区域，将原生组织的值设为100%，并将支架的数值相对于该值进行比较。例如，若正常组织中白色像素占比为60%，而支架中为30%，则表示支架的血管化程度为50%。注意：白色血管覆盖面积是相对于支架周围方形区域计算的。在计算白色像素覆盖比例时，需考虑圆形面积（π × R²）明显小于方形面积（4 × R²）这一因素。

结果

可在小鼠体内创建可靠的双侧全层皮肤缺损模型（图 1），用于研究待测生物材料对皮肤的替代效果（图 2）。在此模型中，手术过程及术后均未观察到明显并发症，无肉眼可见的感染迹象或异物反应。极少数情况下，小鼠会自行移除植入的支架材料。从未观察到伤口收缩现象（图 3）。通过组织透射成像技术，可在包含正常组织与植入支架的整体组织样本中，清晰显示宽度达 30 μm 的血管结构（图 4）。经数字分割后，可在植入后的特定时间点对血管进行简便定量分析。例如，植入后 2 周观察到的血管化水平为 62.28 ± 8.6%（均值 ± 均值标准误；n=8）²¹。总体而言，每只动物（植入 2 个支架）的手术操作约需 25 分钟，组织取材与成像需 5 分钟，单个样本的数字分析需 10 分钟。最后，该方法不会影响后续对移出组织的质量分析。例如，可通过常规方法从样本中轻松提取蛋白质和 RNA。

讨论

有必要建立有效的方法来改善组织工程构建物中的血液灌注，这就要求开发新的可靠方法以研究生物材料内部的血管化过程。目前使支架血管化在ex vivo条件下可视化的常用方法包括显微镜技术，该技术可提供高分辨率的成像工具。然而在大多数情况下，该方法仅限于分析小面积的组织，且往往成本高昂、耗时较长。此外，该方法通常需要复杂的标记和染色步骤，难以区分有血液灌注的功能性血管与无功能的血管²²。用于评估血管功能性的现有方法包括计算机断层扫描、磁共振成像和正电子发射断层扫描，但这些方法存在设备极其昂贵且分辨率较低的缺点²³。另一种常用的可视化血管化策略是使用血管铸型后结合组织化学腐蚀法²⁴。该方法能够获得血管网络的代表性三维结构，但结果受人工灌注水平的影响较大，且组织无法用于后续的生化研究，例如蛋白质或RNA分析。鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）模型²⁵以及啮齿类动物的皮肤折叠腔模型^26,27已被证明是分析血管生成、毛细血管灌注和血流的有效方法。最近，皮肤折叠腔模型还被用于组织工程研究，以评估基于间充质干细胞（MSC）的血管化策略在多孔聚...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ethilon P-3 13 mm 3/8 圆形 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon 聚酰胺-6 精密圆针反向切割缝合线
活检打孔器（10 mm）	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
活检打孔器（12 mm）	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
数码相机	Ricoh, Hannover, Germany	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	无菌纱布（10 cm × 10 cm）
双层胶原基支架（8' × 10'）	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
异氟烷，用于吸入麻醉的液态-气态制剂	Baxter, Unterschleissheim, Germany	100196040
戊巴比妥钠，16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu 裸鼠，CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	品系编号 088	无胸腺裸鼠，6 至 8 周龄，体重介于 20 至 25 g 之间
布托啡诺（0.3 mg/ml）	Essex Pharma GmbH, Munich, Germany
钛化网片（15 cm × 15 cm），超轻型	PFM Medical AG, Köln, Germany	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany	B1332020110614	纤维蛋白-凝血酶溶液
透明粘性手术铺巾（30.5 cm × 26 cm）	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10